Ekspansja embrionalnych i dorosłych nerwowych komórek macierzystych za pomocą elektroporacji in utero lub stereotaktycznej iniekcji wirusa

Cześć, nazywam się Federico K i jestem liderem grupy w Centrum Terapii Regeneracyjnych w Dreźnie w Niemczech. W poniższym filmie chcielibyśmy pokazać Państwu niektóre z technik, które stosowaliśmy w naszym laboratorium w poprzednich latach do kontrolowania przejścia komórek neuromacierzystych ssaków od proliferacji do różnicowania i neurogenezy. W szczególności odkryliśmy, że gdy nadekspresja kinazy zależnej od cyklu dla cyklicznego kompleksu D, możemy skłonić komórkę macierzystą do skrócenia mutacji G, a w tym czasie komórki ulegną podziałowi proliferacyjnemu, zwiększając swoją populację zamiast neurogenezy.

Co ciekawe, po wykonaniu tej manipulacji, przejściowo i cyklicznie CDK wraca do fizjologicznego poziomu ekspresji. Ta rozszerzona pula komórek macierzystych może przełączyć się w fizjologiczną neurogenezę. W wyniku ich ekspansji komórki będą wytwarzać więcej minerałów i odkryliśmy, że zasada ta ma zastosowanie zarówno podczas embrionalnego rozwoju kory mózgowej myszy, jak i w dorosłym hipokampie.

W następnym klipie wideo Christian Lange pokaże Ci, jak ta manipulacja może być wykonana w rozwijających się embrionach myszy poprzez elektroporację. W drugiej części naszego filmu Beja użyje koncepcyjnie podobnej techniki, ale w dorosłym mózgu, a konkretnie w hipokampie, wykonując stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa. Mam więc nadzieję, że ta technika i ten rodzaj manipulacji mogą być przydatne również w waszych badaniach w waszych laboratoriach i mam nadzieję, że ten film przypadnie Wam do gustu.

Cześć, nazywam się Christian Langer i dzisiaj pokażę Wam ekspansję komórek macierzystych nerwic w rozwijającej się korze myszy. Poprzez neutralną eksplorację CDK i rowerów. Ciężarna matka zostaje poddana anodyzacji i umieszczona na podgrzewanym stole operacyjnym.

Tam, gdy przepływająca para jest nakładana za pomocą maski oddechowej, używamy jej jako przepływu, ponieważ jej ciągłe podawanie pozwala na precyzyjne i elastyczne synchronizowanie działania magnesu. Aby rozpocząć operację, ostrożnie ogoliłem brzuch myszy. Ogolony obszar jest dezynfekowany roztworem jodu po zabiegu i gia.

Wstrzykuję podskórnie 100 mikrolitrów roztworu tega ingu. Do iniekcji DNA użyłem wyciąganej kapilary wypełnionej DNA osocza uzupełnionego D. Zamknięty końców kapilary przeciąłem za pomocą trzech s.

Wszystkie narzędzia zostały wysterylizowane termicznie, aby otworzyć brzuch ciężarnej matki. Wykonuję podłużne cięcie na linii środkowej skóry brzucha za pomocą nożyczek. Wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały zdezynfekowane w szklanym sterylizatorze termicznym.

Z naszego doświadczenia wynika, że wystarczy utrzymywać narzędzia na platformie operacyjnej w stanie sterylnym, aby uniknąć infekcji bakteryjnych. Otrzewną przecina się analogicznie do leżącej nad nią skóry brzucha, wykonując podłużne nacięcie w linii środkowej, które otwiera jamę ciała. Wnękę zwilża się roztworem do elektroporacji.

PBS uzupełniony paskiem do wstrzykiwacza na tę infekcję i w celu ułatwienia ekstrakcji macicy. Po wykonaniu lipektomii zakryłam brzuch sterylnym obłożeniem chirurgicznym. Za pomocą retraktora zbiornika otwieram jamę ciała i ostrożnie chwytam macicę między dwoma ce, aby delikatnie wyciągnąć oba rogi macicy z jamy ciała.

Do operacji używam ciężarnej myszy w Emry A 14. W tym wieku zarodki są wyraźnie widoczne w macicy, a operację można przeprowadzić bez użycia mikroskopu. Bardzo ważne dla przeżycia zarodków jest utrzymanie macicy pokrytej roztworem do elektroporacji przez cały czas trwania operacji.

W celu wstrzyknięcia DNA w kratę ostrożnie chwyć jedną ręką jedno żółtko, aby manipulować zarodkiem w środku. W taki sposób, że widzę półkule głowowe, moje palce przytrzymują woreczek tak, aby zarodek w środku nie mógł się odsunąć od siły igły i wstrzykuję przez ścianę macicy do jednej półkuli, aż komora zostanie obrysowana na niebiesko przez kolorowy roztwór DNA. Po wstrzyknięciu macicę ponownie zwilża się roztworem do elektroporacji i umieszcza elektrody.

Konieczne jest umieszczenie bieguna pla elektrody na macicy nad wstrzykniętą półkulą, a następnie rozpoczynamy pozycje elektryczne za pomocą przełącznika nożnego. Elektrody są przechowywane w PVS podczas operacji w celu zmycia soli, które tworzą się w kontakcie. Podczas operacji elektrycznej macica jest ponownie nawilżana i kontynuują z następnym zarodkiem.

Kiedy wszystkie zarodki są operowane elektrycznie, ponownie używam retraktora, aby otworzyć nacięcie w jamie ciała, aby bardzo ostrożnie umieścić zarodki z powrotem w środku, używam kranów lub, jeśli to konieczne, palców, aby wprowadzić macicę do środka. Aby zamknąć ranę. Zaczynam od zdjęcia obłożenia chirurgicznego.

Używam szwów chirurgicznych do zamknięcia cięcia. W otrzewnej przeciągam sążeń. Obróciłem koniec igły sążnia dwa razy wokół kleszczy, chwyciłem drugi koniec i pociągnąłem, aby wykonać węzeł chirurgiczny.

Wskazane jest, aby bardzo mocno zaciągnąć węzeł, a następnie końce są cięte nożyczkami. Ta technika jest wykonywana co kilka milimetrów, aż nacięcie w otrzewnej zostanie całkowicie zamknięte. Nacięcie w skórze brzucha zostaje zamknięte.

Za pomocą zacisków chirurgicznych używam kleszczy, aby utworzyć pętlę w skórze, która jest następnie zaciskana razem. Za pomocą tego aplikatora zaciskowego operacja jest zakończona, a zwierzę można usunąć z maski żałobnej, aby się obudzić i wyzdrowieć. W ciągu pięciu do 10 minut zwierzę budzi się na platformie operacyjnej i może zostać przeniesione do klatki domowej.

Dzień po operacji ciężarna samica zostaje złożona w ofierze, a zarodki pomyślnie pobrane. Zarodki elektryczne są identyfikowane pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Ekspresja fluorescencyjnych reporterów w ich przodomózgowiu pokazana tutaj na wypreparowanym mózgu, przekrój w pełni elektroporowanej kory dokonała przeglądu początkowo docelowych komórek radiowych ggl w strefie komorowej i ich zróżnicowanego potomstwa, podstawnych komórek progenitorowych w strefie podkomorowej i neuronów w strefie pośredniej i płytce korowej.

W ten sposób różnicowanie elektrokomórek można określić przez kwantyfikację komórek fluorescencyjnych w tych różnych strefach kory lub przez barwienie specyficznymi markerami dla przezroczystych radiowo komórek progenitorowych VA i neuronów. Hej, mam na imię Ani. Dzisiaj przygotujemy kilka antywirusów HIV, a później pokażę Ci, jak wstrzyknąć je do mózgu głośnej myszy.

Posialiśmy pięć na 10 do sześciu do dziewięciu trzech limfocytów T w każdej 10-centymetrowej czaszy, w sumie 15 szalek, używając zapotrzebowania uzupełnionego 10% FCS i antybiotykami. Dzień drugi to transmisja. Przede wszystkim zamierzamy przygotować roztwór DNA.

Mamy trzy różne plazmidy. Jeden jest aktualny dla białka DSPG, drugi dla białek GPU, a ostatni dla naszych funkcjonalnych genów, a więc drugi i CDK cztery. W tym przypadku przygotowujemy masywną mieszankę trzech plazmidów, aby dodać ją do zwykłych pożywek DN.

Gdy to zrobisz, mieszamy roztwór DNA. Następnie przygotowujemy rozwiązanie PI. Roztwór PI jest dodawany do roztworu DA.

Jest mieszany i inkubowany przez około 1530 minut w jednej roślinie. W międzyczasie wymieniamy media z naszych płyt na świeże opakowania zawierające 15% FCS, aby uzyskać końcowe stężenie 10% FCS. Po dodaniu mieszanki transformacji, dodajemy do ML na danie mieszanki transformacji.

Delikatnie mieszamy, a później wnosimy komórki do Cupry na noc. Trzeciego dnia traktujemy komórki maślanem komórek, aby zmniejszyć ekspresję promotora CMD. Najpierw dodajemy maślan komórek do wszystkich potraw.

Wysiadujemy je przez sześć, osiem godzin w temperaturze 37 stopni, a potem zmienimy pożywkę. Dzień czwarty jest ostatnim dniem naszych przygotowań. Zbieramy pożywkę ze wszystkich naczyń, a następnie, aby pozbyć się resztek komórek, filtrujemy ją.

Po zebraniu i przefiltrowaniu mediów ze wszystkich płytek, które przenosimy w probówce, ważne jest, aby dokładnie zrównoważyć probówki ultrawirówki przed przystąpieniem do ultrawirowania, a następnie ultra cent pobieramy próbki na koniec ultrawirowania. Ostrożnie wyjmujemy nasze próbki i naprawdę ostrożnie wyrzucamy, paleta jest ledwo widoczna i wygląda jak cień na dnie tuby. Myjemy paletę PBS, a następnie inkubujemy lód przez godzinę.

Następuje zawieszone podniebienie, przenosi te mniejsze probówki i ponownie ultrawiruje, paleta wirusów jest zawieszana w 50 mikronach PBS i likwidowana. Usta zostały znieczulone, jak już opisano. Za pomocą kleszczy otwieramy usta i mocujemy je na podniebiennej części ramy stereotaktycznej.

Następnie naprawiamy głowę za pomocą prętów i podawany jest Al. Jak już pokazano. Krem nakładamy na lód myszy, aby uniknąć ślepoty.

Napełniamy kapilarnę olejem mniej więcej do połowy jego długości i chcemy mieć wtryskiwacz nanolitrowy, którego będziemy potrzebować do wstrzyknięcia wirusów. Skóra na głowie została wymodelowana i dokładnie zdezynfekowana, jak już opisano. W celu odsłonięcia czaszki mogę oczyścić skórę najpierw skalpelem, a następnie nożyczkami.

Za pomocą bawełnianego nietoperza delikatnie czyszczę powierzchnię czaszki. Końcówka nasadki musi być teraz umieszczona w korespondencji z punktem prema. Aby wykonać jak najwięcej ćwiczeń, korzystamy z pomocy mikroskopu sterowego.

Przesunęliśmy ramię ramy stereotaktycznej na osi Y i X, aż końcówka możliwości zostanie umieszczona na bgma. Następnie ustawiamy wartość, która jest wyświetlana na wyświetlaczu cyfrowym. Ramka saksofonu widżetu jest podłączona.

Następnie przesuwamy ramię ramki stereotaktycznej, aż nie osiągniemy pożądanych współrzędnych pokazanych na wyświetlaczu. Po umieszczeniu końcówki zdolności na czerwonych współrzędnych, zaznaczamy punkt za pomocą markera z kołem elektrycznym, otwieram dziurę w tym punkcie, zwracając uwagę, a nie na uszkodzony mózg. Od teraz zaczynamy pracować z wirusami, więc musimy podjąć specjalne środki ostrożności, aby uniknąć jakiegokolwiek zakażenia.

Para jest zawsze trzymana w suchych oczach z kevalem i nie wyrzucamy go. Następnie biorę pięć mikrolitrów zawieszenia lufy i zostawiają kroplę na małym kawałku płetwy, którą wcześniej położyłem na belce powietrznej. Ponownie przesuwam ramę ramienia, aż końcówka kapilary dotknie kropelki zawiesiny wirusa.

Za pomocą cyfrowego kontrolera litrowego pubu iniekcyjnego załadujesz zawieszenie akumulatora do kapilary, zasysając je. Następnie przesuwamy naczynia włosowate z powrotem na stronę iniekcji. Gdy końcówka kapilary dotknie powierzchni PL, resetuję wartość na osi Z Na wyświetlaczu cyfrowym lewa część wirusów jest natychmiast odrzucana.

Należy pamiętać, że wirusy można odkazić etanolem, więc wszystko, co potencjalnie może się zetknąć z zawiesiną wirusa, należy uznać za czyste z etanolem. Teraz nadszedł czas na wstrzyknięcie, więc przesuwamy nasadkę w osi Z, wnikając w tkankę, aż dojdziemy do punktu ugryzienia, a następnie rozpoczynamy iniekcję. Ważne jest, aby wstrzykiwać wirusy z bardzo małą szybkością.

W tym przypadku 1 55 nanolitrów na minutę. Po pla czekamy dwie minuty, aby uniknąć przepływu przez ścieżkę igły, a następnie cofamy kapilarnę na końcu. Zamyka skórę, jak to już zostało pokazane.

Śmieci S dwa pojemniki, a następnie zewnętrzna płyta. Po zabiegu u myszy można poddać perfuzji 4%Paraform dei. Mózg można wypreparować i plus XI w ciągu nocy w 4% paraform dziennie.

Ostatecznie, DU i/lub tamoksyfen lub inne składniki mogą być podawane przed poświęceniem zgodnie z różnymi paradygmatami w celu zbadania kinetyki cyklu komórkowego i zatrzymania ekspresji transgenu wirusowego. Kiedy są one otoczone bokami, mózg może być następnie przetworzony pod kątem barwienia immunologicznego za pomocą markerów ER w celu identyfikacji komórek macierzystych i progenitorowych oraz neuronów, takich jak SOX, dwa, GFIP, gniazdowanie, T, dwa, podwójne, Carin lub inne. Można to wykorzystać do ilościowego określenia proporcji różnych populacji komórek.

W związku z tym myślę, że oglądanie filmu sprawia Ci przyjemność i mam nadzieję, że może to być przydatne w Twoich badaniach.