Izolacja normalnych i związanych z rakiem fibroblastów ze świeżych tkanek za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)

Fibroblasty związane z rakiem (CAF) ułatwiają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację, która sprzyja proliferacji, angiogenezie i zapaleniu. Tutaj opisujemy metodę izolowania czystych populacji normalnych fibroblastów i CAF ze świeżych tkanek myszy i ludzi poprzez sortowanie komórek, przy użyciu PDGFRα jako markera powierzchniowego.

Celem tej procedury jest wyizolowanie prawidłowych i związanych z rakiem fibroblastów ze świeżych tkanek. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie gruczołów sutkowych. Drugim krokiem jest przygotowanie gruczołów sutkowych, zawiesin pojedynczych komórek, następnej komórki podtrzymywanej przez fibroblasty specyficzne przeciwciała, a także przeciwciała specyficzne dla innych populacji komórek.

Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie aktywowanego fluorescencją pozyskiwania komórek lub faktów. Ostatecznie do oceny czystości posortowanych populacji komórek stosuje się profilowanie ekspresji Q-R-T-P-C-R specyficznych markerów wyrażonych w posortowanych populacjach komórek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami izolacji fibroblastów jest to, że umożliwia ona izolację większości fibroblastów tkankowych przy minimalnym zanieczyszczeniu przez komórki odpornościowe lub komórki nabłonkowe, przy jednoczesnym uniknięciu etapu hodowli tkankowej, który może zmienić profil ekspresji genów fibroblastów.

Implikacje tej techniki rozciągają się na całą terapię raka piersi, ponieważ zrozumienie i identyfikacja celów molekularnych może zapewnić nowatorskie podejście Combinator do zwalczania progresji raka piersi, wydłużenia przeżycia pacjentek i ostatecznie pomóc w ulepszeniu i dostosowaniu zindywidualizowanych opcji terapeutycznych. Oprócz twojego oka, dr Lena sam, kierownik laboratorium będzie demonstrować procedurę, aby rozpocząć tę procedurę. Umieść uśpioną samicę myszy na plecach na styropianowej powierzchni i użyj igieł o rozmiarze 25, aby mocno przypiąć wszystkie cztery kończyny.

Spryskaj mysz obficie 70% etanolem za pomocą kleszczy. Podciągnij skórę brzucha w linii środkowej i wykonaj małe nacięcie ostrymi nożyczkami, zaczynając od nacięcia. Przeciąć skórę aż do szyi zwierzęcia, unikając nakłuwania jamy piersiowej jamy brzusznej.

Przetnij skórę na tylnych nogach od nacięcia w linii środkowej w kierunku nogi, uzyskując kształt litery Y. Następnie odciągnij skórę od ciała myszy i przypnij, odsłaniając gruczoły sutkowe przyczepione do spodu skóry. Jedną z najbardziej problematycznych rzeczy w tej procedurze jest unikanie przyjmowania tkanki mięśniowej.

Aby uniknąć tego problemu, wezmę tylko czwartą i piątą gruczoł sutkowy, a nie drugą, która znajduje się w bliskiej odległości od tkanki mięśniowej. Użyj patyczków Q, aby delikatnie oddzielić gruczoł pamięci od skóry, jednocześnie przecinając tkankę spojówkową małymi ostrymi nożyczkami, aby oddzielić gruczoł pamięci w kierunku kręgosłupa myszy, usunąć wszelkie znalezione martwicze obszary. Umieść wypreparowane gruczoły pamięci w PBS na lodzie.

Najprostszym sposobem na uzyskanie tkanki skórnej bez konieczności zajmowania się depilacją jest użycie uszu myszy. Użyj ostrych nożyczek, aby odciąć oba uszy uśpionej myszy. Umieść uszy natychmiast w słoiku do trawienia zawierającym niewielką objętość PBS na lodzie.

Aby przygotować zawiesinę jednokomórkową gruczołu mlekowego, użyj zakrzywionych nożyczek, aby dokładnie zmielić gruczoły sutkowe w słoiku do trawienia zawierającym niewielką objętość PBS na lodzie, dodaj 20 mililitrów roztworu kolagenazy do tkanki mielonej. Ta ilość roztworu kolagenazy skutecznie dysocjuje około pięciu gramów pamięci lub tkanki nowotworowej i uszu od maksymalnie 15 myszy. Umieścić natychmiast na płytce mieszającej w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubować przez 15 minut, mieszając ze średnią szybkością, aby zatrzymać reakcję przy 30 mililitrach zimnego DMEM plus 10% FCS.

Następnie przecedź mieszaninę tkanek i pożywki przez sitko o wielkości 70 mikronów umieszczone na 50-mililitrowej stożkowej probówce. Wirować stożkową probówkę przez pięć minut w temperaturze 450 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jeśli myszy nie były perfundowane sercem PBS przed uśmierceniem, czerwone krwinki w próbce będą musiały leżeć przed barwieniem immunologicznym.

Komórki muszą być zablokowane dla endogennego FC przed znakowaniem fibroblastów i innych populacji komórek. Resus zawiesić komórki w jednym do trzech mililitrów bufora faksu jeden, a następnie dodać blok FC w rozcieńczeniu od jednego do 50 inkubować na lodzie przez 10 do 20 minut. Nie ma potrzeby zmywania 100-mikrolitrowych porcji komórek z transferem blokowym FC do probówek orph, które mają być używane jako niebarwione kontrole i kontrole pojedynczego koloru.

W zależności od liczby przeciwciał fluorescencyjnych użytych w tej demonstracji, dwa przeciwciała fluorescencyjne zostaną użyte do znakowania fibroblastów w receptorze alfa anty PDGF. Jest to bezpośrednio sprzężone z fluorem w rozcieńczeniu od jednego do 50 do próbki sortującej, a także z pojedynczymi kontrolkami koloru w celu oznaczenia innych populacji komórek. Dodać odpowiednie fluorescencyjnie sprzężone przeciwciała do markerów powierzchniowych, również w rozcieńczeniu od 1 do 50.

Zaleca się dodanie przeciwciał również do odpowiednich jednokolorowych probówek kontrolnych, w tym przeciwciał dla komórek odpornościowych i komórek nabłonkowych, w celu wykluczenia wszelkich podwójnie dodatnich populacji, a tym samym zwiększenia czystości izolowanych fibroblastów. Następnie inkubować komórki z przeciwciałami przez godzinę na lodzie w ciemności, po godzinie umyć komórki, wypełniając probówki pierwszym buforem faksu i wirując przez pięć minut w temperaturze 450 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza, amerykańskie komórki aspiracyjne i resus w pierwszym buforze faksu do stężenia najbardziej odpowiedniego do sortowania za pomocą sortera faksów, który ma być użyty. Przenieś oznakowane komórki do probówek faksowych z pokrywkami filtrującymi i przefiltruj komórki do probówek, aby zapobiec zbrylaniu się komórek, grudkom w celu wykluczenia martwych komórek.

DPI dla wszystkich próbek z wyjątkiem niebarwionej kontroli. Próbki należy przechowywać na lodzie podczas analizy faksowej. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj oprogramowania do sortowania faktów, aby przygotować ustawienie fluorescencji, ustawienie akwizycji i ustawienie kropli hydrodynamicznej.

Krótko zawiruj każdą próbkę, aby ponownie zawiesić komórki przed załadowaniem do sortownika komórek. Zacznij od przeanalizowania niebarwionej próbki, aby ustawić bramkowanie dla całej populacji komórek, aby odciąć resztki komórek i określić autofluorescencję lub barwienie tła. Następnie przeanalizuj niebarwioną próbkę oraz DPI, aby określić i wyprowadzić populację żywych komórek z całej populacji komórek.

Analizuj każdą pojedynczą kontrolkę koloru, aby określić i skalibrować parametry, takie jak kompensacja. Przeanalizuj próbkę plamy, aby określić położenie bramek do sortowania. Po ustawieniu parametrów i bramek dla żądanych populacji komórek rozpocznij sortowanie znakowanych populacji komórek do probówek eph lub 15-mililitrowych stożkowych probówek zawierających pożywkę hodowlaną lub bufor do lizy RNA.

Natychmiast po zakończeniu sortowania należy odwirować komórki i przenieść je do świeżej pożywki lub buforu do lizy RNA. W zależności od celu eksperymentu, jeśli są sortowane, fibroblasty mają być hodowane, zawsze płytka na płytkach pokrytych kolagenem, nigdy nie płytka bezpośrednio na plastiku, ponieważ spowoduje to aktywację fibroblastów prowadzącą do zmian w ekspresji ich genów. Zastosowanie receptora alfa PDGF jako markera fibroblastów prowadzi do izolacji, wysoce wzbogaconych populacji fibroblastów tkankowych.

W tym przykładzie zawiesiny pojedynczych komórek mysich gruczołów sutkowych wybarwiono przeciwciałami PDGF alfa i F four 80. Wykres sortowania faktów jest pokazany w lewym panelu, gdzie P dwa to bramka fibroblastów, a P cztery to bramka makrofagów. Przeprowadzono analizę poźródłową w celu określenia czystości posortowanych fibroblastów pokazanych w prawym panelu i makrofagów pokazanych w środkowym panelu.

Następny rysunek przedstawia analizę czystości pozyskiwania przez Q-R-T-P-C-R specyficznych dla komórek genów kontrolnych dla fibroblastów, komórek odpornościowych i komórek nabłonkowych. Wyniki znormalizowano do dwóch genów porządkowych, ga, DH i mgus, oraz względnej ekspresji do luki. Wykazano, że takie analizy zwykle wykazują zanieczyszczenie od 0,1 do 0,6%.

Ten poziom czystości pozwala na wysokiej jakości profilowanie transkryptomu izolowanych fibroblastów. Kwantyfikacja ekspresji receptora alfa PDGF w niesortowanej populacji fibroblastów sutka wskazuje, że około 85% całkowitych fibroblastów tkankowych w gruczołach sutkowych to receptory alfa PDGF. Odizolowałem się.

Fibroblasty można hodować bezpośrednio po sortowaniu, ale może to wymagać kilku dni, aby dojść do siebie. Konieczne jest przeprowadzenie wszystkich dalszych eksperymentów z niskimi komórkami masującymi, ponieważ pierwotne fibroblasty ulegają starzeniu podczas rozmnażania. W kulturze, Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Jeśli trzecie komórki są przeznaczone do hodowli, są one importowane, aby pamiętać o wykonaniu całej procedury w sterylnych warunkach. W tej sesji nie wykonaliśmy sterylnego sortowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować wysoko wzbogaconą populację fibroblastów ze świeżej tkanki.