Laserowe uszkodzenie embrionalnych mięśni szkieletowych danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie precyzyjnie kontrolowanego uszkodzenia embrionalnych mięśni szkieletowych danio pręgowanego w celu zbadania procesów regeneracji mięśni. Osiąga się to poprzez najpierw genetyczne znakowanie pojedynczych komórek mięśni szkieletowych w sposób mozaikowy. Następnie wybrane zarodki osadzane są na szkiełku w agros zaopatrzonym w trika.

Następnie zarodki umieszcza się pod mikroskopem, a docelowe komórki mięśniowe są uszkadzane za pomocą lasera mikropunktowego. Na koniec zarodki są usuwane z gospodarstwa rolnego i pozostawiane do regeneracji przez określony czas. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zmiany w organizacji miofibrylarnej poprzez uszkodzenie laserowe, a następnie mikroskopię konfokalną.

Metoda, którą dzisiaj prezentujemy, jest istotna w dziedzinie regeneracji mięśni, ale może być również stosowana do innych paradygmatów regeneracji, takich jak regeneracja płetw i ryba danio pręgowany Aby znakować komórki, wstrzykuje się zarodki w jednym stadium komórkowym z plazmidem kodującym GFP lub dowolnym białkiem fuzyjnym GFP pod kontrolą wszechobecnego lub specyficznego dla typów komórek promotora. Podczas rozwoju GFP ulega ekspresji w sposób mozaikowy w tkankach. W tym przykładzie wstrzyknięty plazmid powoduje, że pojedyncze komórki mięśniowe wyrażają alfa-aktynę w GFP.

Pod kontrolą promotora beta aktyny inkubować zarodki do 28 godzin po zapłodnieniu. Następnie pod mikroskopem preparacyjnym wyposażonym w lampę fluorescencyjną do wykrywania aktyniny. Klony GFP używają kleszczy do powlekania zarodków, wytwarzają 1% niskotemperaturowy topnienie, agros 10% roztwór trica z E trzy pożywki, gotując 100 miligramów agros w 10 mililitrach pożywki E trzy.

Pozostaw roztwór do ostygnięcia do 39 stopni Celsjusza i dodaj trikę do końcowego stężenia 10%Następnie przygotuj szkiełko mikroskopowe z pierścieniem z wazeliny. Po dodaniu roztworu agro o niskiej temperaturze topnienia do pierścienia wazeliny pod mikroskopem, należy osadzić pojedynczy zarodek w agrosie o niskiej temperaturze topnienia w pierścieniu wazeliny. Za pomocą szkiełka nakrywkowego delikatnie przykryj zarodek i równolegle do szkiełka nakrywkowego, aby uzyskać doskonały widok boczny.

Aby przygotować laser mikropunktowy, zapoznaj się z instrukcją obsługi lasera mikropunktowego, aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące konfiguracji i użytkowania lasera. W połączeniu z mikroskopem wybierz barwnik laserowy CUMERIN four 40 do generowania wiązki laserowej o długości fali 435 nanometrów. Za pomocą suwaka tłumienia wyreguluj moc lasera.

Moc lasera potrzebna do świętowania powinna być wystarczająco silna, aby rozbić szklaną powierzchnię jednym impulsem. Zapoznaj się z instrukcjami producenta, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat regulacji lasera za pomocą redle zainstalowanego w okularze mikroskopu. Skoncentruj się na regionie lub komórce, która Cię interesuje.

Następnie ustaw światło potrzebne do wizualizacji próbki. Następnie podaj jeden lub kilka impulsów światła laserowego do docelowego obszaru, w zależności od pożądanego stopnia uszkodzenia. Natychmiast po zranieniu użyj pipety, aby delikatnie usunąć zarodek z agros i umieść go z powrotem w wodzie jajecznej w celu odzyskania sprawności.

Po wyzdrowieniu przez pożądany okres czasu utrwal zarodek, wykonaj immunohistochemię i przeanalizuj za pomocą mikroskopii konfokalnej. Uraz za pośrednictwem lasera został wykonany na unieruchomionych jednodniowych zarodkach Barwienia Acton pokazują, że kilka impulsów laserowych może wygenerować małą ranę, łatwo rozpoznawalną przez uszkodzone miofibryle, które wyglądają jak cewki aktonowe. Większa liczba impulsów laserowych spowoduje masywnie uszkodzone somity, w których większość włókienek mięśniowych jest niszczona po odzyskaniu przez pięć godzin.

Barwienie aktyny pokazuje, że fibryle mięśniowe w małych miejscach urazów odzyskały się i rozciągają się na szerokość roztoczy. Okazuje się, że szybkość powrotu do zdrowia zależy od wielkości uszkodzonej tkanki, przy czym małe urazy goją się szybciej niż większe. Dodatkowe informacje można uzyskać, barwiąc uszkodzoną tkankę przeciwciałem przeciwko SERP one, które jest zlokalizowane wzdłuż rekonwalescencji mięśni mięśniowych.

W obrębie uszkodzonych komórek mięśniowych w miejscu uszkodzenia lasera oznaczonego czerwoną śrubą, ablowana komórka ma zmniejszoną fluorescencję GFP. Rysunek ten pokazuje, że po fazie rekonwalescencji po urazie i barwieniu przeciwciałami, komórka docelowa pokazana przez białą strzałkę jest rozpoznawana na podstawie wzoru otaczających ją komórek znakowanych mozaiką, jak wskazano żółtymi strzałkami. Pokazane tutaj podejście pozwala prześledzić w czasie, w jaki sposób uraz za pośrednictwem lasera wpływa na semickie komórki mięśniowe.

Komórki są rejestrowane na żywo, aby ocenić natychmiastowe efekty w ciągu pierwszych minut po urazie laserowym. Następnie można wykonać nagrania poklatkowe dla dowolnego przedziału czasu, aby dokładnie śledzić, jak komórki przemieszczają się wokół ran. W tym przykładzie obrazowania na żywo strzałka wskazuje, gdzie laser uszkadza mięsień semicki przy 30 HPF.

Końce uszkodzonej komórki mięśniowej powoli cofają się w kierunku granic roztoczy po lewej i prawej stronie czarnej strzałki. Metoda ta może być stosowana w połączeniu z innymi technikami, takimi jak Q-R-T-P-C-R lub Western Blot w celu określenia zmian w ekspresji genów lub ekspresji białek. Ale można również przeprowadzić analizę poklatkową w celu zbadania, na przykład, odpowiedzi immunologicznej po uszkodzeniu narządów.

Tak więc ta metoda ma naprawdę wiele możliwych zastosowań.