Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu jednocząsteczkowych biosensorów

W tym artykule wideo opisano, jak zbudować niestandardowy system obrazowania progów fluorescencyjnych epi z dostępnych na rynku komponentów i pokazano, jak go używać do monitorowania w czasie rzeczywistym wewnątrzkomórkowego cyklicznego MP w nienaruszonych komórkach. Po pierwsze, szczegółowo opisana jest procedura montażu obrazowania progów krok po kroku. Następnie wyświetlany jest proces instalacji i konfiguracji oprogramowania po całkowitym skonfigurowaniu systemu.

Jego zastosowanie w pomiarze cykliczności wewnątrzkomórkowej. Wykazano, że poziomy MP w transfekowanych komórkach Dane uzyskane za pomocą tego systemu wykazują jego przydatność w monitorowaniu wewnątrzkomórkowej cyklicznej dynamiki MP A poprzez pomiar stosunków progów. Główną zaletą tej techniki jest to, że można wizualizować zdarzenia biochemiczne przekaźników SEC lub interakcje białek z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową w nienaruszonych komórkach i tkankach.

Nie jest to możliwe w przypadku istniejących metod biochemicznych, takich jak ELIZA lub radiotesty immunologiczne. Używamy tej metody, aby uzyskać wgląd w cykliczną dynamikę nukleotydów, ale można ją łatwo zastosować w innych systemach za pomocą bioczujników fret. Te biosensory mogą być wyrażane w liniach komórkowych lub komórkach i tkankach myszy transgenicznych w celu badania mechanizmów wewnątrzkomórkowych w bardziej fizjologicznym kontekście.

A teraz pokażemy Ci, jak skonfigurować system progów i jak go używać do prostych eksperymentów obrazowych. Zasadniczo każdy odwrócony mikroskop fluorescencyjny, który ma port kamery, może być przystosowany do obrazowania progów. Ostateczna konfiguracja powinna zawierać następujące kluczowe elementy: mikroskop, źródło światła z dodatkową migawką lub bez, rozdzielacz wiązki do emisji światła oraz kamerę CCD.

Urządzenia sprzętowe, w tym źródło światła, migawka i kamera, są zintegrowane i sterowane przez oprogramowanie do obrazowania, które umożliwia akwizycję i analizę obrazu. Rozpocznij konfigurację od podłączenia źródła światła do mikroskopu. Na przykład użyj diody elektroluminescencyjnej o pojedynczej długości fali, która selektywnie wzbudza wzmocnione cyjanowe białko fluorescencyjne, które jest używane jako donor w większości bioczujników fret.

Umieść odpowiednią kostkę filtracyjną w mikroskopie w celu rutynowych pomiarów progów za pomocą CFP i ulepszonego YFP lub dowolnego z ich wariantów jako pary progów. Użyj prostej kostki filtracyjnej zawierającej filtr wzbudzenia ET 4 36 30 M i zwierciadło dichroiczne A-D-C-L-P 4 5 5. Następnie podłącz rozdzielacz wiązki za pomocą mocowania CM do jednego z portów emisyjnych mikroskopu.

Na przykład użyj podwójnego widoku DV two z fotometrii, który rozdziela światło emisyjne na kanały donorowe i akceptorowe, które mogą być jednocześnie monitorowane na jednym chipie kamery CCD. Podłącz kamerę CCD do rozdzielacza wiązki. Użyj z przewodem przeciwpożarowym, aby podłączyć kamerę do interfejsu komputera IEEE 1394 bez włączania kamery.

Zainstaluj sterowniki aparatu z płyty CD z oprogramowaniem, aby nawiązać komunikację między komputerem a źródłem światła. Użyj BNC, aby podłączyć płytkę wejściową wyjściową Arduino do diody LED. Na koniec podłącz zmontowaną płytkę do komputera przez USB.

Teraz, gdy sprzęt został skonfigurowany, należy zainstalować i skonfigurować oprogramowanie do obrazowania w tym miejscu. Używany jest darmowy program micromanager o otwartym kodzie źródłowym w wersji 1.4 0.5. To oprogramowanie oferuje wysoki stopień elastyczności dla taniego obrazowania i można je pobrać ze strony pokazanej tutaj.

Następnie pobierz oprogramowanie do sterowania płytką Arduino z Internetu. Postępuj zgodnie z instrukcjami znajdującymi się na tej stronie i uruchom to oprogramowanie tylko raz przed uruchomieniem micromanagera. Teraz pobierz kod źródłowy oprogramowania filmowego do korzystania z płytki z oprogramowaniem micromanager ze strony internetowej pokazanej na ekranie.

Następnie wgraj go na płytkę po zainstalowaniu oprogramowania i zainicjowaniu przełącznika na diodę LED i kamerę. Uruchom oprogramowanie i skonfiguruj komunikację mikromenedżera z kamerą i diodą LED, wybierając narzędzia. Następnie kreator konfiguracji sprzętu.

W oprogramowaniu dodaj wymagane komponenty, w tym kamerę, płytkę Arduino, przełącznik Arduino, koncentrator Arduino i urządzenia migawkowe Arduino. W kolejnych krokach użyj ustawienia domyślnego sugerowanego przez kreatora, zapisz nową konfigurację systemu. Po wyświetleniu monitu przez kreatora użyj menu głównego, aby otworzyć narzędzia.

Następnie przeglądarka właściwości urządzenia. Przewiń w dół do Arduino. Przełącz stan i wybierz jeden.

Zamknij okno dialogowe. Upewnij się, że pole automatycznej migawki jest zaznaczone w głównym oknie dialogowym oprogramowania. Naciśnij plik.

Następnie zapisz stan systemu, aby zapisać konfigurację oprogramowania, którą można otworzyć w dowolnym momencie po uruchomieniu oprogramowania. Spowoduje to nawiązanie komunikacji między płytką a oprogramowaniem potrzebnym do przeprowadzenia akwizycji obrazu. Następnie naciśnij przycisk na żywo, aby monitorować sygnał dochodzący z kamery.

Upewnij się, że światło fluorescencyjne włącza się za każdym razem, gdy wybrana jest funkcja na żywo lub przyciągania. Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Następnie, aby załadować wcześniej zdefiniowaną konfigurację systemu należy wybrać plik, następnie wybrać załadować stan systemu i wybrać nazwę wcześniej zapisanego pliku konfiguracyjnego.

Następnie, za pomocą kleszczy, ostrożnie zamontuj szkiełko nakrywkowe z przylegającym non COFLUENT cyklicznym czujnikiem MP TRANSFECTED 2 9 3 A komórki do komory obrazowania. Za pomocą pipety przepłucz komórki jednorazowo 400 mikrolitrami buforu progowego. Następnie dodaj 400 mikrolitrów buforu progów.

Nałóż kroplę olejku immersyjnego na obiektyw i przenieś komorę obrazowania do mikroskopu. Skoncentruj się na warstwie komórki za pomocą światła trans illumination Włącz światło fluorescencyjne, naciskając przycisk na żywo i wybierz komórkę. Do eksperymentu.

Wybierz ogniwo o optymalnym wyrazie czujnika, co oznacza, że nie powinno być ani zbyt jasne, ani zbyt ciemne. Po znalezieniu odpowiedniej komórki natychmiast wyłącz światło fluorescencyjne, aby uniknąć fotoblakowania czujnika progów. W ustawieniach aparatu ustaw czas ekspozycji na 10 do 50 milisekund i naciśnij przycisk przyciągania, aby zrobić zdjęcie, sprawdź stosunek sygnału do szumu i dostosuj czas ekspozycji zgodnie z potrzebami, aby uzyskać obraz o dobrym stosunku sygnału do szumu.

Dwa długie czasy wzbudzenia mogą spowodować fotowybielanie, podczas gdy dwa krótkie czasy powodują niską jakość obrazu. Naciśnij przycisk akwizycji multi D i ustaw liczbę punktów czasowych oraz przedział czasu akwizycji obrazu. W przypadku tej cykliczności czujnik progów MP jeden obraz będzie rejestrowany co pięć sekund.

Rozpocznij pomiary, naciskając przycisk pobierania podczas pomiaru, aby monitorować zmiany współczynnika progów. Uruchom wtyczkę fret online, wybierając wtyczki. Następnie uruchom zajęcia online w menu oprogramowania Image J.

Następnie, korzystając z narzędzia do zaznaczania odręcznego, wybierz obszar zainteresowania na obrazie proporcji progów i dodaj go do menedżera ROI. W oknie analizatora szeregów czasowych naciśnij przycisk Pobierz średnią. Ślad stosunku progów zostanie wyświetlony w celu zaktualizowania śladu podczas pomiaru.

Uruchom współczynnik progów online do wtyczki i naciśnij przycisk pobierz średnią, gdy tylko stosunek progów osiągnie stabilny podstawowy roztwór izoproterenolu do pipety do komory i poczekaj na nadejście sygnału. Następnie, tuż po osiągnięciu nowej stabilnej linii podstawowej, dodaj roztwór propanololu. Po zakończeniu eksperymentu zapisz stos obrazów poklatkowych.

Wyjmij komorę pomiarową z mikroskopu i wyczyść obiektyw za pomocą tkanki obiektywu po zebraniu wszystkich danych. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w dokumencie towarzyszącym w celu analizy. System progów zmontowany w sposób opisany w tym filmie został wykorzystany do monitorowania cyklicznych poziomów A MP w odpowiedzi na agonistów i antagonistów receptorów beta-adrenergicznych.

W cyklicznym czujniku A MP TRANSFECTED 2 9 3 A komórkach, jak widać tutaj, stosunek progów wykazał stabilną linię wyjściową do momentu dodania agonisty receptora beta adrenergicznego izoproterenolu. W klatce numer 30 po aplikacji nastąpił powolny spadek monitorowanego współczynnika progów, co wskazuje na wzrost wewnątrzkomórkowego cyklicznego A MP. Gdy beta-bloker propanolol został dodany w klatce numer 60, sygnał izoproterenolu został odwrócony, a cykliczne poziomy MP A spadły do poziomów podstawowych, aby uzyskać skorygowany ślad współczynnika progów, dane analizowano w trybie offline i skorygowano krwawienie CFP do kanału YFP. Jak można zobaczyć tutaj.

Skorygowany ślad stosunku progów pokazuje większą amplitudę sygnału progu, co odzwierciedla rzeczywistą odpowiedź progu. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza Western blot lub testy funkcjonalne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące aktywności dalszych szlaków sygnałowych i odpowiedzi komórkowej na czynniki stymulujące CAMP. Opracowanie tej techniki utorowało drogę naukowcom zajmującym się biologią komórkową do zbadania dynamiki w czasie rzeczywistym przekaźników, takich jak C-A-M-P-C-G-M-P, czyli wapnia w nienaruszonych komórkach lub tkankach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł, jak zbudować prosty system obrazowania tłuszczu i jak kontrolować go za pomocą oprogramowania do przeprowadzania eksperymentów.