Name: Nowatorski osmometr nanolitrowy obsługiwany przez LabVIEW do badań białek wiążących lód (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-04T09:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj pomiar histerezy termicznej białek wiążących lód za pomocą nanolitrowego osmometru sterowanego przez LabVIEW. Ta metoda umożliwia precyzyjną analizę wzrostu i topnienia kryształów lodu w roztworach białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez ISF, NSF oraz ERC. Chcielibyśmy podziękować za pomoc techniczną przy przygotowaniu modułu temperaturowego Randy'emu Milfordowi, Michaelowi Korenowi, Dougowi Shaferowi i Jeremy'emu Dennisonowi. Pomoc w opracowaniu oprogramowania zapewnili Or Chen, Di Xu, Rajesh Sannareddy i Sumit Bhattachary. Dziękujemy naszym współpracownikom, prof. Peterowi L. Daviesowi i dr Laurie A. Graham za dostarczenie białka MpIBP oraz pomocne dyskusje. Dziękujemy również członkom laboratorium: dr Mayi Bar-Dolev, Yangzhongowi Qinowi, dr Yeliz Celik, dr Natalyi Pertayi, Ortal Mizrahy i Shlomit Guy za ich uwagi dotyczące użytkowania.

0. Procedury wstępne
<ol>
	<li>Szklana kapilara do wstrzykiwania roztworu. Za pomocą wyciągacza kapilar (Narishige, Tokio, Japonia) przygotować ostrą pipetę z wąskim otworem z mikro rurki kapilarnej ze szkła (Brand GMBH, Wertheim, Niemcy). Wielkość otworu należy zweryfikować, przepuszczając powietrze przez kapilarę, aby uzyskać drobne pęcherzyki w czystej wodzie. Jeśli kapilara jest zamknięta, można ją otworzyć poprzez przełamanie jej krawędzi. Można to osiągnąć, delikatnie dociskając lub zdrapując ją o ścianki probówki z wodą. Kapilara powinna być przygotowana w taki sposób, aby otwór był niemal zablokowany, ale jednocześnie wystarczająco otwarty, by umożliwić tworzenie się pęcherzyków o rozmiarach submilimetrowych.</li>
	<li>Czyszczenie miedzianych dysków. Miedziane dyski poddać sonikacji przez 10 min w 0,1% roztworze mydła Micro-90 (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, USA), a następnie wypłukać wodą dwukrotnie destylowaną. Umieścić dyski w izopropanolu (technicznym) i ponownie sonikować przez 10 min. Na koniec wysuszyć dyski za pomocą przefiltrowanego powietrza. Ten etap czyszczenia jest krytyczny, aby uniknąć zanieczyszczenia IBP pomiędzy eksperymentami.</li>
	<li>Montaż dwuwarstwowego szkiełka nakrywkowego. Przygotowano zespół szkiełek nakrywkowych, aby umożliwić obserwację próbki bez kondensacji wilgoci na powierzchni szkiełka. Osiągnięto to poprzez umieszczenie ziarna Drierite (W.A. Hammond Drierite, Xenia, Ohio, USA) (o średnicy 2 mm) pomiędzy dwoma szkiełkami nakrywkowymi, które następnie skleiono pistoletem z klejem na gorąco. Taka konfiguracja zapobiegła kondensacji, która mogłaby zasłonić widok podczas chłodzenia próbki do niskich temperatur, oraz wyeliminowała konieczność nadmuchiwania okna obserwacyjnego suchym powietrzem.</li>
</ol>
1. Konfiguracja etapu chłodzenia
<ol>
	<li>Podłączyć wlot i wylot przepływu wody w stopniu chłodzącym do rurek Tygon o średnicy wewnętrznej 4 mm (Saint-Gobain, Paryż, Francja), a rurkę wlotową przepływu wody podłączyć do pompy wodnej.</li>
	<li>Do wlotu stopnia chłodzącego podłączyć rurkę Tygon o średnicy wewnętrznej 4 mm w celu doprowadzania suchego powietrza. Powietrze było osuszane przy użyciu kolumny Drierite zamontowanej w linii.</li>
	<li>Uruchomić pompy powietrza i wody. Należy pamiętać, że elementów chłodzących nie wolno uruchamiać bez radiatora.</li>
	<li>Włączyć kontroler temperatury, kamerę oraz procedurę LabVIEW.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Nanieś kroplę 3-4 μl oleju immersyjnego B (Cargille laboratories, Cedar Grove, New Jersey, USA) na tylną stronę miedzianej płytki o średnicy 7 mm z wywierconymi otworami o średnicy 500 μm.</li>
	<li>Umieść miedzianą płytkę na stoliku chłodzącym stroną z olejem immersyjnym skierowaną w dół.</li>
	<li>Połącz rurkę kapilarną (tępy koniec) z rurką Tygon o średnicy wewnętrznej 0,7 mm, która z drugiej strony jest połączona ze szklaną strzykawką o pojemności 2 ml (Poulten-Graf, Wertheim, Niemcy).</li>
	<li>Przed użyciem rurki kapilarnej sprawdź mały otwór kapilary, aby upewnić się, że ma on odpowiedni rozmiar (patrz: Procedury wstępne).</li>
	<li>Powoli wprowadź szklaną kapilarę do przygotowanej probówki z próbką białka IBP (2,4 μM MpIBP-GFP w 20 mM CaCl2 i 25 mM Tris-HCl przy pH 8, szczegóły przygotowania znajdują się w referencji10) i odciągnij tłok szklanej strzykawki, aż w szklanej kapilarze znajdzie się 0,1 μl roztworu białka.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie wideo za pomocą oprogramowania LabVIEW.</li>
	<li>Wprowadź ostry koniec szklanej kapilary (zawierającej roztwór białka) do jednego z otworów w miedzianej płytce na stoliku chłodzącym.</li>
	<li>Obserwując obraz przez mikroskop (Olympus, Tokio, Japonia, obiektyw 10x), ostrożnie przebij końcówką szklanej kapilary warstwę oleju immersyjnego i (bardzo delikatnie) naciśnij szklaną strzykawkę, aby podać niewielką ilość (~10 nl) roztworu białka w celu utworzenia kropli o rozmiarze 200 μm.</li>
	<li>Przykryj otwór w stoliku chłodzącym podwójną warstwą szkiełek nakrywkowych (patrz: Procedury wstępne).</li>
</ol>
3. Pomiar aktywności TH
<ol>
	<li>Naciśnij przycisk chłodzenia i ustaw temperaturę na -40 °C.</li>
	<li>Początkowo kropla roztworu będzie przezroczysta. W niskich temperaturach, zazwyczaj w zakresie od -30 °C do -35 °C, kropla zmienia kolor, co wskazuje na zamarznięcie roztworu. Natychmiast po zamarznięciu próbki powoli zwiększaj temperaturę, aż główna masa lodu zacznie topnieć. Stopniowy wzrost temperatury jest niezbędny, aby uniknąć jej nadmiernego przekroczenia, co mogłoby doprowadzić do całkowitego stopienia próbki.</li>
	<li>Przełącz na obiektyw 50x i rozpocznij topnienie lodu poprzez regulację temperatury. Regulacja ta odbywa się w sposób interaktywny, a końcowe etapy są zazwyczaj wykonywane w małych krokach temperaturowych wynoszących 0,002 °C. Kontynuuj topnienie, aż pozostanie pojedynczy kryształ. Końcowy rozmiar kryształu powinien wynosić około 10 μm. Najwyższą temperaturę, przy której topnienie ustało, uznaje się za punkt topnienia; jest ona precyzyjnie wyznaczana na późniejszym etapie analizy wideo.</li>
	<li>Ustaw temperaturę na kilka setnych stopnia Celsjusza poniżej punktu topnienia kryształu i rozpocznij rampę temperatury z 10 min opóźnieniem. Dostosuj szybkość rampowania według uznania. W tym czasie kryształ będzie eksponowany na działanie IBPs.</li>
	<li>Po upływie 10 min czasu ekspozycji temperatura obniży się automatycznie pod kontrolą rutyny LabVIEW.</li>
	<li>Obserwuj kształt kryształu podczas obniżania temperatury. W pewnym momencie może zostać zaobserwowany gwałtowny rozpad kryształu lodu. Temperaturę, przy której to następuje, zapisuje się jako temperaturę rozpadu kryształu.</li>
	<li>Wykorzystaj analizę wideo do precyzyjnego wyznaczenia punktu topnienia oraz temperatury rozpadu. Najpierw za pomocą analizy wideo znajdź dokładny punkt topnienia. Należy pamiętać, że za punkt topnienia uznaje się najwyższą temperaturę, przy której topnienie ustało. Odnotuj ten punkt topnienia w programie do arkuszy kalkulacyjnych. Następnie wyznacz dokładną temperaturę rozpadu kryształu i również ją udokumentuj. Różnica między punktem topnienia a punktem zamarzania, czyli temperaturą rozpadu kryształu, stanowi aktywność histerezy termicznej roztworu IBP.</li>
</ol>
4. Pomiar aktywności TH zależnej od czasu
<ol>
	<li>Należy postępować zgodnie z protokołem opisanym w rozdziałach 3.1-3.3, aby przygotować pojedynczy kryształ lodu.</li>
	<li>Po utworzeniu kryształu należy ustawić pożądany czas opóźnienia rampy, a następnie uruchomić rampę.</li>
	<li>Po upływie czasu opóźnienia rampy temperatura będzie automatycznie spadać ze stałą prędkością (zgodnie z wymaganiami operatora).</li>
	<li>Należy odnotować temperaturę, przy której następuje pęknięcie kryształu. Następnie należy obliczyć czas ekspozycji (czas między utworzeniem kryształu a jego pęknięciem).</li>
	<li>Eksperyment należy powtórzyć dla różnych czasów opóźnienia i wykreślić aktywność TH jako funkcję czasu ekspozycji, aby ocenić zależność aktywności TH od czasu.</li>
</ol>

<ol><li>DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoproteins+as+biological+antifreeze+agents+in+antarctic+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes.</a> Science. 172, 1152-1155 (1971).</li>
<li>Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carrot+leucine-rich-repeat+protein+that+inhibits+ice+recrystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization.</a> Science. 282, 115-117 (1998).</li>
<li>Raymond, J. A., Knight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice+binding%2C+recrystallization+inhibition%2C+and+cryoprotective+properties+of+ice-active+substances+associated+with+Antarctic+sea+ice+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms.</a> Cryobiology. 46, 174-181 (2003).</li>
<li>Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+composition%2C+and+physical+properties+of+a+thermal+hysteresis+%22antifreeze%22+protein+from+larvae+of+the+beetle%2C+Tenebrio+molitor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor.</a> Biochemistry. 21, 716-721 (1982).</li>
<li>Kiko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+freeze+protection+in+a+sea-ice+crustacean+through+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Polar+Biology%22%5BJournal%5D)">Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer.</a> Polar Biology. 33, 543-556 (2010).</li>
<li>Robinson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+adaptation+in+Arctic+and+Antarctic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi.</a> New Phytol. 151, 341-353 (2001).</li>
<li>Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+antifreeze+protein+activity+in+Antarctic+lake+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria.</a> Microbiology. 150, 171-180 (2004).</li>
<li>Raymond, J. A., DeVries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).</li>
<li>Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+evidence+for+quasi-permanent+attachment+of+antifreeze+proteins+to+ice+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces.</a> Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).</li>
<li>Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superheating+of+ice+crystals+in+antifreeze+protein+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).</li>
<li>Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmolarity+of+tear+microvolumes+in+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca.</a> Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).</li>
<li>Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive%2C+Ca2%2B-dependent+antifreeze+protein+in+an+Antarctic+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium.</a> FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).</li>
<li>Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universality+of+persistence+exponents+in+two-dimensional+ostwald+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening.</a> Phys. Rev. Lett. 103, (2009).</li>
<li>Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+method+for+determining+ice+recrystallization+inhibition+by+antifreeze+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Bioph.+Res.+Co%22%5BJournal%5D)">A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins.</a> Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).</li>
<li>Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solute+Effects+on+Ice+Recrystallization+-+an+Assessment+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique.</a> Cryobiology. 25, 55-60 (1988).</li>
<li>Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).</li>
<li>Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifreeze+protein+from+freeze-tolerant+grass+has+a+beta-roll+fold+with+an+irregularly+structured+ice-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site.</a> J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Niniejsza praca demonstruje działanie sterowanego komputerowo nanolitrowego osmometru, który umożliwia dokładne pomiary aktywności TH przy nadzwyczajnej kontroli temperatury. W każdym systemie wrażliwym na temperaturę należy unikać niepożądanych gradientów temperatury. Aby uniknąć gradientów temperatury w przedstawionym tutaj aparacie, kropla roztworu testowego musi zostać umieszczona w centrum otworu w miedzianym dysku stopnia chłodzącego (krok 2.7). Dodatkowo pojedynczy kryształ powinien znajdować się w centrum kropli, a nie w pobliżu jej krawędzi (w większości przypadków dzieje się to samoistnie). Opisana zależność czasowa wskazuje, że szybkość chłodzenia może wpływać na odczyty TH. Sugerujemy zatem uwzględnienie w raporcie czasu, przez który kryształ był wystawiony na działanie roztworu przed chłodzeniem, a także szybkości chłodzenia. Zazwyczaj oczekiwano 10 min przed obniżaniem temperatury w krokach 0,01 °C co 4 sec.
Stolik chłodzący sterowany programem LabVIEW został przystosowany do pracy z mikroskopem odwróconym, co umożliwiło termiczną manipulację urządzeniami mikroprzepływowymi. System ten ułatwia przeprowadzanie eksperymentów z wymianą roztworów z udziałem kryształków lodu oraz białek IBPs znakowanych eGFP9, 10, 16. System sterowany przez LabVIEW można dostosować do stolika Clifton poprzez podłączenie kontrolera temperatury 3,040 za pomocą dedykowanego adaptera elektrycznego. Taki system jest wykorzystywany w laboratorium Daviesa17. Oprogramowanie LabVIEW oraz projekt dedykowanego adaptera elektrycznego dla stolika Clifton są dostępne na zapytanie.
Podsumowując, opisaliśmy nanolitrowy osmometr, który umożliwia precyzyjną kontrolę i manipulację temperaturą oraz szybkością jej wzrostu i spadku (z czułością 0,002 °C), skoordynowaną z interfejsem wideo za pomocą procedury LabVIEW w celu analizy w czasie rzeczywistym. System ten pozwala na przeprowadzanie powtarzalnych eksperymentów z kontrolowaną szybkością zmian, które są istotne dla badania kinetyki oddziaływań IBP z lodem. Takie eksperymenty mogą pomóc w rozwiązaniu wielu długo dyskutowanych kwestii dotyczących mechanizmu działania IBP.

<table><tbody><tr><td>Olej immersyjny Typ B</td><td>Cargille Laboratories</td><td>16484</td><td></td></tr><tr><td>Drierite</td><td>W.A. Hammond Drierite</td><td>043063 2270g</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór czyszczący Micro 90</td><td><a href="http://www.coleparmer.com/Product/Cole_Parmer_small_sup_reg_sup_small_Micro_90_small_sup_reg_sup_small_cleaning_solution_case_of_four_4_Liter_bottles/EW-18100-11" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Cole-Parmer</a></td><td>&lt;a href="http://www.coleparmer.com/Product/Cole_Parmer_small_sup_reg_sup_small_Micro_90_small_sup_reg_sup_small_cleaning_solution_case_of_four_4_Liter_bottles/EW-18100-11" target="_blank"&gt;EW-18100-11&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Wytciągacz kapilar</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td></td></tr><tr><td>Szklane kapilary</td><td>Brand GNBH</td><td>7493 21</td><td>długość 75 mm, średnica 1,15</td></tr><tr><td>Kontroler temperatury</td><td>Newport, Irvine, California, United States</td><td>Model 3040</td><td>Model 3040</td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Olympus</td><td>Model BH2</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 10x</td><td>Olympus</td><td></td><td>S Plan 10, 0,3, 160/0,17</td></tr><tr><td>Obiektyw 50x</td><td>Nikon</td><td></td><td>CF plan, 50X/0,55 EPI ELWD</td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Provideo</td><td>CVC-140</td><td></td></tr><tr><td>Rurki Tygon</td><td>Saint-Gobain, Paris, France</td><td></td><td>Tygon Formulation S-50-HL Tubing</td></tr><tr><td>Strzykawka szklana (2 ml)</td><td>Poulten-Graf, Wertheim, Germany</td><td>7 10227</td><td></td></tr><tr><td>Karta GPIB-PCI</td><td>National instruments, Austin, Texas, USA</td><td>778032-01</td><td></td></tr><tr><td>Karta przechwytywania obrazu wideo IMAQ-PCI-1407</td><td>National instruments, Austin, Texas, USA</td><td>322156B-01</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do projektowania systemów LabVIEW</td><td>National instruments, Austin, Texas, USA</td><td>Version 8</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie DiVx Author</td><td>DiVx LLC, San Diego, CA, USA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nowoczesny osmometr nanolitrowy sterowany programem labview do badań nad białkami wiążącymi lód

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

Białka wiążące lód (IBPs), w tym białka przeciwzamrażające, białka strukturyzujące lód, białka histerezy termicznej i białka hamujące rekrystalizację lodu, występują u organizmów przystosowanych do zimna i chronią je przed uszkodzeniami mrozowymi poprzez oddziaływanie z kryształami lodu. IBPs występują u wielu organizmów, w tym u ryb1, roślin2, 3, stawonogów4, 5, grzybów6 oraz bakterii7. IBPs adsorbują się na powierzchniach kryształów lodu i zapobiegają przyłączaniu się cząsteczek wody do sieci krystalicznej lodu w miejscu adsorpcji białka. Lód narastający na powierzchni kryształu pomiędzy zaadsorbowanymi IBPs wykazuje dużą krzywiznę, co obniża temperaturę, w której rosną kryształy lodu – zjawisko to nazywane jest efektem Gibbsa-Thomsona. Obniżenie to tworzy lukę (histereza termiczna, TH) między punktem topnienia a nierównowagowym punktem zamarzania, w obrębie której wzrost lodu zostaje zahamowany8-10, patrz Rycina 1. Jednym z głównych narzędzi stosowanych w badaniach nad IBPs jest osmometr nanolitrowy, który ułatwia pomiary aktywności TH roztworów IBPs. Osmometry nanolitrowe, takie jak instrument Clifton (Clifton Technical Physics, Hartford, NY) i instrument Otago (Otago Osmometers, Dunedin, Nowa Zelandia), zostały zaprojektowane do pomiaru osmolarności roztworu poprzez pomiar obniżenia punktu topnienia kropli o objętości nanolitrowej. Urządzenia te były wykorzystywane do pomiaru osmolarności próbek biologicznych, takich jak łzy11, i okazały się użyteczne w badaniach nad IBPs. Ręczna kontrola tych osmometrów nanolitrowych ograniczała możliwości eksperymentalne. Szybkość zmian temperatury nie mogła być kontrolowana w sposób niezawodny, zakres temperatur w instrumencie Clifton był ograniczony do 4 000 mOsmol (około -7,5 °C), a rejestracja temperatury w funkcji czasu nie była dostępną opcją w tych urządzeniach.
Zaprojektowaliśmy specjalistyczny system nanolitrowego osmometru sterowanego komputerowo z wykorzystaniem platformy LabVIEW (National Instruments). Stolik chłodzący, opisany wcześniej9, 10, zawiera blok metalowy, przez który cyrkuluje woda, co sprawia, że pełni on funkcję radiatora, patrz Rysunek 2. Do bloku tego przymocowano chłodziarki termoelektryczne, które mogą być sterowane za pomocą komercyjnego kontrolera temperatury obsługiwanego przez moduły LabVIEW, patrz Rysunek 3. Dalsze szczegóły przedstawiono poniżej. Główną zaletą tego systemu jest precyzyjna kontrola temperatury, patrz Rysunek 4. Zautomatyzowane sterowanie temperaturą umożliwia koordynację stałej rampy temperaturowej z obrazem z mikroskopii wideo zawierającym dodatkowe szczegóły eksperymentalne.
Aby zbadać zależność aktywności TH od czasu, przetestowano hiperaktywne IBP o masie 58 kDa pochodzące z antarktycznej bakterii Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. Białko to zostało znakowane ulepszonymi białkami fluorescencyjnymi zielonymi (eGFP) w konstrukcie opracowanym przez grupę Petera Daviesa (Queens University)10. Wykazano, że profil zmian temperatury wpływał na aktywność TH. Precyzyjna kontrola profilu temperatury w tych eksperymentach znacząco poprawiła pomiary TH. Nanolitrowy osmometr pozwolił dodatkowo zbadać hamowanie rekrystalizacji przez IBPs5, 13. Rekrystalizacja jest zjawiskiem, w którym duże kryształy rosną kosztem kryształów małych. IBPs skutecznie hamują rekrystalizację, nawet przy niskich stężeniach14, 15. Wykorzystano osmometr sterowany programem LabVIEW do ilościowego śledzenia rekrystalizacji lodu oraz do wymuszania stałej frakcji lodu za pomocą jednoczesnej analizy wideo obrazów w czasie rzeczywistym i sprzężenia zwrotnego temperatury z komory z próbką13. Obliczenia w czasie rzeczywistym oferują dodatkowe opcje kontroli podczas procedury eksperymentalnej. Opracowano stolik do mikroskopu odwróconego, przystosowany do mikroprzepływowych urządzeń z kontrolą temperatury, które zostaną opisane w innej publikacji16.
System stolika chłodzącego
Zespół modułu chłodzącego (Rysunek 2) składa się z zestawu chłodziarek termoelektrycznych, które chłodzą miedzianą płytkę. Ciepło jest odprowadzane z modułu poprzez przepływ zimnej wody przez zamkniętą komorę znajdującą się pod chłodzarkami termoelektrycznymi. Otwór o średnicy 4 mm w środku miedzianej płytki służy jako okno obserwacyjne. Wywiercono otwór w płaszczyźnie o średnicy 1 mm, aby dopasować termistor. Na miedzianej płytce umieszczono wykonaną na zamówienie miedzianą tarczkę (o średnicy 7 mm) z kilkoma otworami (o średnicy 500 μm) i wyrównano ją z oknem obserwacyjnym. Powietrze pompowano z natężeniem przepływu 35 ml/sec i osuszano przy użyciu Drierite (W.A. Hammond). Suche powietrze zastosowano w celu zapewnienia suchego środowiska w module chłodzącym. Moduł został połączony za pomocą 9-pinowego gniazda z kontrolerem temperatury (Model 3040 lub 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). Kontroler temperatury został połączony za pomocą kabla z kartą GPIB-PCI komputera (National instruments, Austin, Texas, USA).

Pomiar zależności czasu TH
Nanolitrowy osmometr sterowany programem LabVIEW umożliwia precyzyjne pomiary aktywności TH. Stała szybkość obniżania temperatury pozwoliła na pomiar zależności czasu od TH. Precyzyjna kontrola temperatury zapewniona przez nanolitrowy osmometr była kluczowa dla tych eksperymentów. Czas ekspozycji kryształu lodu na IBPs w roztworze definiuje się jako okres od momentu powstania kryształu (koniec procesu topnienia) do gwałtownego wzrostu lodu wokół kryształu (rozprysk kryształu). Stwierdzono, że czas ekspozycji kryształów lodu na IBPs ma kluczowy wpływ na aktywność TH. Krótkie okresy ekspozycji na IBP (kilka sekund) powodowały niską aktywność TH w roztworze MpIBP-GFP (2,4 μM) (Rysunek 5). Aktywność TH wzrastała wraz z czasem ekspozycji na IBP, aż do osiągnięcia plateau przy 4 min ekspozycji na IBP. Przy wyższych stężeniach IBP plateau osiągano w krótszym czasie.
<img alt="Schemat białka przeciwzamrożeniowego: cząsteczki AFP oddziałują z lodem, aby hamować jego wzrost." src="/files/ftp_upload/4189/4189fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat ilustrujący IBP zaadsorbowane na lodzie. Adaptacja za zgodą autorów 10.
<img alt="Układ mikroskopu i chłodzenia termoelektrycznego; schemat i obrazy dla eksperymentów z wzbudzeniem optycznym." fo:src="/files/ftp_upload/4189/4189fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Platforma chłodząca. A) Podłączona do rurek na mikroskopie. B) Bez górnego przewodu. C) Schemat blokowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4189/4189fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek </a>
<img alt="Dynamika komórkowa, obraz mikroskopowy, system kontroli temperatury, ustawienie eksperymentu, analiza w czasie rzeczywistym." src="/files/ftp_upload/4189/4189fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Zrzut ekranu interfejsu LabVIEW. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4189/4189fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy rysunek</a>.
<img alt="Wykres analizy stabilności temperatury, wykres temperatury w funkcji czasu, pokazujący trendy fluktuacji." fo:src="/files/ftp_upload/4189/4189fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Wykres stabilności temperatury. Sterownik temperatury został ustawiony tak, aby obniżać temperaturę o 0,01 °C co 15 sec.
<img alt="Wykres histerezy termicznej przedstawiający zmianę temperatury w czasie, kluczowe dane dla analizy odpowiedzi cieplnej." fo:src="/files/ftp_upload/4189/4189fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4189/4189fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. MpIBP aktywność TH w funkcji czasu ekspozycji kryształów lodu na IBP. Każdy punkt czasowy stanowi średnią z 3-6 eksperymentów.

Białka wiążące lód (IBPs), znane również jako białka przeciwzamrożeniowe, hamują wzrost kryształków lodu i stanowią obiecujący dodatek do stosowania w krio konserwacji tkanek. Głównym narzędziem wykorzystywanym do badania białek IBPs jest osmometr nanolitrowy. Opracowaliśmy autorską platformę chłodzącą zamontowaną na mikroskopie optycznym, sterowaną za pomocą dedykowanej procedury w programie LabVIEW. Opisany tutaj osmometr nanolitrowy umożliwia ultrazieczulną manipulację temperaturą próbki.

Nowoczesny osmometr nanolitrowy sterowany programem LabVIEW do badań nad białkami wiążącymi lód

Białka wiążące lód (IBPs), w tym białka przeciwzamrożeniowe, białka strukturyzujące lód, białka powodujące hysterezę termiczną oraz białka hamujące rekrystalizację lodu ...

Celem niniejszej procedury jest pomiar histerezy termicznej białek wiążących lód oraz innych materiałów wpływających na wzrost kryształów lodu. Osiąga się to poprzez przygotowanie rurki kapilarnej z wąskim otworem, a następnie zassanie do niej kropli roztworu białka. Rurka kapilarna z próbką zostaje następnie umieszczona na platformie z kontrolowaną temperaturą.Drugim krokiem jest zamrożenie roztworu poprzez schłodzenie go do niskich temperatur w celu wprowadzenia lodu do kropli. Następnie kroplę ogrzewa się, aby roztopić większość lodu, co pozwala na utrzymanie pojedynczego kryształu w kropli.Ostatnim krokiem jest ponowne chłodzenie lodu, aż zacznie on gwałtownie rosnąć. W końcowej fazie wykorzystuje się analizę mikroskopii wideo do obliczenia różnicy między temperaturą topnienia a temperaturą zamarzania w celu wyznaczenia hysteresisy termicznej, a także do określenia kształtu kryształów lodu i pomiaru prędkości wzrostu lodu. Główną zaletą opracowanego przez nas systemu kontroli laboratoryjnej Nanoliter SM w stosunku do istniejących metod jest możliwość dokładnego i powtarzalnego przeprowadzania bardzo długich lub bardzo szybkich pomiarów.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny białek wiążących lód, takie jak zależność czasowa ich działania. Aby rozpocząć, przygotuj kapilarę szklaną do wstrzykiwania roztworu. Użyj wyciągarki kapilarnej, aby przygotować z szklanej mikrokapilary ostrą pipetę z wąskim otworem.Wielkość otworu należy zweryfikować, przepuszczając powietrze przez kapilarę, aby uzyskać drobne pęcherzyki w wodzie. Przygotuj kapilarę w taki sposób, aby otwór był niemal całkowicie zablokowany, ale jednocześnie wystarczająco otwarty, by umożliwić powstawanie pęcherzyków o rozmiarach submilimetrowych. Jeśli kapilara jest zamknięta, otwórz ją, delikatnie naciskając lub pocierając jej krawędź o ścianki probówki z wodą.Przygotuj dwuwarstwowy zestaw szkiełek nakrywkowych, umieszczając ziarno osuszacza bezpośrednio pomiędzy dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Sklej szkiełka nakrywkowe za pomocą pistoletu z klejem na gorąco. Dwuwarstwowe szkiełko nakrywkowe umożliwia obserwację próbki bez kondensacji wilgoci na powierzchni szkiełka.Aby przygotować stopień chłodzący, podłącz wlot i wylot przepływu wody stopnia chłodzącego do rurek Tygon o średnicy 4 mm. Podłącz rurkę wlotową przepływu wody do pompy wodnej. Do wlotu stopnia chłodzącego podłącz rurkę Tygon o średnicy 4 mm w celu doprowadzenia osuszonego powietrza.Używając kolumny z suchym lodem zamontowanej w linii, uruchom pompy powietrza i wody. Należy pamiętać, aby nie uruchamiać elementów chłodzących bez radiatora. Włącz kontroler temperatury, kamerę oraz rutynę LabVIEW.Aby rozpocząć przygotowanie próbki, nanieś kroplę od 3 do 4 µL oleju immersyjnego B na tylną stronę miedzianej płytki o średnicy 7 mm, posiadającej wywiercone otwory o średnicy 500 µm. Umieść miedzianą płytkę na stoliku chłodzącym stroną z olejem immersyjnym skierowaną w dół. Połącz tępy koniec rurki kapilarnej z rurką tigon o średnicy 0,7 mm.Połączony z drugiej strony z szklaną strzykawką o objętości dwóch mililitrów. Powoli wprowadź kapilarę szklaną do przygotowanej probówki z białkiem wiążącym lód (IBP), a następnie wciągnij tłok strzykawki, aż kapilara szklana będzie zawierać 0.1 µL roztworu białka. Rozpocznij nagrywanie wideo za pomocą oprogramowania LabVIEW.Wprowadź ostry koniec wypełnionej kapilary szklanej do jednego z otworów w miedzianej płytce na stole chłodzącym. Obserwując przez mikroskop, ostrożnie i bardzo delikatnie przebij końcem kapilary szklanej warstwę oleju immersyjnego. Naciśnij strzykawkę szklaną, aby podać niewielką ilość roztworu białka i utworzyć kroplę o średnicy 200 micron.Przykryj otwór w stopniu chłodzącym zestawem podwójnych szkiełek nakrywkowych. Naciśnij przycisk chłodzenia i ustaw temperaturę na -40°C. Początkowo, w niskich temperaturach, zazwyczaj w zakresie od -30°C do -35°C, kropla roztworu będzie przejrzysta.Kropla zmienia kolor, co wskazuje, że roztwór zamarzł natychmiast po zamrożeniu próbki. Powoli zwiększaj temperaturę, aż główna masa lodu zacznie topnieć. Stopniowy wzrost temperatury jest niezbędny, aby uniknąć jej przestrzelenia, co mogłoby doprowadzić do całkowitego stopienia próbki; przełącz na obiektyw 50x i rozpocznij topnienie lodu poprzez regulację temperatury.Ta regulacja ma charakter interaktywny, a końcowe etapy są zazwyczaj przeprowadzane w małych krokach temperaturowych o wartości 0.002 °C; proces topnienia kontynuuje się do momentu, aż pozostanie pojedynczy kryształ. Końcowy rozmiar kryształu powinien wynosić około 10 µm. Najwyższą temperaturę, przy której ustało topnienie, uznaje się za punkt topnienia, który jest precyzyjnie wyznaczany na późniejszym etapie analizy wideo.Następnie ustaw temperaturę o kilka setnych stopnia Celsjusza poniżej punktu topnienia kryształu i rozpocznij rampowanie temperatury z 10 minutowym opóźnieniem, dostosowując szybkość rampowania według uznania. W tym czasie kryształ będzie poddany działaniu ips; po zakończeniu 10-minutowego czasu ekspozycji temperatura obniży się automatycznie pod kontrolą rutyny LabVIEW. Obserwuj kształt kryształu podczas obniżania temperatury.W pewnym momencie można zaobserwować gwałtowny wyrzut kryształów lodu. Temperaturę, przy której to następuje, odnotowuje się jako temperaturę wyrzutu kryształów. Należy wykorzystać analizę wideo, aby precyzyjnie określić temperaturę topnienia oraz temperaturę wyrzutu.W pierwszej kolejności, korzystając z analizy wideo, wyznacz dokładną temperaturę topnienia. Przypomnijmy, że za temperaturę topnienia uznaje się najwyższą temperaturę, przy której proces topnienia ustał. Odnotuj tę temperaturę topnienia w arkuszu kalkulacyjnym.Następnie wyznacz dokładną temperaturę rozpadu kryształów i również ją odnotuj. Różnica między temperaturą topnienia a temperaturą krzepnięcia lub temperaturą rozpadu kryształów stanowi aktywność histerezy termicznej roztworu IBP. Aby rozpocząć pomiar aktywności TH w zależności od czasu, stop lód do momentu, aż pozostanie pojedynczy kryształ, analogicznie do czynności wykonanych wcześniej po utworzeniu kryształu.Ustaw pożądany czas opóźnienia rampy, a następnie włącz rampę. W tym przykładzie czas opóźnienia ustawiono na jedną minutę. Temperatura będzie automatycznie obniżać się w stałym tempie. Po upływie czasu opóźnienia rampy zanotuj temperaturę, w której następuje rozpad kryształu.Oblicz czas ekspozycji, który jest czasem pomiędzy formowaniem się kryształu a jego pęknięciem. Powtórz eksperyment dla różnych czasów opóźnienia i przedstaw aktywność TH jako funkcję ekspozycji. Pozwoli to ocenić zależność aktywności TH od czasu.Precyzyjna kontrola temperatury, możliwa dzięki nanolitrowemu monitorowi OSM, była kluczowa dla zapewnienia dokładnego pomiaru aktywności TH oraz jej zależności od czasu. Czas ekspozycji kryształu lodu na IPS w roztworze definiuje się jako okres od momentu powstania kryształu do gwałtownego wzrostu lodu wokół niego. Czas ekspozycji kryształów lodu na IPS miał istotny wpływ na aktywność TH.Krótkie okresy ekspozycji na IBP spowodowały niską aktywność TH w roztworze MP I-B-P-G-F-P. Aktywność TH wzrastała wraz z czasem ekspozycji na IBP, aż do osiągnięcia plateau przy czterominutowej ekspozycji na IBP przy wyższych stężeniach IBP. Plateau osiągnięto w krótszym czasie. Mikroskopia fluorescencyjna w połączeniu z urządzeniami mikroprzepływowymi wykorzystującymi podobną platformę sterowania love view może być użyta do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak akumulacja białek wiążących lód na powierzchni kryształków lodu.Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy dobrze rozumieć, jak przeprowadzić termiczny pomiar STERIS służący do oceny aktywności białek wiążących lód.

labview-operated-novel-nanoliter-osmometer-for-ice-binding-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

LabVIEW-sterowany nowatorski nanolitorowy osmometr do badań białek wiązania lodu

ITC jest potężnym narzędziem do badania wiązania liganda z jego gospodarzem. Jednak w układach złożonych kilka modeli może równie dobrze dopasowywać się do danych. Metoda opisana w niniejszej pracy umożliwia wyjaśnienie odpowiedniego modelu wiązania dla układów złożonych oraz wyznaczenie odpowiadających im parametrów termodynamicznych.

Gromadzenie zbiorów danych izotermicznej kalorymetrii miareczkowej o zmiennym stężeniu w celu określenia mechanizmów wiązania

Fluorescencyjne nanocząsteczki wytwarzane w naszym laboratorium są wykorzystywane do obrazowania stężeń jonów i strumieni jonowych w systemach biologicznych, takich jak komórki podczas sygnalizacji oraz płyn śródmiąższowy podczas homeostazy fizjologicznej.

Nanocząstki fluorescencyjne do pomiaru stężenia jonów w systemach biologicznych

W tym filmie demonstrujemy technologię interferometrii biowarstw (BLI) do wykrywania interakcji międzycząsteczkowych między ligandami a docelowymi analitami w czasie rzeczywistym. BLI mierzy zmiany we wzorze interferencji światła białego odbitego od warstwy unieruchomionych ligandów na powierzchni biosensora, gdy oddziałują one z analitami w roztworze.

Technologia interferometrii biowarstw do wykrywania interakcji między ligandem a analitem

Ten film demonstruje metodę badania interakcji białko-lek za pomocą biopanowania biblioteki peptydów wyświetlanych przez fagi T7 za pomocą biosensora QCM. Biopanowanie fagów wyświetlających określony peptyd na biosensorze QCM pozwala na specyficzną izolację peptydów o wysokim powinowactwie, a następnie sekwencjonowanie aminokwasów, co pomaga zidentyfikować określone miejsca interakcji na białku docelowym.

Biopanowanie oparte na biosensorach mikrowagi kwarcowej do badania interakcji białko-lek

Protokoły tutaj opisują kinetyczne testy interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Syntaza ATP typu F, która bierze udział w metabolizmie energii komórkowej, może być hamowana przez swoją ε podjednostka u bakterii. Dostosowaliśmy interferometrię biowarstw do badania oddziaływań kompleksu katalitycznego z hamującą domeną C-końcową ε.

Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych

Ta praca przedstawia protokół postępowania z cieczą i wprowadzania próbki do mikrokanału do analizy in situ spektrometrii mas jonów wtórnych biomolekuł białkowych w roztworze wodnym w czasie przelotu.

In Situ Charakterystyka uwodnionych białek w wodzie za pomocą SALVI i ToF-SIMS

Opisujemy tutaj protokoły pomiaru powinowactwa i kinetyki wiązania przeciwciało-antygen przy użyciu czterech powszechnie używanych platform biosensorów.

Oznaczanie kinetyki wiązania przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie przy użyciu czterech platform biosensorowych

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić szybkie, tanie testy lucyferazy przy średniej przepustowości przy użyciu lucyferazy Gaussia połączonej z insuliną jako wskaźnika wydzielania insuliny z komórek beta. Test można wykonać za pomocą większości czytników płytek luminescencyjnych i pipet wielokanałowych.

Pomiar względnego wydzielania insuliny za pomocą współwydzielanego surogatu lucyferazy

Obecny protokół opisuje nowe narzędzia do testowania wiązania SPR do badania wiązania CV-N z HA, glikoproteiną S, pokrewnymi glikanami typu hybrydowego i oligosacharydami o wysokiej zawartości mannozy. SPR służy do oznaczaniaK D do wiązania dimerycznego lub monomerycznego CV-N z tymi glikanami.

Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Poznaj pomiar histerezy termicznej białek wiążących lód za pomocą nanolitrowego osmometru sterowanego przez LabVIEW. Ta metoda umożliwia precyzyjną analizę wzrostu i topnienia kryształów lodu w roztworach białkowych.

Nowoczesny osmometr nanolitrowy sterowany programem LabVIEW do badań nad białkami wiążącymi lód

Przeglądaj więcej filmów