Name: Ex vivo Obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w nabłonku nerwowym myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo pojedynczych podziałów komórkowych w nabłonku nerwowym myszy E8.5. Technika ta umożliwia badanie dynamiki rozwoju nerwowego w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt badawczy ten był wspierany przez dodatek ARRA, 5 R01 NS056380. Dodatkowe wsparcie zapewniły Viral Vector Core oraz Microscopy Core w ramach grantu Emory Neuroscience NINDS Core Facilities, P30NS055077. Dziękujemy Emory Transgenic Mouse and Gene Targeting Core za wyprowadzenie linii myszy z GENSAT; Gregowi Pazourowi za stabilną linię komórkową SSTR3-GFP IMCD3 oraz Bradleyowi Yoderowi za lentiwirusem wprowadzony konstrukt Sstr3-GFP. Przeciwciała monoklonalne uzyskano z Developmental Studies Hybridoma Bank, opracowanego pod auspicjami NICHD i utrzymywanego przez The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. Wszystkie procedury z użyciem zwierząt zostały zatwierdzone przez IACUC oraz Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego na Emory University.

Dorosłe myszy uśmiercano poprzez mechaniczną dyslokację szyi. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez IACUC oraz Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego na Uniwersytecie Emory.
1. Generowanie embrionów
<ol>
	<li>Skrzyżuj linię Cre indukowaną tamoksyfenem, CAGGCreER, z linią reporterową dsRedCre (Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy) (Rysunek 1) 5,6. Aby monitorować względny czas odpowiedzi na Shh w komórkach potomnych, skrzyżuj linię CAGGCreER i linię dsRed z transgenicznymi myszami BAC Olig2-eGFP (Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat) (Rysunek 1) 7,8.</li>
	<li>Rozpuść tamoksyfen w 100% etanolu i wykonaj iniekcję dostronną w dawce 2,5 mg tamoksyfenu na 40 g masy ciała u ciężarnych samic w 6,5 dniu rozwoju embrionalnego (E6.5), aby zindukować ekspresję Cre i znakowanie dsRed w niewielkiej podgrupie komórek.</li>
	<li>Po 48 godzinach wyizoluj embriony, zidentyfikuj embriony wykazujące pozytywną ekspresję dsRed za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, przenieś je do naczynia hodowlanego i obserwuj podziały pojedynczych komórek podczas obrazowania ex vivo (patrz poniżej).</li>
</ol>
2. Hodowla całych zarodków myszy
<ol>
	<li>Przeprowadzić mikrodysekcję zarodków w stadium E8.5 w uprzednio ogrzanym medium płuczącym zawierającym DMEM/F12 (1:1) uzupełnionym o 10% surowicy z cieląt noworodkowych oraz 1% penicyliny/streptomycyny (P/S) 9.</li>
	<li>Bezpośrednio po dysekcji umieścić zarodki na stoliku grzewczym o temperaturze 37 °C pod mikroskopem fluorescencyjnym i zidentyfikować osobniki GFP i/lub dsRed pozytywne (patrz poniżej).</li>
	<li>Przenieść do 2 zarodki do kropli 500 μl uprzednio zrównoważonego medium hodowlanego zawierającego 50% surowicy szczurzej od samca Sprague-Dawley oraz 50% DMEM/F12 (1:1) bez czerwieni fenolowej, uzupełnionego o L-glutaminę oraz 1% 1 M HEPES w 0,85% NaCl i P/S 9.</li>
	<li>Nanieść cienką warstwę (0,1 cm) zrównoważonego lekkiego oleju mineralnego na powierzchnię medium, aby zapobiec parowaniu, a następnie przenieść naczynie hodowlane z zarodkami do inkubatora w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.</li>
</ol>
3. Infekcja wirusowa
<ol>
	<li>W celu oznakowania rzęsek w neuroepitelium, dodać 5-10 μl lentiwirusa Sstr3-GFP, odpowiadającego około 2 milionom wirionów, do 500 μl ustabilizowanej kropli pożywki hodowlanej zawierającej zarodek w stadium E8.5.</li>
	<li>Po 18 h hodowli przenieść zainfekowany zarodek do kilku kropel medium piorącego, aby wypłukać wirusa, a następnie przygotować przekrój cewy nerwowej.</li>
</ol>
4. Przygotowanie przekrojów rurki neuralnej do obrazowania na żywo
<ol>
	<li>Wypreparować cewę nerwową zarodka w stadium E8.5 w uprzednio ogrzanym medium płuczącym, używając mikro-noża o rozmiarze 0,025 mm, na szalce pokrytej 1% agarem.</li>
	<li>Umieścić wyizolowaną cewę nerwową stroną brzuszną do dołu w kropli 150 μl zrównoważonego medium hodowlanego bez czerwieni fenolowej na szalce z dnem szklanym pokrytym poli-L-lizyną o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Nanieść niewielkie ilości mieszaniny w stosunku 1:1, przygotowanej ze 100% czystej wazeliny oraz roztopionego wosku świecowego (świeca z IKEA), wokół zamocowanej cewy nerwowej, a następnie delikatnie docisnąć wąskim fragmentem szkiełka nakrywowego, aby unieruchomić próbkę.</li>
	<li>Przykryć szalkę cienką warstwą (~0,1 cm) zrównoważonego lekkiego oleju mineralnego (Rycina 2).</li>
</ol>
5. Obrazowanie na żywo i konfokalna mikroskopia poklatkowa
<ol>
	<li>Umieść naczynie pod konfokalnym odwróconym mikroskopem skaningowym Nikon A1R wyposażonym w komorę środowiskową regulującą temperaturę, ustawioną na 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Użyj obiektywu immersyjnego 60x do rejestracji rzęsek znakowanych GFP oraz komórek wykazujących ekspresję dsRed, natomiast obiektywu immersyjnego 40x do monitorowania komórek wykazujących ekspresję Olig2-GFP i dsRed.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie NIS Elements, aby ustawić warunki obrazowania time-lapse. Co 10 min wykonuj stosy obrazów z (z-stacks) do 25 μm z odstępem 1,5 μm (obiektyw 40x) oraz do 8 μm z odstępem 0,4 μm (obiektyw 60x). Wykorzystaj długości fal wzbudzenia 488 i 561 nm oraz kanał transmitowany, jeśli jest wymagany. Rejestruj obrazy o rozmiarze 512 x 512. Zdefiniuj kilka obszarów zainteresowania (ROI), aby przeprowadzić jednoczesną rejestrację. 
	Optymalną ekspozycję na moc lasera i jasność obrazu uzyskano poprzez zastosowanie niskiej intensywności lasera (do 11% dla mCherry 561; do 4,5% dla EGFP 405/488), szybkości skanowania 1, uśredniania linii 2 oraz odpowiedniego rozmiaru otworu blendy (61 μm dla dsRED; 28,1 μm dla Olig2; 72 μm dla SSTR3GFP; 61,3 μm dla dsRED i SSTR3GFP; 58 μm dla dsRED i Olig2). Zastosowanie genetycznie zakodowanych reporterów fluorescencyjnych pozwoliło na detekcję jasności przy niskiej mocy lasera.</li>
	<li>Przeanalizuj zarejestrowane dane przy użyciu oprogramowania do rekonstrukcji 3D Imaris.</li>
</ol>
6. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Utwierdź zarodki lub wyizolowane cewy nerwowe w 4% paraformaldehydzie / 0,1 M buforze fosforanowym na lodzie (4 °C) przez 1 h w szklanym naczyniu.</li>
	<li>Przemywaj próbki przez 2 h w PBS na lodzie (4 °C) (wymieniając PBS kilka razy), a następnie umieść w 30% sacharozie / 0,1 M buforze fosforanowym na noc lub do momentu opadnięcia zarodków na dno.</li>
	<li>Zatop w OCT, zamroź na suchym lodzie i przechowuj w -80 °C. Wykonaj cięcia na kriostacie (10 mm).</li>
	<li>Przemywaj preparaty przez 10 min w roztworze do płukania zawierającym 1% inaktywowanego ciepłem surowicy owczej i 0,1% Triton X-100 w PBS.</li>
	<li>Rozcieńcz przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze do płukania w następujących stężeniach: szczurze monoklonalne anty-RFP (5F8) 1:200; królicze surowica anty-Arl13b 1:1500 oraz mysie monoklonalne anty-Arl13b 1:5 (295B/54); królicze anty-Olig2 1:300; mysie monoklonalne Pax6, Shh oraz Nkx2.2 – wszystkie 1:10; oraz królicze poliklonalne Ki67 1:500. Nałóż około 150 μl na każdy preparat w płaskiej, nawilżonej komorze, przykryj parafilmem, aby zapobiec wysychaniu, i pozostaw na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemywaj preparaty w roztworze do płukania trzykrotnie, po 20 min każdego razem, w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńcz przeciwciała wtórne Alexa Fluor 488, 568, 350 w roztworach do płukania w stężeniu 1:200. Użyj Hoechst 1:3 000 lub TO-PRO-3 1:500 do barwienia jąder. Nałóż 150 μl na preparat, pozostaw na 1 h w temperaturze pokojowej w nawilżonej komorze, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Przemywaj preparaty w roztworze do płukania dwukrotnie, po 30 min każdego razu, w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zamknij preparaty w 80% odczynniku antyprzeblawającym ProLong Gold i przejrzyj w ciągu 24 h.</li>
</ol>

<ol><li>Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+neural+tube%3A+motor+neuron+induction+by+diffusible+factors+from+notochord+and+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate.</a> Cell. 73, 673-686 (1993).</li>
<li>Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+induces+the+differentiation+of+ventral+forebrain+neurons%3A+A+common+signal+for+ventral+patterning+within+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube.</a> Cell. 81, 747-756 (1995).</li>
<li>Briscoe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeodomain+Protein+Code+Specifies+Progenitor+Cell+Identity+and+Neuronal+Fate+in+the+Ventral+Neural+Tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube.</a> Cell. 101, 435-445 (2000).</li>
<li>Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ciliary+localization+sequences+within+the+third+intracellular+loop+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors.</a> Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).</li>
<li>Vintersten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+red%3A+red+fluorescent+protein+expression+in+mouse+ES+cells%2C+embryos%2C+and+adult+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals.</a> Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).</li>
<li>Hayashi, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recombination+in+diverse+tissue+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre%3A+a+tool+for+temporally+regulated+gene+activation%2Finactivation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse.</a> Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).</li>
<li>Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olig2%2B+neuroepithelial+motoneuron+progenitors+are+not+multipotent+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).</li>
<li>Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li>
<li>Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+individual+cell+divisions+in+mouse+neuroepithelium+shows+asymmetry+in+cilium+formation+and+Sonic+hedgehog+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response.</a> Cilia. 1 (6), In Press (2012).</li>
<li>Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mouse+development+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Nasz system ex vivo umożliwia bezpośrednią obserwację podziałów pojedynczych komórek w rozwijającym się neuroepitelium w czasie rzeczywistym. Przykładowo, zbadaliśmy podziały komórkowe w embrionalnej rurce nerwowej myszy i monitorowaliśmy tworzenie się rzęsek lub odpowiedź na Shh. Potwierdziliśmy, że nasze wyniki obrazowania (n = 24) są zgodne z wynikami uzyskanymi z utrwalonych przekrojów (n = 178), co wskazuje, że zastosowana technika dostarcza danych istotnych fizjologicznie.
<p class="...

<table><tbody><tr><td>linia Z/RED (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005438</td><td></td></tr><tr><td>Linia Olig2-eGFP (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd)</td><td>MMRRC,</td><td>010555-UCD</td><td></td></tr><tr><td>CAGGCreER</td><td>Jackson Laboratory</td><td>003724</td><td></td></tr><tr><td>Tamoksifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>Surowica z nowonarodzonego cielęcia</td><td>Lonza</td><td>14-416F</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Surowica szczura SD, samiec</td><td>Harlan Bioproducts</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>1M Hepes</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>Lekki olej mineralny </td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>lentiwirus Sstr3-GFP </td><td>Emory Viral Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikronóż, rozmiar 0,025 mm </td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>62091</td><td></td></tr><tr><td>szalka z szklanym dnem o średnicy 35 mm powleczona poli-L-lizyną</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>100% wazelina kosmetyczna</td><td>Kroger</td><td>FL9958c</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop konfokalny z laserowym skanowaniem A1R</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Imaris 3D</td><td>Bitplane AG</td><td>Imaris 7.2.3</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie surowica owcza</td><td>Invitrogen</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy</td><td>Wytwarzany w laboratorium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szczurze przeciwciało monoklonalne anty-RFP (5F8) </td><td>Chromotek</td><td>110411</td><td></td></tr><tr><td>Surowica królicza anty-Arl13b</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mysie przeciwciało monoklonalne anty-Arl13b 1:5</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało królicze przeciwko Olig2</td><td>Chemicon</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciała monoklonalne Pax6</td><td>Bank hybrydomów rozwojowych</td><td>Pax6</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała monoklonalne mysie przeciwko Shh</td><td>Bank hybrydomów rozwojowych</td><td>5E1</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciała monoklonalne Nkx2.2</td><td>Bank hybrydom powiązań rozwojowych</td><td>74.5A5</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało poliklonalne Ki67</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Sondy molekularne</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568</td><td>Sondy molekularne</td><td>A11031</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350</td><td>Sondy molekularne</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst</td><td>Fisher</td><td>AC22989</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>odczyn przeciwwyblakający ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Opracowaliśmy system integrujący obrazowanie na żywo markerów fluorescencyjnych z hodowlą skrawków neuroepithelium embrionalnego myszy. Wykorzystaliśmy istniejące linie myszy do genetycznego śledzenia linii komórkowych: linię Cre indukowaną tamoksyfenem oraz linię reporterową Cre wykazującą ekspresję dsRed po rekombinacji zapośredniczonej przez Cre. Stosując stosunkowo niskie stężenie tamoksyfenu, byliśmy w stanie zindukować rekombinację w niewielkiej liczbie komórek, co pozwoliło nam śledzić podziały poszczególnych komórek. Dodatkowo obserwowaliśmy odpowiedź transkrypcyjną na sygnalizację Sonic Hedgehog (Shh) przy użyciu transgenicznej linii Olig2-eGFP 1-3 oraz monitorowaliśmy tworzenie rzęsek poprzez zakażenie hodowanego skrawka wirusem wykazującym ekspresję markera rzęsek, Sstr3-GFP 4. W celu obrazowania neuroepithelium pobraliśmy embriony w stadium E8.5, wyizolowaliśmy rurkę neuralną, umieściliśmy skrawkę neuralną w odpowiednich warunkach hodowlanych w komorze obrazującej i przeprowadziliśmy konfokalne obrazowanie time-lapse. Nasza metoda obrazowania na żywo ex vivo umożliwia śledzenie pojedynczych podziałów komórkowych w celu oceny względnego czasu tworzenia rzęsek pierwotnych i odpowiedzi na Shh w sposób fizjologicznie istotny. Metoda ta może być łatwo adaptowana przy użyciu różnych markerów fluorescencyjnych i dostarcza badaczom narzędzi do monitorowania zachowania komórek in situ i w czasie rzeczywistym.

Przeprowadziliśmy tutaj obrazowanie na żywo ex vivo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelu myszy w stadium E8.5. Aby oznakować poszczególne komórki, indukowaliśmy rekombinazę Cre w podgrupie komórek zawierających linię reporterową Cre, która po rekombinacji wykazuje ekspresję dsRed 5,6(Rysunek 3A). Dzięki temu 48 h później mogliśmy obserwować podziały pojedynczych komórek podczas obrazowania ex vivo (Rysunki 4A-D). Jednocześnie monitorowaliśmy moment, ...

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium E8.5

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Opracowaliśmy system integrujący obrazowanie na żywo markerów fluorescencyjnych z hodowlą skrawków neuroepithelium embrionalnego myszy. Wykorzystaliśmy...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zintegrowanie obrazowania na żywo markerów fluorescencyjnych z kulturami skrawków neuroepithelium embrionów myszy. Jest to realizowane poprzez wstępne skrzyżowanie indukcyjnej linii myszy Cree z linią reporterową Cree w celu genetycznego znakowania widocznie dzielących się komórek. Następnie całe embriony myszy są wypreparowywane i hodowane in vitro w obecności lentiwirusa.Następnie zarodek jest przekrawiany, a przekrój rurki neuralnej przygotowywany do obrazowania na żywo. Na koniec przekrój rurki neuralnej jest obrazowany za pomocą konfokalnej mikroskopii poklatkowej. W rezultacie można uzyskać wyniki umożliwiające bezpośrednią obserwację podziałów pojedynczych komórek w rozwijającym się neuroepitelium w czasie rzeczywistym dzięki obrazowaniu na żywo ex vivo.Zaletą tego protokołu jest możliwość monitorowania pojedynczych komórek in vivo, co pozwala na badanie zdarzeń sygnalizacyjnych oraz zachowania każdej komórki z osobna. W pierwszej kolejności należy skrzyżować linię myszy z indukowaną tamoksyfenem rekombinazą Cre, CAGG CRE ER, z linią reporterową DS Red Cree. Aby monitorować względny czas odpowiedzi na sonic hedgehog w komórkach potomnych, należy skrzyżować linię CAGG CRE ER ds red z OG two EEG.W przypadku myszy transgenicznych FP back tamoksyfen rozpuszczono w 100% etanolu, a następnie wstrzyknięto go domięśniowo u ciężarnych samic w dniu E 6.5, aby wywołać ekspresję CRE oraz znakowanie DS red w niewielkiej podgrupie komórek zarodkowych. Po 48 godzinach, po wyjęciu embrionów, użyto mikroskopu fluorescencyjnego w celu zidentyfikowania embrionów wykazujących pozytywną reakcję na DS red. Przeniesiono je do naczynia hodowlanego i obserwowano podziały pojedynczych komórek podczas obrazowania ex vivo.Zadyssekuj zarodki w stadium E 8.5 do podgrzanego medium płuczącego zawierającego roztwór D-M-E-M-F 12 z dodatkiem 10% surowicy z noworodka cielęcia oraz 1% penicyliny i streptomycyny w stosunku jeden do jednego. Używając mikroskopu fluorescencyjnego ze stołem grzewczym ustawionym na 37 °C lub pracując obok płyty grzewczej o temperaturze 37 °C, natychmiast zidentyfikuj zarodki jako pozytywne pod kątem GFP i/lub DS RED. Przenieś do dwóch zarodków do 500 µL kropli uprzednio ekwilibrowanego medium hodowlanego.Nanieś cienką warstwę zrównoważonego lekkiego oleju mineralnego na powierzchnię pożywki, aby zapobiec parowaniu, a następnie inkubuj szalkę z embrionami w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Aby oznakować rzęski w neuroepitelium, dodaj od 5 do 10 µL lentiwirusa S sst, R 3G FP (około 2 milionów wariantów) do zrównoważonej kropli 500 µL pożywki hodowlanej zawierającej embrion. Po 18 godzinach hodowli przenieś zainfekowany embrion do kilku kropel pożywki płuczącej w celu usunięcia wirusa, a następnie przygotuj skrawki cewy nerwowej.Przenieś embrion na szalkę pokrytą 1% agarem i użyj mikro-noża o szerokości 0,025 mm, aby wypreparować rurkę neuralną. Umieść kroplę 150 µL zrównoważonej pożywki hodowlanej bez czerwieni fenolowej na szalki z szklanym dnem pokrytym poli-L-lizyną o średnicy 35 mm i połóż wyizolowaną rurkę neuralną stroną brzuszną do dołu w kropli pożywki. Wokół zamocowanej rurki neuralnej nanieś niewielkie ilości mieszaniny w proporcji 1:1 wazeliny i roztopionego wosku świecowego, a następnie delikatnie dociśnij szklane szkiełko nakrywkowe do wazeliny, aby unieruchomić próbkę.Przykryj naczynie cienką warstwą wyrównanego lekkiego oleju mineralnego w celu obrazowania. Użyj odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w komorę inkubacyjną ustawioną na 37 °C i 5% carbon dioxide. Do obrazowania komórek CLIA znakowanych GFP oraz komórek pozytywnych dla DS red użyj obiektywu imersyjnego 60 x oraz obiektywu imersyjnego 40 x.Aby monitorować komórki LIC dodatnie pod kątem GFP i DS red, otwórz oprogramowanie NIS Elements w celu skonfigurowania warunków obrazowania time-lapse. Co 10 minut wykonuj stosy (z-stacks) o grubości do 25 µm z odstępem 1,5 µm. W przypadku użycia obiektywu 40x, wykonuj stosy do 8 µm z odstępem 0,4 µm dla obiektywu 60x; dalsze instrukcje znajdują się w protokole tekstowym.Po utrwaleniu i zatopieniu tkanki w OCT, należy użyć kriostatu do przygotowania skrawków i przeprowadzić immunofluorescencję zgodnie z protokołem tekstowym. W tym przypadku wykonaliśmy obrazowanie ex vivo żywych podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium E 8.5 w celu oznakowania poszczególnych komórek. W podzbiorze komórek zawierających linię reporterową Cre wywołaliśmy rekombinazę CRE, która po rekombinacji ekspresowała DS red, co widać tutaj; 48 godzin później, za pomocą obrazowania ex vivo, zaobserwowano podziały pojedynczych komórek przy zastosowaniu reportera transkrypcyjnego sonic hedgehog, zmodyfikowanej linii transgenicznej oli two EGFP.Byliśmy w stanie monitorować moment, w którym komórki stały się responsywne na białko sonic hedgehog, aby obserwować formowanie się CLIA. W tym celu wygenerowano lentiwirusy SST R 3G FP, których użyto do zakażenia embrionów w kulturze. Przedstawione są tutaj wyniki obrazowania konfokalnego time-lapse embrionów z reporterem DS Red Cree wykazujących ekspresję EG two EGFP lub zakażonych lentiwirusem SSTR 3G FP podczas hodowli in vitro. Jedną z zalet tego podejścia jest możliwość wprowadzenia mutantowych alleli genetycznych do tła, co pozwala badać wpływ konkretnych genów na zachowanie poszczególnych komórek oraz zdarzenia sygnałowe.

ex-vivo-live-imaging-of-single-cell-divisions-in-mouse-neuroepithelium

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ex vivo Obrazowanie na żywo pojedynczych podziałów komórek w neuroepitelium myszy

Obrazowanie tkanki zarodkowej w czasie rzeczywistym przez długie okresy stanowi duże wyzwanie. Przedstawiamy tutaj metodę monitorowania zmian komórkowych i podkomórkowych w rdzeniu kręgowym kurczaka przez dłuższy czas z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Technikę tę można zaadaptować do innych obszarów układu nerwowego oraz rozwijającego się zarodka.

Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości zachowania komórek w rozwijającym się neuroepitelium

Źródło: Al Omran, A. J., et al. Obrazowanie na żywo rzęsek wyściółki w komorach bocznych mózgu myszy. J. Vis. exp. (2015).  Ten film demonstruje technikę obrazowania na żywo przy użyciu mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC) do obserwacji bicia rzęsek wyściółki w strzałkowych odcinkach mózgu myszy. Rzęski wyściółki napędzają płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF), a ich aktywność jest rejestrowana w sekcjach mózgu utrzymywanych w pożywce bogatej w składniki odżywcze i obrazowanych w komorze o...

Obrazowanie na żywo aktywności rzęsek komórek wyściółki w wycinku mózgu myszy

Źródło: Daynac, M., et. al. Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje obrazowanie poklatkowe nerwowych komórek macierzystych (NSC) z mózgu transgenicznej myszy przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. NSC fluoryzują na czerwono podczas fazy G1 i są niefluorescencyjne w innych fazach cyklu komórkowego. Przylegającą...

Obrazowanie poklatkowe podziału nerwowych komórek macierzystych myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej

Ten protokół opisuje, jak obrazować dzielące się komórki w tkance w zarodkach Caenorhabditis elegans. Podczas gdy kilka protokołów opisuje, jak obrazować podział komórek we wczesnym zarodku, ten protokół opisuje, jak obrazować podział komórek w rozwijającej się tkance podczas środkowej późnej embriogenezy.

Wizualizacja cytokinezy neuroblastów podczas embriogenezy C. elegans

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Korzystając z mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC) o wysokiej rozdzielczości, obserwuje się ex vivo bicie ruchliwych rzęsek wyściółki znajdujących się w komorach mózgu myszy za pomocą obrazowania na żywo. Technika ta pozwala na rejestrację unikalnej częstotliwości i kąta dudnienia rzęsek, a także ich właściwości stymulacyjnych wewnątrzkomórkowych oscylacji wapnia.

Obrazowanie na żywo rzęsek wyściółki w bocznych komorach mózgu myszy

Opisany jest solidny protokół do monitorowania populacji neuronów za pomocą wideomikroskopii poklatkowej, a następnie przetwarzania końcowego opartego na oprogramowaniu. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do identyfikacji zdarzeń biologicznych w wybranej populacji podczas eksperymentów obrazowania na żywo.

Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronalnych

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Obrazowanie na żywo ex vivo to potężna technika badania dynamicznych procesów ruchów komórkowych i interakcji w żywych tkankach. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który implementuje mikroskopię dwufotonową do śledzenia na żywo komórek nabłonka zębów w hodowanych całych siekaczach dorosłych myszy.

Wykorzystanie obrazowania na żywo ex vivo do badania podziałów i ruchów komórek podczas odnawiania zębów myszy

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę obrazowania na żywo pojedynczych podziałów komórkowych w nabłonku nerwowym myszy E8.5. Technika ta umożliwia badanie dynamiki rozwoju nerwowego w czasie rzeczywistym.

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Przeglądaj więcej filmów