Name: Izolacja normalnych i związanych z rakiem fibroblastów ze świeżych tkanek za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj metodę izolacji normalnych i związanych z rakiem fibroblastów ze świeżych tkanek myszy i ludzi za pomocą FACS z użyciem markera PDGFRα. Technika zapewnia wysoką czystość populacji komórkowych bez zanieczyszczeń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Yitzchaka Oschry’emu oraz dr Orit Sagi-Asif za pomoc przy sortowaniu FACS. Badania te zostały sfinansowane z grantów przyznanych NE w ramach Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umowy o grant nr &deg; [276890], z Israel Cancer Association (#20110078) oraz z Israel Cancer Research Fund (Grant na rozwój kariery badawczej).

1. Disekcja tkanki gruczołu mlekowego lub skóry myszy
<ol>
	<li>Przed wypreparowaniem pożądanej tkanki z myszy należy przygotować następujące materiały i odczynniki:
	 Materiały: 
	<ul>
		<li>Narzędzia chirurgiczne (umyte detergentem, a następnie zanurzone w 70% etanolu).</li>
		<li>Powierzchnia styropianowa do ułożenia myszy podczas sekcji.</li>
		<li>Szpilki lub igły do unieruchomienia myszy podczas sekcji.</li>
		<li>Szklany słoik z pokrywką do trawienia, zawierający magnetyczny mieszadło (autoklawowany).</li>
		<li>Kąpiel wodna w temperaturze 37 °C, zawierająca zanurzalne mieszadło magnetyczne i wystarczającą ilość wody, aby słoik do trawienia był całkowicie zanurzony podczas ustawienia go na mieszadle.</li>
	</ul>
	 Odczynniki:
	<ul>
		<li>Bufor FACS I (4 °C): Dulbecco's Phosphate Buffered Saline CMF (bez wapnia i magnezu) + 0.5% BSA</li>
		<li>Roztwór kolagenazy (przygotowany bezpośrednio przed użyciem): 
		0.05 g Kolagenazy II 
		0.05 g Kolagenazy IV 
		0.01 g Deoksrybonukleazy 
		20 ml buforu FACS I. Roztwór kolagenazy należy przechowywać w lodzie do momentu użycia.</li>
		<li>PharmLyse (odczynnik lityczny z chlorkiem amonu).</li>
		<li>Bufor FACS II: Dulbecco's Phosphate Buffered Saline CMF + 1% FCS.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Wypreparowanie gruczołów mlekowych (patrz również17).
	<ul>
		<li>Eutanazję samic myszy przeprowadzić poprzez inhalację dwutlenkiem węgla (CO2).</li>
		<li>Na powierzchni styropianowej ułożyć mysz na grzbiecie i mocno przybić wszystkie cztery kończyny za pomocą igieł 25 G (Rycina 1A). Myszy obficie spryskać 70% etanolem.</li>
		<li>Za pomocą pęsety unieść skórę brzuszną w linii środkowej i wykonać niewielkie nacięcie ostrymi nożyczkami.</li>
		<li>Zacząwszy od nacięcia, rozciąć skórę aż do szyi zwierzęcia, unikając przebicia jamy brzusznej lub klatki piersiowej.</li>
		<li>Rozciąć skórę na tylnych łapach od nacięcia w linii środkowej w kierunku łapy, tworząc kształt litery „Y”.</li>
		<li>Odciągnąć skórę od ciała myszy i przybić ją, odsłaniając gruczoły mlekowe przymocowane do wewnętrznej strony skóry (Rycina 1B).</li>
		<li>Użyć patyczków higienicznych do delikatnego oddzielenia gruczołów mlekowych od skóry, jednocześnie przecinając tkankę łączną małymi, ostrymi nożyczkami, aby oddzielić gruczoł mlekowy w kierunku kręgosłupa myszy.</li>
		<li>Do niniejszego protokołu najlepiej nadają się gruczoły brzuszne (#4, 5). Można również użyć 2go gruczołu mlekowego, należy jednak pamiętać, że gruczoły te znajdują się anatomicznie w bliskim sąsiedztwie mięśnia piersiowego, który może być trudny do oddzielenia, co może prowadzić do uzyskania komórek z mieszanych tkanek.</li>
		<li>Uwaga: Podczas wypreparowywania tkanki nowotworowej zaleca się usunięcie obszarów martwiczych.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Wypreparowanie tkanki skórnej: Najprostszym sposobem na uzyskanie tkanki skórnej bez konieczności usuwania sierści jest wykorzystanie uszu myszy. Jeśli wymagana jest większa ilość tkanki, można ogolić tułów myszy i wypreparować skórę.
	<ul>
		<li>Eutanazję myszy przeprowadzić poprzez inhalację CO2.</li>
		<li>Za pomocą ostrych nożyczek odciąć oba uszy i natychmiast umieścić je w słoiku do trawienia zawierającym niewielką objętość (~0.5 ml) PBS w lodzie.</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek gruczołu mlekowego/skóry
<ul>
	<li>Umieścić gruczoły mlekowe/skórę w pojemniku do trawienia zawierającym niewielką objętość PBS w lodzie. Jeśli tkanka jest zakrwawiona, przemyć ją dwukrotnie PBS, a następnie odlać nadmiar PBS.</li>
	<li>Dokładnie posiekać za pomocą zakrzywionych nożyczek.</li>
	<li>Dodać 20 ml roztworu kolagenazy (Uwaga: taka ilość roztworu kolagenazy pozwoli na efektywną dysocjację około 5 g tkanki gruczołu mlekowego lub nowotworowej oraz uszu z maksymalnie 15 myszy).</li>
	<li>Natychmiast umieścić na mieszadle w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 15 min przy średniej prędkości mieszania.</li>
</ul>
Uwaga: optymalne czasy inkubacji mogą się różnić w przypadku trawienia innych tkanek.
<ul>
	<li>Aby zatrzymać reakcję, należy dodać 30 ml zimnego DMEM + 10% FCS.</li>
	<li>Mieszaninę tkanki i medium należy przefiltrować przez sitko komórkowe 70 μm umieszczone na probówce stożkowej 50 ml.</li>
	<li>Probówkę stożkową wiruje się przez 5 min przy 450 x g w temperaturze 4 °C.</li>
</ul>
3. Lizy erytrocytów
Uwaga: ten krok nie jest konieczny, jeśli przed uśmierceniem myszy przeprowadzono perfuzję serca roztworem PBS.
<ul>
	<li>Odssać nadsącz za pomocą pipety szklanej podłączonej do próżni, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.</li>
	<li>W celu lizy RBC zawiesić ponownie osad komórkowy w 10 ml roztworu PharmLyse i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zneutralizować roztwór PharmLyse, dodając około 40 ml buforu FACS I.</li>
	<li>Wirować probówkę stożkową z komórkami przez 5 min przy 450 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odssać nadsącz.</li>
</ul>
4. Blokowanie endogennego Fc
<ul>
	<li>Opcjonalnie: przeprowadź zliczanie komórek, aby określić odpowiednią objętość dla kolejnych etapów.</li>
	<li>Resuspenduj komórki w 1-3 ml buforu FACS I (zależnie od liczby komórek oraz ilości przeciwciał, którą zamierzasz zastosować).</li>
	<li>Dodaj FcBlock (anty-mysie CD16/CD32) do uzyskania rozcieńczenia 1:50 (10 μg/ml) i inkubuj na lodzie przez 10-20'. 
	Nie ma potrzeby wypłukiwania FcBlock.</li>
</ul>
5. Barwienie
<ul>
	<li>Przenieś alikwoty o objętości 100 μl do probówek typu Eppendorf, aby służyły jako kontrola niebarwiona oraz kontrole jednobarwne (zależnie od liczby użytych przeciwciał fluorescencyjnych).</li>
	<li>Aby znakować fibroblasty: dodaj przeciwciało anty-PDGFRα (bezpośrednio sprzężone z fluorophorem) w rozcieńczeniu 1:50 (10 μg/ml).</li>
	<li>Aby znakować inne populacje komórek (np. komórki odpornościowe, makrofagi, komórki śródbłonka itp.): dodaj odpowiednie przeciwciała sprzężone z fluoresceiną przeciwko markerom powierzchniowym w rozcieńczeniu 1:50.</li>
</ul>
Uwaga: choć PDGFRα jest wiarygodnym markerem fibroblastów, zaleca się zastosowanie przeciwciał przeciwko komórkom odpornościowym oraz komórkom nabłonkowym, aby wykluczyć populacje podwójnie dodatnie, a tym samym zwiększyć czystość wyizolowanych fibroblastów.
<ul>
	<li>Do każdej z probówek Eppendorf z kontrolami jednobarwnymi dodać 2 μl każdego przeciwciała.</li>
	<li>Inkubować komórki z przeciwciałami przez 1 hr w ciemności, w temperaturze 4 °C (na lodzie).</li>
	<li>W celu przemycia: napełnić probówki buforem FACS I i wirować przez 5 min przy 450 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odssać nadsącz, resuspender komórki w buforze FACS I do stężenia około 2 x 106 cells/ml lub do stężenia najbardziej odpowiedniego dla sortowania przy użyciu dostępnego sortera FACS.</li>
</ul>
Opcjonalnie: Na czas sortowania komórki można resuspenderować w buforze FACS II. Może to poprawić żywotność komórek. Należy jednak pamiętać i sprawdzić, czy ekspozycja na czynniki zawarte w surowicy nie wpływa na ekspresję genów.
<ul>
	<li>Przenieś oznakowane komórki do probówek do FACS z filtrem w pokrywce: przefiltruj komórki do probówek, aby zapobiec powstawaniu agregatów komórkowych.</li>
	<li>W celu wykluczenia martwych komórek, dodaj do próbek (z wyjątkiem kontroli niebarwionej) 7AAD (0.5 μg/ml) lub jodek propidyny (PI).</li>
</ul>
Uwaga: Aby uniknąć marnowania komórek, można dodać 7AAD/PI do niebarwionej próbki po zarejestrowaniu jej w FACS i ponownie wykorzystać ją jako kontrolę z samym 7AAD.
<ul>
	<li>Przechowywać próbki w lodzie podczas analizy.</li>
</ul>
6. Izolacja komórek metodą FACS
(Uwaga: ta część protokołu wymaga wcześniejszej wiedzy z zakresu obsługi sortera FACS, np. BD FACS AriaII, lub pomocy doświadczonego technika).
<ul>
	<li>Za pomocą oprogramowania sortera FACS (BD FACSDiva) przygotuj odpowiednie wykresy analizy w celu oceny rozproszenia przedniego (FSC), rozproszenia bocznego (SSC), 7AAD, FITC, PE oraz każdego innego fluoroforu użytego do znakowania komórek (Rysunek 2).</li>
	<li>Przed załadowaniem każdej próbki do sortera komórek krótko wymieszaj ją w wortexie, aby resuspenderć komórki.</li>
	<li>Rozpocznij od analizy próbki niezbarwionej w celu ustawienia bramkowania dla całkowitej populacji komórek, odseparowania debris komórkowego oraz określenia autofluorescencji lub tła barwienia.</li>
	<li>Przeanalizuj próbkę niezbarwioną + 7AAD, aby wyznaczyć i obramować populację żywych komórek z całkowitej populacji komórek.</li>
	<li>Przeanalizuj każdą kontrolę jednobarwną, aby wyznaczyć i skalibrować parametry, takie jak kompensacja.</li>
	<li>Przeanalizuj próbkę zbarwioną, aby zdefiniować położenie bramek do sortowania.</li>
	<li>Po ustawieniu parametrów i bramek dla pożądanych populacji komórek rozpocznij sortowanie znakowanych populacji komórek do probótek typu Eppendorf lub 15 ml probótek stożkowych zawierających pożywkę hodowlaną lub bufor do lizy RNA (taki jak bufor RLT lub Trizol).</li>
</ul>
Uwaga: W przypadku sortowania dużej liczby komórek nie zaleca się sortowania bezpośrednio do buforu do lizy RNA, ponieważ duża objętość płynu osłonowego towarzyszącego komórkom rozcieńczy bufor do lizy i zmniejszy wydajność.
<ul>
	<li>Odwirować komórki niezwłocznie po zakończeniu sortowania i przenieść je do świeżej pożywki lub buforu do lizy RNA, w zależności od celu eksperymentu.</li>
	<li>W przypadku sortowania w celu hodowli wyizolowanych komórek, należy przeprowadzić sortowanie w warunkach sterylnych. Aby uzyskać lepszy odzysk komórek, należy użyć pożywki DMEM bez czerwieni fenolowej + 5% FCS zamiast buforu FACS buffer II i zbierać komórki do pożywki hodowlanej z 20% FCS.</li>
	<li>Podczas hodowli posortowanych fibroblastów należy je zawsze wysiewać na płytki pokryte kolagenem, nigdy bezpośrednio na plastik, ponieważ prowadzi to do aktywacji fibroblastów i zmian w ich ekspresji genów.</li>
</ul>

<ol><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li>
<li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+stromal+fibroblasts+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors.</a> Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).</li>
<li>Ostman, A., Augsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+and+tumor+growth--bystanders+turning+into+key+players%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players.</a> Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).</li>
<li>Allinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+tumor+microenvironment+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer.</a> Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li>
<li>Orimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1%2FCXCL12+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li>
<li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+interactions+with+the+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner.</a> Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li>
<li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li>
<li>Neumann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+and+passaging+alters+gene+expression+pattern+and+proliferation+rate+in+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+research+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts.</a> Arthritis research & therapy. 12, R83Forthcoming.</li>
<li>Sherr, C. J., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+mitotic+clock+or+culture+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: mitotic clock or culture shock.</a> Cell. 102, 407-410 (2000).</li>
<li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+complexity+in+breast+cancer+predicts+overall+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).</li>
<li>Pahler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+tumor-promoting+inflammation%3A+impairment+of+macrophage+recruitment+evokes+a+compensatory+neutrophil+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response.</a> Neoplasia. 10, 329-340 (2008).</li>
<li>Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+paracrine+PDGF+signaling+in+the+proangiogenic+tumor+stroma+revealed+by+pharmacological+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting.</a> PLoS Med. 5, e19(2008).</li>
<li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+myofibroblasts+contribute+to+the+mesenchymal+stem+cell+niche+and+promote+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth.</a> Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).</li>
<li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Mammary+Gland+Development+and+Function+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models.</a> J. Vis. Exp. (53), e2828(2011).</li>
<li>Xouri, G., Christian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+function+of+tumor+stroma+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Origin and function of tumor stroma fibroblasts.</a> Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Choć eksperymenty przeprowadzane w hodowlach tkankowych mogą dostarczać cennych informacji i sugerować zasady funkcjonalne, które można zweryfikować in vivo, wiadomo, że w komórkach hodowlanych dochodzi do znacznych zmian w ekspresji genów11,12. Aby uniknąć etapu hodowli tkankowej podczas profilowania ekspresji genów w fibroblastach, opracowaliśmy protokół umożliwiający izolację fibroblastów prawidłowych, jak i fibroblastów związanych z nowotworem (CAF) z tkanki świeżej myszy lub człowieka. Protokół t...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Przemysł biotechnologiczny</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenaza II</td><td>Worthington</td><td>LS4176</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenaza IV</td><td>Worthington</td><td>LS4188</td><td></td></tr><tr><td>Deoksiryb nukleaza </td><td>Worthington</td><td>LS2007</td><td></td></tr><tr><td>PharmLyse</td><td>BD</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek 70 μm &amp;mu;m</td><td>SPL</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciało anty-mysie CD16/CD32</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Za pomocą sondy (7AAD)</td><td>e-Bioscience</td><td>00-6993-50</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD140a-PE (PDGFRa)</td><td>e-Bioscience</td><td>12-1401-81</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie F4/80-FITC</td><td>Cederlane</td><td>CL8940F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>31053</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (facs)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) stanowią najliczniejszy typ komórek w zrębie guza wielu nowotworów, w szczególności w raku piersi, a ich znaczna obecność często wiąże się ze złym rokowaniem1,2. CAFs są aktywowaną subpopulacją fibroblastów zrębowych, z których wiele wykazuje ekspresję markera miofibroblastów α-SMA3. CAFs wywodzą się z lokalnych fibroblastów tkankowych, a także z komórek pochodzących z szpiku kostnego rekrutowanych do rozwijającego się guza, przyjmując fenotyp CAF pod wpływem mikrośrodowiska nowotworowego4. Wykazano, że CAFs wspomagają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację promującą proliferację komórek nowotworowych, angiogenezę oraz inwazję5-8. Udowodniliśmy, że CAFs nasilają wzrost guza poprzez pośredniczenie w zapaleniu promującym nowotwór, zaczynając od najwcześniejszych etapów przednowotworowych9. Pomimo rosnących dowodów na kluczową rolę CAFs w ułatwianiu wzrostu guza, badanie tych komórek pozostaje wyzwaniem ze względu na brak specyficznych markerów CAF oraz ogromną heterogeniczność tych komórek, przy czym w mikrośrodowisku guza współistnieje wiele podtypów10. Ponadto badanie fibroblastów in vitro jest utrudnione przez fakt, że ich profil ekspresji genów często ulega zmianie w hodwlach tkankowych11,12. Aby rozwiązać ten problem i umożliwić obiektywne profilowanie ekspresji genów fibroblastów z tkanki świeżej myszy i człowieka, opracowaliśmy metodę opartą na wcześniejszych protokołach sortowania komórek metodą fluorescencji (FACS)13,14. Nasze podejście polega na wykorzystaniu PDGFRα jako markera powierzchniowego do izolacji fibroblastów z tkanki świeżej myszy i człowieka. PDGFRα jest obficie ekspresowany zarówno przez normalne fibroblasty, jak i przez CAFs9,15. Metoda ta pozwala na izolację czystych populacji normalnych fibroblastów i CAFs, w tym, ale nie ograniczając się do, aktywowanych miofibroblastów α-SMA+. Izolowane fibroblasty mogą być następnie wykorzystane do charakterystyki i porównania ewolucji ekspresji genów, która zachodzi w CAFs podczas tumorigenzy. Rzeczywiście, my oraz inni autorzy zgłosiliśmy profilowanie ekspresji fibroblastów izolowanych poprzez sortowanie komórek16. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do izolacji i profilowania silnie wzbogaconych populacji fibroblastów z tkanek skóry, gruczołów mlekowych, trzustki i płuc. Ponadto nasza metoda pozwala również na hodowlę sortowanych komórek w celu przeprowadzenia eksperymentów funkcjonalnych i uniknięcia kontaminacji komórkami nowotworowymi, co często stanowi dużą przeszkodę przy próbach hodowli CAFs.

Wykorzystanie PDGFRα jako markera fibroblastów pozwala na wyizolowanie silnie wzbogaconych populacji fibroblastów tkankowych. Poziom czystości po sortowaniu wynosił 99%, co określono w analizie po sortowaniu (Rysunek 2A). Szacowanie procentowego udziału zanieczyszczających komórek innych niż fibroblasty na podstawie względnej ekspresji specyficznych dla komórek genów kontrolnych (Rysunek 2B) zazwyczaj wykazuje zanieczyszczenie na poziomie 0,1-0,6%. Taki poziom czystości umożliwia wysokie...

Fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) wspomagają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację promującą proliferację, angiogenezę i stan zapalny. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji czystych populacji prawidłowych fibroblastów oraz CAFs z pobranych na świeżo tkanek mysich i ludzkich za pomocą sortowania komórek, wykorzystując PDGFRα jako marker powierzchniowy.

Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Fibroblasty związane z nowotworami (CAFs) są najważniejszym typem komórek w zrębie nowotworowym wielu typów raka, w szczególności w raku piersi, a ich ...

Celem niniejszej procedury jest wyizolowanie fibroblastów prawidłowych oraz związanych z nowotworem z tkanek świeżych. Jest to realizowane poprzez wstępne wycięcie gruczołów mlekowych. Drugim krokiem jest przygotowanie gruczołów mlekowych, zawiesin pojedynczych komórek, a następnie poddanie komórek inkubacji z przeciwciałami specyficznymi dla fibroblastów, jak również z przeciwciałami specyficznymi dla innych populacji komórek.Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie sortowania komórek metodą fluorescencyjnie aktywowanej segregacji komórek (FACS). Ostatecznie, profilowanie ekspresji specyficznych markerów w posortowanych populacjach komórek za pomocą qRT-PCR jest wykorzystywane do oceny czystości tych populacji. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami izolacji fibroblastów jest możliwość wyizolowania większości fibroblastów tkankowych przy minimalnym zanieczyszczeniu komórkami odpornościowymi lub nabłonkowymi, przy jednoczesnym uniknięciu etapu hodowli tkankowej, który mógłby zmienić profil ekspresji genów fibroblastów.Zastosowanie tej techniki rozciąga się na wszystkie metody leczenia raka piersi, ponieważ zrozumienie i identyfikacja celów molekularnych może zapewnić nowe podejście kombinatoryczne w walce z progresją raka piersi, wydłużyć przeżywalność pacjentek i ostatecznie pomóc w ulepszeniu oraz dostosowaniu indywidualnych opcji terapeutycznych. Poza Państwa nadzorem, dr Lena, kierownik laboratorium, zaprezentuje procedurę. Aby rozpocząć tę procedurę, ułożyć uśpioną samicę myszy na plecach na powierzchni styropianowej i za pomocą igieł 25 G mocno przypiąć wszystkie cztery kończyny.Obficie spryskać mysz 70% etanolem, używając pęsety. Odciągnąć skórę brzucha w linii pośrodkowej i wykonać niewielkie nacięcie ostrymi nożyczkami, zaczynając od miejsca nacięcia. Rozciąć skórę aż do szyi zwierzęcia, unikając przebicia jam brzusznej i klatki piersiowej.Nacinaj skórę na tylnych kończynach od nacięcia w linii środkowej w kierunku nogi, tak aby uzyskać kształt litery Y. Następnie odsun skórę od ciała myszy i przypnij ją, odsłaniając gruczoły mleczne przymocowane do wewnętrznej strony skóry. Jednym z najtrudniejszych elementów tej procedury jest unikanie pobrania tkanki mięśniowej.Aby uniknąć tego problemu, pobiorę jedynie czwarty i piąty gruczoł mlekowy, pomijając drugi, który znajduje się w bliskim sąsiedztwie tkanki mięśniowej. Za pomocą patyczków higienicznych ostrożnie oddziel gruczoł mlekowy od skóry, jednocześnie wycinając tkankę łączną małymi, ostrymi nożyczkami, aby odseparować gruczoł mlekowy w kierunku kręgosłupa myszy; usuń wszelkie znalezione obszary martwicze. Umieść wypreparowane gruczoły mlekowe w PBS na lodzie.Najprostszym sposobem na pozyskanie tkanki skóry bez konieczności usuwania owłosienia jest wykorzystanie uszu myszy. Za pomocą ostrych nożyczek odetnij oba uszy od uśmierconej myszy. Umieść uszy natychmiast w słoiku do trawienia zawierającym niewielką objętość PBS w lodzie.Aby przygotować zawiesinę pojedynczych komórek gruczołu mlekowego, należy użyć zakrzywionych nożyczek do dokładnego posiekania gruczołów mlekowych w słoiku do trawienia zawierającym niewielką objętość PBS w lodzie, a następnie dodać 20 milliliters roztworu kolagenazy do posiekanego tkanek. Taka ilość roztworu kolagenazy pozwoli na efektywną dysocjację około pięciu gramów tkanki gruczołu mlekowego lub tkanki nowotworowej z maksymalnie 15 myszy. Próbkę należy niezwłocznie umieścić na mieszadle magnetycznym w kąpieli wodnej o temperaturze 37 degree Celsius i inkubować przez 15 minut przy średniej prędkości mieszania, a następnie zatrzymać reakcję, dodając 30 milliliters zimnego DMEM z dodatkiem 10% FCS.Następnie przecedź mieszaninę tkanki i pożywki przez sitko komórkowe o oczkach 70 micron placed on top of a 50 milliliter conical tube. Wirowarkuj probówkę stożkową przez pięć minut przy 450 ×g w temperaturze 4°C. Jeśli myszy nie zostały poddane perfuzji serca roztworem PBS przed uśmierceniem, przed barwieniem immunologicznym konieczna będzie liza erytrocytów w próbce.Przed znakowaniem fibroblastów i innych populacji komórek należy zablokować endogenne receptory Fc. Resuspenduj komórki w 1–3 ml buforu FAX 1, a następnie dodaj blokadę Fc w rozcieńczeniu 1:50 i inkubuj na lodzie przez 10–20 minut. Nie ma potrzeby wypłukiwania blokady Fc; przenieś 100 µl aliquotów komórek do probówek typu Eppendorf, które posłużą jako kontrola niezbarwiona oraz kontrole jednobarwne.W zależności od liczby przeciwciał fluorescencyjnych użytych w tym pokazie, dwa przeciwciała fluorescencyjne zostaną wykorzystane do znakowania fibroblastów przeciwko receptorowi PDGF alfa. Przeciwciało to jest bezpośrednio sprzężone z fluoforem w rozcieńczeniu 1:50 i należy je dodać do próbki do sortowania, a także do kontroli jednobarwnych służących do znakowania innych populacji komórek. Następnie należy dodać odpowiednie przeciwciała sprzężone z fluorochromami przeciwko markerom powierzchniowym, również w rozcieńczeniu 1:50.Zaleca się dodać przeciwciała również do odpowiednich probówek kontroli jednobarwnej, w tym przeciwciała przeciwko komórkom odpornościowym i komórkom nabłonkowym, aby wykluczyć populacje podwójnie dodatnie i tym samym zwiększyć czystość wyizolowanych fibroblastów. Następnie inkubować komórki z przeciwciałami przez jedną godzinę w ciemności w temperaturze 0°C. Po godzinie wypłukać komórki, napełniając probówki buforem fax buffer one i wirując przez pięć minut przy 450 ×g w temperaturze 4°C. Odessać nadsącz i resuspendować komórki w buforze fax buffer one do stężenia najodpowiedniejszego dla sortowania przy użyciu planowanego sortera FACS. Przenieść znakowane komórki do probówek FACS z filtrami i przefiltrować komórki do probówek, aby zapobiec powstawaniu skupisk komórek i wyeliminować martwe komórki.Dodaj DPI do wszystkich próbek z wyjątkiem kontroli niebarwionej. Próbki należy przechowywać w lodzie podczas analizy FACS. Aby rozpocząć tę procedurę, należy użyć oprogramowania sortera FACS w celu skonfigurowania ustawień fluorescencji, parametrów akwizycji oraz ustawień kropli hydrodynamicznej.Krótko wymieszaj każdą próbkę na wortexie, aby resuspenderować komórki przed załadowaniem ich do sortera komórkowego. Rozpocznij od analizy niebarwionej próbki w celu ustawienia bramkowania dla całkowitej populacji komórek, aby odsiać detrytus komórkowy oraz określić autofluorescencję lub barwienie tła. Następnie przeanalizuj niebarwioną próbkę z dodatkiem DPI, aby określić i wyznaczyć bramkę dla populacji żywych komórek z całkowitej populacji komórek.Przeanalizuj każdą pojedynczą kontrolę koloru, aby określić i skalibrować parametry, takie jak kompensacja. Przeanalizuj próbkę z barwieniem, aby zdefiniować położenie bramek dla sortowania. Po ustawieniu parametrów i bramek dla pożądanych populacji komórek, rozpocznij sortowanie znakowanych populacji komórek do probówek typu eph lub 15 mililitrowych probówek stożkowych zawierających pożywkę hodowlaną lub bufor do lizy RNA.Niezwłocznie po zakończeniu sortowania należy odwirować komórki i przenieść je do świeżej pożywki lub buforu do lizy RNA. W zależności od celu eksperymentu, jeśli posortowane fibroblasty mają być hodowane, należy je zawsze wysiewać na płytki powlekane kolagenem, a nigdy bezpośrednio na plastik, ponieważ spowodowałoby to aktywację fibroblastów i w konsekwencji zmiany w ich ekspresji genów. Wykorzystanie receptora PDGF alfa jako markera fibroblastów pozwala na wyizolowanie populacji fibroblastów tkankowych o wysokim stopniu wzbogacenia.W tym przykładzie zawiesiny pojedynczych komórek gruczołów mlekowych myszy barwiono przeciwciałami przeciwko receptorowi PDGF alfa oraz F4/80. Wykres sortowania FACS przedstawiono na lewym panelu, gdzie P2 jest bramką fibroblastów, a P4 bramką makrofagów. Przeprowadzono analizę po sortowaniu w celu określenia czystości wyizolowanych fibroblastów, przedstawioną na prawym panelu, oraz makrofagów, przedstawioną na środkowym panelu.Kolejna rycina przedstawia analizę czystości pochodzenia za pomocą Q-R-T-P-C-R swoistych dla komórek genów kontrolnych dla fibroblastów, komórek odpornościowych oraz komórek nabłonkowych. Wyniki znormalizowano względem dwóch genów housekeepingowych, ga, DH i mgus, a względną ekspresję względem gap. DH. Takie analizy zazwyczaj wykazują zanieczyszczenie na poziomie od 0,1 do 0,6%.Taki poziom czystości umożliwia wysokiej jakości profilowanie transkryptomu wyizolowanych fibroblastów. Ilościowe oznaczenie ekspresji receptora PDGF alpha w nieposortowanej populacji fibroblastów gruczołu piersiowego wskazuje, że około 85% wszystkich fibroblastów tkankowych w gruczołach piersiowych wykazuje pozytywny wynik w kierunku receptora PDGF alpha. Wyizolowałem.Fibroblasty można hodować bezpośrednio po sortowaniu, jednak mogą one potrzebować kilku dni na regenerację. Niezbędne jest przeprowadzanie wszystkich dalszych eksperymentów na komórkach o niskim numerze pasażu, ponieważ pierwotne fibroblasty ulegają starzeniu podczas propagacji. W hodowli, po opanowaniu tej techniki, można ją przeprowadzić w cztery godziny, jeśli jest ona wykonana prawidłowo.Jeśli rozdzielone komórki mają być hodowane, należy pamiętać o przeprowadzeniu całej procedury w warunkach sterylnych. W tym materiale nie przeprowadzono sortowania sterylnego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wyizolować silnie wzbogaconą populację fibroblastów ze świeżej tkanki.

isolation-normal-cancer-associated-fibroblasts-from-fresh-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja fibroblastów normalnych i związanych z rakiem z świeżych tkanek metodą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS)

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek śródbłonka limfatycznego, wyściełających ludzkie malformacje limfatyczne, torbielowate naczynia i napletki za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Późniejsza hodowla komórkowa i ekspansja tych komórek pozwala na nowy poziom wyrafinowania eksperymentalnego w badaniach genetycznych, proteomicznych, funkcjonalnych i różnicowania komórek.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka limfatycznego za pomocą wieloparametrowego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Tutaj przedstawiono protokół izolacji i tworzenia pierwotnych kultur fibroblastów/miofibroblastów (MF) z zamrożonych komórek tkanki żołądka, jelita cienkiego i okrężnicy o fenotypie MF. Komórki te wyrażają CD90, α-SMA i wimentynę. MF mogą być używane do różnych testów funkcjonalnych, w tym aktywności enzymatycznej i produkcji cytokin.

Izolacja fibroblastów/miofibroblastów CD 90+ z ludzkich mrożonych próbek przewodu pokarmowego

Ten manuskrypt opisuje oparty na FACS protokół izolacji brodawkowatych i siateczkowatych fibroblastów z ludzkiej skóry. Omija hodowlę in vitro, która była nieunikniona w przypadku powszechnie stosowanego protokołu izolacji za pomocą kultur eksplantatów. Emanujące podzbiory fibroblastów są funkcjonalnie odrębne i wykazują zróżnicowaną ekspresję i lokalizację genów w skórze właściwej.

Izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Przedstawiamy protokół do izolacji pierwotnych dorosłych fibroblastów w łatwy, szybki i niezawodny sposób, możliwy do wykonania przez początkujących (np. studentów). Zabieg łączy enzymatyczne trawienie tkanek i mechaniczne mieszanie z falami ultradźwiękowymi w celu uzyskania pierwotnych fibroblastów. Protokół można łatwo dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych (np. tkanki ludzkiej).

Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Ten artykuł ma na celu dostarczenie protokołu izolacji i hodowli pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu potrójnie ujemnego raka piersi oraz ich zastosowanie w badaniach przedklinicznych nowych nanocząstek zaprojektowanych do celowania w mikrośrodowisko guza.

Izolacja pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu raka piersi w celu zbadania celowanych nanocząstek

Precyzyjna identyfikacja fibro-adipogennych komórek progenitorowych (FAP) i komórek macierzystych mięśni (MuSCs) jest kluczowa dla badania ich funkcji biologicznej w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące izolacji, oczyszczania i hodowli FAP i MuSC z mięśni dorosłych myszy.

FACS-Izolacja i hodowla włóknisto-adipogennych progenitorów i mięśniowych komórek macierzystych z niezakłóconych i uszkodzonych mięśni szkieletowych myszy

Wielokomórkowe sferoidy guza 3D zostały przygotowane z komórkami gruczolakoraka płuc, fibroblastami i monocytami, a następnie wyizolowano fibroblasty związane z rakiem (CAF) z tych sferoidów. Izolowane CAF porównano z normalnymi fibroblastami w celu oceny zdrowia mitochondriów poprzez badanie potencjału transbłonowego mitochondriów, reaktywnych form tlenu i aktywności enzymatycznej.

Ocena zdrowia mitochondriów w fibroblastach związanych z rakiem wyizolowanych z wielokomórkowych sferoid 3D guza płuc

Protokół ten zapewnia kompleksową procedurę izolacji, ekspansji i unieśmiertelnienia fibroblastów z radykalnej prostatektomii. Ponadto opisano testy opracowane w celu oceny funkcjonalnych skutków przesłuchu fibroblast-komórki nowotworowe, wykorzystujące zarówno leczenie pożywką kondycjonowaną, jak i kokulturę.

Izolacja, hodowla i charakterystyka fibroblastów związanych z rakiem prostaty

Poznaj metodę izolacji normalnych i związanych z rakiem fibroblastów ze świeżych tkanek myszy i ludzi za pomocą FACS z użyciem markera PDGFRα. Technika zapewnia wysoką czystość populacji komórkowych bez zanieczyszczeń.

Izolacja normalnych i związanych z rakiem fibroblastów ze świeżych tkanek za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Przeglądaj więcej filmów