Nowatorski osmometr nanolitrowy obsługiwany przez LabVIEW do badań białek wiążących lód

Celem tej procedury jest pomiar histerezy termicznej białek wiążących lód i innych materiałów, które wpływają na wzrost lodu. Osiąga się to poprzez najpierw utworzenie rurki kapilarnej z wąskim otworem i zassanie kropli roztworu białka. Rurkę kapilarną z próbką umieszcza się następnie na stoliku o kontrolowanej temperaturze.

Drugim krokiem jest zamrożenie roztworu poprzez schłodzenie go do niskich temperatur w celu wprowadzenia lodu do kropli. Następnie kropla jest ciepła, aby stopić większość lodu. W celu utrzymania pojedynczego kryształu w kropli.

Ostatnim krokiem jest ponowne schłodzenie lodu, aż zacznie szybko rosnąć. Ostatecznie analiza wideomikroskopii służy do obliczania różnicy między temperaturą topnienia a temperaturą zamarzania w celu określenia histerezy termicznej, a także do określenia kształtowania się kryształów lodu i pomiaru prędkości wzrostu lodu. Główną zaletą opracowanego przez nas sterownika laboratoryjnego Nanolitr SM w stosunku do istniejących metod jest to, że bardzo długie lub bardzo szybkie pomiary mogą być wykonywane dokładnie i powtarzalnie.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie białek wiążących lód, takie jak zależność ich od czasu. Na początek przygotuj szklaną kapilę do wstrzykiwania roztworu. Za pomocą ściągacza kapilarnego przygotuj ostrą pipetę z drobnym otworem ze szklanej mikrorurki kapilarnej.

Wielkość otworu należy sprawdzić, przepuszczając powietrze przez kapilatę w celu uzyskania drobnej, bulgoczącej wody. Przygotuj kapilarnę w taki sposób, aby otwór był prawie zablokowany, ale był wystarczająco otwarty, aby umożliwić tworzenie się pęcherzyków submilimetrowych. Jeśli kapilara jest zamknięta, otwórz ją, łamiąc jej krawędź, delikatnie dociskając lub drapiąc ją o ścianki rurki zawierającej wodę.

Producent dwuwarstwowego szkła nakrywkowego poprzez umieszczenie odpowiedniej cząstki osuszacza osuszającego między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Klej. Okładka zsuwa się za pomocą pistoletu do klejenia na gorąco. Dwuwarstwowe szkło pokrywowe umożliwia obserwację próbki bez kondensacji wilgoci na powierzchni szkła nakrywkowego.

Aby przygotować etap chłodzenia, podłącz wlot i wylot przepływu wody ze stopnia chłodzenia do średnicy czterech milimetrów. Rurki Gon łączą rurkę wlotową przepływu wody z pompą wodną. Podłącz rurkę tigon o średnicy czterech milimetrów do wlotu stopnia chłodzącego, aby dostarczyć suche powietrze, które zostało wysuszone.

Korzystając z wbudowanej kolumny lodowej suszarki, uruchom pompy powietrza i wody. Należy pamiętać, że elementy chłodzące nie powinny być uruchamiane bez radiatora. Włącz procedurę regulatora temperatury, kamery i widoku laboratoryjnego.

Aby rozpocząć przygotowanie próbki, umieść od trzech do czterech mikrolitrów kropli olejku immersyjnego B na tylnej stronie miedzianego krążka o średnicy siedmiu milimetrów, z otworami o średnicy 500 mikronów wywierconymi przez krążek. Umieść miedziany krążek na stoliku chłodzącym stroną z olejkiem immersyjnym skierowaną w dół. Podłącz krawędź rurki kapilarnej do rurki tigon o średnicy 0,7 milimetra.

Podłączony na drugim końcu do dwumililitrowej szklanej strzykawki. Powoli włóż szklaną kapilarnę do przygotowanego białka wiążącego lód lub probówki z próbką IBP i pociągnij szklaną strzykawkę, aż szklana kapilara będzie zawierała 0,1 mikrolitra roztworu białka. Rozpocznij nagrywanie wideo za pomocą oprogramowania do przeglądania laboratorium.

Włóż ostrą krawędź napełnionej szklanej kapilary do jednego z otworów w miedzianym krążku na etapie chłodzenia. Obserwując przez mikroskop, ostrożnie i bardzo delikatnie penetruj warstwę olejku immersyjnego szklaną końcówką kapilarną. Naciśnij szklaną strzykawkę, aby dostarczyć niewielką ilość roztworu białka, aby utworzyć kroplę o wielkości 200 mikronów.

Zakryj otwór w fazie chłodzenia za pomocą dwuwarstwowego zespołu szkła osłonowego. Naciśnij przycisk chłodzenia i ustaw temperaturę na minus 40 stopni Celsjusza. Początkowo kropla roztworu będzie przezroczysta w niskich temperaturach, zwykle w zakresie temperatur od minus 30 stopni Celsjusza do minus 35 stopni Celsjusza.

Kropla zmienia kolor wskazując, że roztwór został zamrożony natychmiast po zamrożeniu próbki. Powoli zwiększaj temperaturę, aż lód zacznie się topić. Stopniowy wzrost temperatury jest konieczny, aby uniknąć przekroczenia temperatury, które mogłoby spowodować całkowite stopienie próbki, przełączyć się na 50-krotny cel i rozpocząć topienie lodu poprzez regulację temperatury.

Ta regulacja jest interaktywna, a końcowe kroki są zwykle wykonywane przy użyciu małych kroków temperatury 0,002 stopnia Celsjusza, kontynuuj topnienie, aż pozostanie pojedynczy kryształ. Ostateczny rozmiar kryształu powinien wynosić około 10 mikronów. Najwyższa temperatura, w której ustało topnienie, jest określana jako temperatura topnienia i jest dokładnie określana na późniejszym etapie analizy wideo.

Następnie ustaw temperaturę na kilka setnych stopnia Celsjusza poniżej temperatury topnienia kryształu i rozpocznij rampę temperatury z 10-minutowym opóźnieniem, dostosuj szybkość narastania zgodnie z potrzebami. W tym czasie kryształ zostanie wystawiony na działanie ips po zakończeniu 10-minutowego czasu ekspozycji, temperatura spadnie automatycznie pod kontrolą rutynowego widoku laboratoryjnego. Obserwuj kształt kryształu wraz ze spadkiem temperatury.

W pewnym momencie można zaobserwować nagły wybuch kryształków lodu. Temperatura, w której to zachodzi, jest odnotowywana jako temperatura pęknięcia kryształu. Użyj analizy wideo, aby określić dokładną temperaturę topnienia i temperaturę rozerwania.

Po pierwsze, korzystając z analizy wideo, znajdź dokładną temperaturę topnienia. Przypomnijmy, że najwyższą temperaturę, w której ustało topnienie, określa się jako temperaturę topnienia. Udokumentuj tę temperaturę topnienia w arkuszu kalkulacyjnym.

Następnie określ dokładną temperaturę rozbłysku kryształu i również ją udokumentuj. Różnica między temperaturą topnienia a temperaturą zamarzania lub temperaturą pękania kryształów to histereza termiczna roztworu IBP. Aby rozpocząć pomiar zależnej od czasu aktywności TH, stopij lód, aż monokryształ pozostanie tak, jak to zrobiono przed utworzeniem kryształu.

Ustaw żądany czas opóźnienia rampy i włącz rampę Tutaj, na przykład, czas opóźnienia został ustawiony na jedną minutę. Temperatura będzie automatycznie spadać w ustalonym tempie. Po upływie czasu opóźnienia narastania udokumentuj temperaturę, w której następuje pęknięcie kryształu.

Oblicz czas ekspozycji, który jest czasem między powstaniem kryształu a wybuchem kryształu. Powtórz eksperyment dla różnych czasów opóźnienia i wykreśl aktywność TH jako funkcję ekspozycji. Czas na ocenę zależności czasowej aktywności TH.

Precyzyjna kontrola temperatury możliwa dzięki nanolitrowemu monitorowi OSM miała kluczowe znaczenie dla zapewnienia dokładnego pomiaru aktywności TH i zależności od czasu. Czas ekspozycji kryształu lodu na IPS w roztworze definiuje się jako okres od powstania kryształu do nagłego wzrostu lodu wokół kryształu. Czas ekspozycji kryształów ICE na IPS miał decydujący wpływ na aktywność TH.

Krótkie okresy ekspozycji na IBP powodowały niską aktywność TH w roztworze MP I-B-P-G-F-P. Aktywność TH wzrastała wraz z czasem ekspozycji na IBP, aż osiągnęła plateau po czterech minutach ekspozycji na IBP przy wyższych stężeniach IBP. Plateau został osiągnięty w krótszym czasie Mikroskopia fluorescencyjna w połączeniu z urządzeniami mikroprzepływowymi, które wykorzystują podobny etap kontroli widoku miłości, może być wykorzystana do odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak akumulacja białek wiążących lód na powierzchni kryształków lodu.

Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy dobrze zrozumieć, jak wykonać termiczny pomiar STERIS, który ocenia aktywność białek wiążących lód.