Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Celem niniejszej procedury jest wyizolowanie fibroblastów prawidłowych oraz związanych z nowotworem z tkanek świeżych. Jest to realizowane poprzez wstępne wycięcie gruczołów mlekowych. Drugim krokiem jest przygotowanie gruczołów mlekowych, zawiesin pojedynczych komórek, a następnie poddanie komórek inkubacji z przeciwciałami specyficznymi dla fibroblastów, jak również z przeciwciałami specyficznymi dla innych populacji komórek.

Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie sortowania komórek metodą fluorescencyjnie aktywowanej segregacji komórek (FACS). Ostatecznie, profilowanie ekspresji specyficznych markerów w posortowanych populacjach komórek za pomocą qRT-PCR jest wykorzystywane do oceny czystości tych populacji. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami izolacji fibroblastów jest możliwość wyizolowania większości fibroblastów tkankowych przy minimalnym zanieczyszczeniu komórkami odpornościowymi lub nabłonkowymi, przy jednoczesnym uniknięciu etapu hodowli tkankowej, który mógłby zmienić profil ekspresji genów fibroblastów.

Zastosowanie tej techniki rozciąga się na wszystkie metody leczenia raka piersi, ponieważ zrozumienie i identyfikacja celów molekularnych może zapewnić nowe podejście kombinatoryczne w walce z progresją raka piersi, wydłużyć przeżywalność pacjentek i ostatecznie pomóc w ulepszeniu oraz dostosowaniu indywidualnych opcji terapeutycznych. Poza Państwa nadzorem, dr Lena, kierownik laboratorium, zaprezentuje procedurę. Aby rozpocząć tę procedurę, ułożyć uśpioną samicę myszy na plecach na powierzchni styropianowej i za pomocą igieł 25 G mocno przypiąć wszystkie cztery kończyny.

Obficie spryskać mysz 70% etanolem, używając pęsety. Odciągnąć skórę brzucha w linii pośrodkowej i wykonać niewielkie nacięcie ostrymi nożyczkami, zaczynając od miejsca nacięcia. Rozciąć skórę aż do szyi zwierzęcia, unikając przebicia jam brzusznej i klatki piersiowej.

Nacinaj skórę na tylnych kończynach od nacięcia w linii środkowej w kierunku nogi, tak aby uzyskać kształt litery Y. Następnie odsun skórę od ciała myszy i przypnij ją, odsłaniając gruczoły mleczne przymocowane do wewnętrznej strony skóry. Jednym z najtrudniejszych elementów tej procedury jest unikanie pobrania tkanki mięśniowej.

Aby uniknąć tego problemu, pobiorę jedynie czwarty i piąty gruczoł mlekowy, pomijając drugi, który znajduje się w bliskim sąsiedztwie tkanki mięśniowej. Za pomocą patyczków higienicznych ostrożnie oddziel gruczoł mlekowy od skóry, jednocześnie wycinając tkankę łączną małymi, ostrymi nożyczkami, aby odseparować gruczoł mlekowy w kierunku kręgosłupa myszy; usuń wszelkie znalezione obszary martwicze. Umieść wypreparowane gruczoły mlekowe w PBS na lodzie.

Najprostszym sposobem na pozyskanie tkanki skóry bez konieczności usuwania owłosienia jest wykorzystanie uszu myszy. Za pomocą ostrych nożyczek odetnij oba uszy od uśmierconej myszy. Umieść uszy natychmiast w słoiku do trawienia zawierającym niewielką objętość PBS w lodzie.

Aby przygotować zawiesinę pojedynczych komórek gruczołu mlekowego, należy użyć zakrzywionych nożyczek do dokładnego posiekania gruczołów mlekowych w słoiku do trawienia zawierającym niewielką objętość PBS w lodzie, a następnie dodać 20 milliliters roztworu kolagenazy do posiekanego tkanek. Taka ilość roztworu kolagenazy pozwoli na efektywną dysocjację około pięciu gramów tkanki gruczołu mlekowego lub tkanki nowotworowej z maksymalnie 15 myszy. Próbkę należy niezwłocznie umieścić na mieszadle magnetycznym w kąpieli wodnej o temperaturze 37 degree Celsius i inkubować przez 15 minut przy średniej prędkości mieszania, a następnie zatrzymać reakcję, dodając 30 milliliters zimnego DMEM z dodatkiem 10% FCS.

Następnie przecedź mieszaninę tkanki i pożywki przez sitko komórkowe o oczkach 70 micron placed on top of a 50 milliliter conical tube. Wirowarkuj probówkę stożkową przez pięć minut przy 450 ×g w temperaturze 4°C. Jeśli myszy nie zostały poddane perfuzji serca roztworem PBS przed uśmierceniem, przed barwieniem immunologicznym konieczna będzie liza erytrocytów w próbce.

Przed znakowaniem fibroblastów i innych populacji komórek należy zablokować endogenne receptory Fc. Resuspenduj komórki w 1–3 ml buforu FAX 1, a następnie dodaj blokadę Fc w rozcieńczeniu 1:50 i inkubuj na lodzie przez 10–20 minut. Nie ma potrzeby wypłukiwania blokady Fc; przenieś 100 µl aliquotów komórek do probówek typu Eppendorf, które posłużą jako kontrola niezbarwiona oraz kontrole jednobarwne.

W zależności od liczby przeciwciał fluorescencyjnych użytych w tym pokazie, dwa przeciwciała fluorescencyjne zostaną wykorzystane do znakowania fibroblastów przeciwko receptorowi PDGF alfa. Przeciwciało to jest bezpośrednio sprzężone z fluoforem w rozcieńczeniu 1:50 i należy je dodać do próbki do sortowania, a także do kontroli jednobarwnych służących do znakowania innych populacji komórek. Następnie należy dodać odpowiednie przeciwciała sprzężone z fluorochromami przeciwko markerom powierzchniowym, również w rozcieńczeniu 1:50.

Zaleca się dodać przeciwciała również do odpowiednich probówek kontroli jednobarwnej, w tym przeciwciała przeciwko komórkom odpornościowym i komórkom nabłonkowym, aby wykluczyć populacje podwójnie dodatnie i tym samym zwiększyć czystość wyizolowanych fibroblastów. Następnie inkubować komórki z przeciwciałami przez jedną godzinę w ciemności w temperaturze 0°C. Po godzinie wypłukać komórki, napełniając probówki buforem fax buffer one i wirując przez pięć minut przy 450 ×g w temperaturze 4°C. Odessać nadsącz i resuspendować komórki w buforze fax buffer one do stężenia najodpowiedniejszego dla sortowania przy użyciu planowanego sortera FACS. Przenieść znakowane komórki do probówek FACS z filtrami i przefiltrować komórki do probówek, aby zapobiec powstawaniu skupisk komórek i wyeliminować martwe komórki.

Dodaj DPI do wszystkich próbek z wyjątkiem kontroli niebarwionej. Próbki należy przechowywać w lodzie podczas analizy FACS. Aby rozpocząć tę procedurę, należy użyć oprogramowania sortera FACS w celu skonfigurowania ustawień fluorescencji, parametrów akwizycji oraz ustawień kropli hydrodynamicznej.

Krótko wymieszaj każdą próbkę na wortexie, aby resuspenderować komórki przed załadowaniem ich do sortera komórkowego. Rozpocznij od analizy niebarwionej próbki w celu ustawienia bramkowania dla całkowitej populacji komórek, aby odsiać detrytus komórkowy oraz określić autofluorescencję lub barwienie tła. Następnie przeanalizuj niebarwioną próbkę z dodatkiem DPI, aby określić i wyznaczyć bramkę dla populacji żywych komórek z całkowitej populacji komórek.

Przeanalizuj każdą pojedynczą kontrolę koloru, aby określić i skalibrować parametry, takie jak kompensacja. Przeanalizuj próbkę z barwieniem, aby zdefiniować położenie bramek dla sortowania. Po ustawieniu parametrów i bramek dla pożądanych populacji komórek, rozpocznij sortowanie znakowanych populacji komórek do probówek typu eph lub 15 mililitrowych probówek stożkowych zawierających pożywkę hodowlaną lub bufor do lizy RNA.

Niezwłocznie po zakończeniu sortowania należy odwirować komórki i przenieść je do świeżej pożywki lub buforu do lizy RNA. W zależności od celu eksperymentu, jeśli posortowane fibroblasty mają być hodowane, należy je zawsze wysiewać na płytki powlekane kolagenem, a nigdy bezpośrednio na plastik, ponieważ spowodowałoby to aktywację fibroblastów i w konsekwencji zmiany w ich ekspresji genów. Wykorzystanie receptora PDGF alfa jako markera fibroblastów pozwala na wyizolowanie populacji fibroblastów tkankowych o wysokim stopniu wzbogacenia.

W tym przykładzie zawiesiny pojedynczych komórek gruczołów mlekowych myszy barwiono przeciwciałami przeciwko receptorowi PDGF alfa oraz F4/80. Wykres sortowania FACS przedstawiono na lewym panelu, gdzie P2 jest bramką fibroblastów, a P4 bramką makrofagów. Przeprowadzono analizę po sortowaniu w celu określenia czystości wyizolowanych fibroblastów, przedstawioną na prawym panelu, oraz makrofagów, przedstawioną na środkowym panelu.

Kolejna rycina przedstawia analizę czystości pochodzenia za pomocą Q-R-T-P-C-R swoistych dla komórek genów kontrolnych dla fibroblastów, komórek odpornościowych oraz komórek nabłonkowych. Wyniki znormalizowano względem dwóch genów housekeepingowych, ga, DH i mgus, a względną ekspresję względem gap. DH. Takie analizy zazwyczaj wykazują zanieczyszczenie na poziomie od 0,1 do 0,6%.

Taki poziom czystości umożliwia wysokiej jakości profilowanie transkryptomu wyizolowanych fibroblastów. Ilościowe oznaczenie ekspresji receptora PDGF alpha w nieposortowanej populacji fibroblastów gruczołu piersiowego wskazuje, że około 85% wszystkich fibroblastów tkankowych w gruczołach piersiowych wykazuje pozytywny wynik w kierunku receptora PDGF alpha. Wyizolowałem.

Fibroblasty można hodować bezpośrednio po sortowaniu, jednak mogą one potrzebować kilku dni na regenerację. Niezbędne jest przeprowadzanie wszystkich dalszych eksperymentów na komórkach o niskim numerze pasażu, ponieważ pierwotne fibroblasty ulegają starzeniu podczas propagacji. W hodowli, po opanowaniu tej techniki, można ją przeprowadzić w cztery godziny, jeśli jest ona wykonana prawidłowo.

Jeśli rozdzielone komórki mają być hodowane, należy pamiętać o przeprowadzeniu całej procedury w warunkach sterylnych. W tym materiale nie przeprowadzono sortowania sterylnego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wyizolować silnie wzbogaconą populację fibroblastów ze świeżej tkanki.