Metody in vitro Hodowla organoidowa pierwotnych guzów jelita grubego myszy

Ogólnym celem tej procedury jest ustalenie organoidów pierwotnego guza jelita grubego neuronu. Osiąga się to poprzez pierwsze pobranie tkanki nowotworowej okrężnicy myszy. Drugim krokiem jest dysocjacja sąsiedniego normalnego nabłonka okrężnicy.

Następnie komórki nowotworowe jelita grubego są trawione na pojedyncze komórki. Ostatnim krokiem jest osadzenie komórek nowotworowych jelita grubego w matrycy i selektywna hodowla ich przy ograniczonych warunkach odżywczych. Ostatecznie mikroskopia świetlna służy do pokazania przebiegu w czasie powstawania organoidów guza jelita grubego.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak transformowane linie komórkowe raka jelita grubego, jest to, że hodowle organoidów ściśle naśladują stan in vivo i generują bardziej istotne fizjologicznie dane. Po eutanazji myszy dwutlenkiem węgla i zebraniu okrężnicy, przepłucz okrężnicę PBS. Użyj nożyczek, aby otworzyć okrężnicę wzdłużnie, a następnie umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym i użyj nożyczek, aby usunąć obszary zawierające guzy.

Zbierz i umyj tkankę nowotworową za pomocą PBS. Po umyciu przenieś fragmenty jelita do chelatacji EDTA, buforuj i inkubuj na lodzie przez 60 minut po chelatacji, większość normalnych komórek nabłonka jelitowego zostanie odłączona, podczas gdy komórki nowotworowe pozostaną przyczepione do mechy. Odessać bufor chelatacyjny zawierający normalne komórki nabłonka i umyć pozostałe fragmenty guza.

Jeszcze raz. Z pięcioma mililitrami zimnego buforu chelatacyjnego. Po odessaniu buforu chelatacyjnego przemyj fragmenty guza pięcioma mililitrami zimnego XPBS.

Po odessaniu jednego XPBS dodać bufor trawienny do fragmentów tkanek i inkubować przez dwie godziny. W temperaturze 37 stopni Celsjusza pozwól fragmentom guza osiąść pod normalną grawitacją przez jedną minutę, a następnie zbierz supernatant S w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Zawiesinę jednokomórkowego guza zawiesić supinacjon, odwirowując 200 razy G przez trzy minuty.

Następnie przemyć raz pięcioma mililitrami PBS i odwirować. Ponownie, zyskaj ponownie zawiesić osad guza za pomocą 500 mikrolitrów PBS. Następnie policz izolowane pojedyncze komórki nowotworowe za pomocą hemocytometru.

Następnie rozdrobnij komórki nowotworowe, wirując przy 200 razy G przez trzy minuty i ponownie wyślij pięć miligramów na mililitr matrigelu na lodzie. Następnie umieść 15 000 komórek w objętości 50 mikrolitrów matrigelu na dołek na płytce 24-dołkowej. Po pozostawieniu mieszaniny komórek matrigelu do polimeryzacji przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, dodaj 500 mikrolitrów podstawowej pożywki hodowlanej zawierającej 50 nanogramów na mililitr moczu EGF do każdej studzienki, zmieniaj podstawową pożywkę hodowlaną zawierającą EGF co dwa dni i masuj organoidy od jednego do pięciu raz w tygodniu w celu masażu.

Po zastąpieniu pożywki hodowlanej świeżą pożywką podstawową, należy użyć pipety P 1000 z odciętą końcówką pipety, aby mechanicznie rozbić organoidy i matrycę. Przenieś zawiesinę organoidów do 15-mililitrowej probówki sokoła. Użyj wypolerowanej ogniowo pipety do makaronu, aby jeszcze bardziej zakłócić działanie organoidów.

Przemyć zdysocjowane organoidy pięcioma mililitrami kultury podstawowej, pożywką i odwirować 200 razy G przez dwie minuty. Następnie wyrzucić supinat, ponownie zawiesić osad z żelem matri i płytką, jak opisano wcześniej, aby zamrozić organoidy, rozdzielić przemycie i odwirować. Tak jak poprzednio, odrzuć supinat i resus.

Zawiesić osad w DMEM zawierający 20% płodowej surowicy bydlęcej i 10% tlenku dimetylosulfonu. Następnie przenieś zawiesinę komórek do 1,5 mililitrowych probówek kriogenicznych. Przenieś probówki do pojemnika do zamrażania Nalgene Mr.Frosty i przechowuj w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby osiągnąć szybkość chłodzenia minus jeden stopień Celsjusza na minutę.

Po całonocnej inkubacji przenieś komórki do ciekłego azotu. Komórki mogą być przechowywane w ten sposób przez ponad dwa lata. W celu ekstrakcji RNA komórki są zbierane.

Jeśli chodzi o pasażowanie, RNA izoluje się za pomocą zestawu do izolacji pico pure RNA. Zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi ekstrakcji białek, osad komórkowy zbiera się w zwykły sposób, a następnie leży w 100 mikrolitrach buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego do immunohistochemii. Po zasysaniu pożywki do hodowli komórkowej użyj pociętej pipety P 1000, aby przenieść organoidy nowotworowe do formy kriogenicznej.

Umieść formę na suchym lodzie i dodaj pożywkę do zamrażania tkanek do formy wytnij zamrożone odcinki o wielkości siedmiu mikronów i zabarwij Zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami, obraz ten pokazuje reprezentatywną formację organoidową pochodzącą z guza okrężnicy pobranego od trzymiesięcznej myszy PC min, krótko po posiewaniu. To zdjęcie pokazuje ten sam organoid dzień po posiewie. Tutaj organoid jest w hodowli od trzech dni.

Podczas gdy ten obraz pokazuje organoid sześć dni po posiewaniu. Tutaj pokazano dwa organoidy, które były w hodowli przez 14 dni. Należy pamiętać, że na tym etapie każdy organoid składa się z klastra komórek.

Ten histogram pokazuje pomyślne tempo tworzenia organoidów w dwóch różnych warunkach trawienia kolagenazy. Obrazy te pokazują organoidy pochodzące z guza jelita grubego pobranego od trzymiesięcznej myszy PC min z barwieniem immunofluorescencyjnym na beta-kateninę. DPI używano do barwienia jąder.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustalić pierwotny OID guza okrężnicy moczu poprzez trawienie enzymatyczne.