Name: Szybkie testy kolorymetryczne w celu jakościowego rozróżnienia RNA i DNA w próbkach biomolekularnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-04T09:51:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Poznaj szybkie testy kolorymetryczne do jakościowego rozróżniania RNA i DNA w próbkach biomolekularnych. Metoda wykorzystuje reaktywność cukrów w kwasach nukleinowych do identyfikacji biopolimerów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez University of Virginia i Jeffress Memorial Trust (J-971). Dziękujemy L. Columbusowi, K. Jainowi i P. Randolphowi za pomocne dyskusje i krytyczną lekturę manuskryptu.

1. Test Benedykta do redukcji cukrów
<ol>
 <li>Przygotuj odpowiednią ilość odczynnika Benedicta - 940 mM bezwodnego węglanu sodu, 588 mM odwodnionego cytrynianu sodu, 68 mM pięciowodnego siarczanu miedzi (II). Odczynnik ten może być przechowywany w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej sześć miesięcy bez zauważalnej zmiany reaktywności.</li>
 <li>Powyższy odczynnik to 6x. Tak więc, aby uzyskać reakcje 600 μl, dodaj 100 μl odczynnika Benedicta do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml (np. marki Eppendorf) na próbkę, która ma być oznaczona.</li>
 <li>Dodać od 10 μl do 500 μl próbki do tej probówki; optymalną objętość można określić na podstawie intensywności tworzenia się koloru w początkowej próbie. Jeżeli dostępna jest wystarczająca ilość próbki, należy rozpocząć takie próby od maksymalnej możliwej objętości próbki (tj. pięć szóstych całkowitej objętości reakcji, w tym przypadku 500 μl próbki), a następnie rozcieńczyć w kolejnych testach.</li>
 <li>Dodać ddH2O do probówki, aby doprowadzić końcową objętość do 600 μl; wymieszać roztwór przez wirowanie lub pipetowanie.</li>
 <li>Inkubować próbki przez 20 minut we wrzącej łaźni wodnej.</li>
 <li>Wyjąć podgrzaną próbkę z kąpieli i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
 <li>Odwirować probówkę z próbką przy > 9 300 x g (~10 000 obr./min w wirniku FA45-24-11 Eppendorf) przez 5 minut w celu osadzenia wszelkich cząstek stałych; ten krok jest ważniejszy dla badań ilościowych niż jakościowych.</li>
 <li>Porcjować supernatant z tej probówki do czystej kuwety.</li>
 <li>Opróżnij spektrofotometr uv-vis wodą.</li>
 <li>Zmierzyć absorbancję tej próbki przy długości fali 475 nm.</li>
</ol>
2. Test Orcinol Biala na obecność cukrów pentozowych
<ol>
 <li>Przygotować odpowiednią ilość świeżego odczynnika Biala - 24,2 mM monohydratu orcyny (struktura tego związku znajduje się na rysunku 2b), 6 M HCl, 0,025% m/v sześciowodnego chlorku żelaza. nuta: W celu przedłużonego przechowywania, odczynnik Bial można przygotować w postaci dwóch oddzielnych roztworów podstawowych: (i) odczynnika A [0,05% w/v FeCl3•6H2O w stężonym HCl] i (ii) odczynnika B [422 mM monohydrat orcyny przygotowany w 95% etanolu]. Odczynnik A może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez sześć miesięcy; Odczynnik B może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez jeden miesiąc, przykryty folią w celu ograniczenia ekspozycji na światło. Te roztwory podstawowe miesza się przed użyciem w stosunku 15 (A) : 1 (B) v/v.</li>
 <li>Powyższy odczynnik to 2x. Tak więc, dla reakcji 1,0 ml, dodać 500 μl odczynnika Biala do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na próbkę, która ma być oznaczona.</li>
 <li>Dodać do tej probówki od 10 μl do 500 μl próbki. Zgodnie z uwagą 1.3 (powyżej), jeżeli dostępna jest wystarczająca ilość próbki, należy rozpocząć reakcje próbne przy użyciu maksymalnej możliwej objętości próbki (tj. połowy całkowitej objętości reakcji, w tym przypadku 500 μl próbki) i rozcieńczyć ją.</li>
 <li>Dodać ddH2O do probówki, aby doprowadzić końcową objętość do 1,0 ml; wymieszać roztwór przez wirowanie lub pipetowanie.</li>
 <li>Inkubować próbki przez 20 minut we wrzącej łaźni wodnej.</li>
 <li>Wyjąć podgrzaną próbkę z kąpieli i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
 <li>Odwirować probówkę z próbką przy > 9 300 x g (~10 000 obr./min w wirniku FA45-24-11 Eppendorf) przez 5 minut w celu osadzenia wszelkich cząstek stałych; ten krok jest ważniejszy dla badań ilościowych niż jakościowych.</li>
 <li>Porcję supernatantu z tej probówki umieścić w czystej kuwecie w celu kontroli wzrokowej.</li>
 <li>W przypadku analizy półilościowej należy zaślepić spektrofotometr uv-vis wodą i zmierzyć absorbancję próbki kuwety przy długości fali 660 nm.</li>
</ol>
3. Test Difenyloaminy Dische'a dla cukrów 2'-deoksypentozowych
<ol>
 <li>Przygotować odpowiednią ilość odczynnika difenyloaminy Dische'a - 60 mM difenyloaminy, 11 M lodowaty kwas octowy, 179 mM kwas siarkowy, 0,62% v/v etanolu. Odczynnik ten można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemnym pojemniku lub przykryć folią, aby ograniczyć ekspozycję na światło. Ze względu na wrażliwość na światło odczynnik nie powinien być przechowywany w nieskończoność, chociaż w praktyce można go przygotowywać co dwa do trzech miesięcy bez widocznej zmiany reaktywności.</li>
 <li>Powyższy odczynnik to 2x. Tak więc, dla reakcji 1,0 ml, dodać 500 μl odczynnika Dische'a do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na próbkę, która ma być oznaczona.</li>
 <li>Dodać do tej probówki od 10 μl do 500 μl próbki. Zgodnie z uwagą 1.3 (powyżej), jeżeli dostępna jest wystarczająca ilość próbki, należy rozpocząć reakcje próbne przy użyciu maksymalnej możliwej objętości próbki (tj. połowy całkowitej objętości reakcji, w tym przypadku 500 μl próbki) i rozcieńczyć ją.</li>
 <li>Dodać ddH2O do probówki, aby doprowadzić końcową objętość do 1,0 ml; wymieszać roztwór przez wirowanie lub pipetowanie.</li>
 <li>Inkubować próbki przez 20 minut we wrzącej łaźni wodnej.</li>
 <li>Wyjąć podgrzaną próbkę z kąpieli i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
 <li>Odwirować probówkę z próbką o >9 300 x g (~10 000 obr./min w wirniku FA45-24-11 Eppendorf) przez 5 minut w celu osadzenia wszelkich cząstek stałych; ten krok jest ważniejszy w przypadku badań ilościowych niż jakościowych.</li>
 <li>Porcję supernatantu z tej probówki umieścić w czystej kuwecie w celu kontroli wzrokowej.</li>
 <li>W przypadku analizy półilościowej należy zalać spektrofotometr uv-vis wodą i zmierzyć absorbancję próbki kuwety przy długości fali 600 nm.</li>
</ol>
4. Dalsze uwagi dotyczące użytkowania
<ol>
 <li>Następujące klasy cząsteczek są odpowiednimi związkami odniesienia dla pozytywnych i ujemnych reakcji kontroli dla każdego testu:
 <ul>
 <li>Benedykta - Dodatni = wolna ryboza, fruktoza, glukoza; Ujemny = RNA, DNA, ATP itp. (każdy sacharyd pozbawiony funkcji wolnego cukru redukującego)</li>
 <li>Bial's - Dodatni = RNA (np. ekstrakt z drożdży piekarskich), ryboza, ATP, UMP; Ujemny = albumina surowicy bydlęcej (BSA) lub jakiekolwiek inne białko</li>
 <li>Dische's - Dodatni = DNA (np. grasica cielęca); Ujemny = RNA, ATP itp. (dowolny nukleotyd nieodtleniony 2')</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Stwierdzono, że testy te są dość odporne na związki często stosowane w oczyszczaniu białek; na przykład sole kuchenne, takie jak NaCl, (NH4)2SO4 iK2SO4 nie zakłócały, a zawartość rozcieńczalnika wydaje się na ogół nie mieć wpływu na reakcje. Detergenty lub środki chaotropowe, takie jak mocznik, mogą wpływać na reaktywność testów, jeśli pH jest wysoce zasadowe; zakres pH od obojętnego do kwaśnego jest na ogół najbardziej optymalny dla testów Biala i Dische'a ze względu na chemię leżącą u podstaw reakcji (patrz tekst i protony na rysunku 2b, c). Potencjalnie nieoptymalne warunki reakcji, podejrzenia zakłóceń itp. powinny być badane indywidualnie dla każdego przypadku, z wykorzystaniem doświadczeń kontroli dodatniej i ujemnej ze związkami odniesienia.</li>
</ol>

<ol><li>De Mey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+DNA+and+RNA+quantification+methods+suitable+for+parameter+estimation+in+metabolic+modeling+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms.</a> Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+Microvolume+Quantitation+of+Nucleic+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%3A+A+Compendium+of+Methods+from+Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology</a>. , 4th, Wiley. (1999).</li>
<li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoet%2C+D+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 4th, John Wiley & Sons. (2011).</li>
<li>Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+RLP+%22The+Biochemistry+of+the+Nucleic+Acids%22">The Biochemistry of the Nucleic Acids</a>. , 10th, Chapman and Hall. (1986).</li>
<li>Rice, P. A., Correll, C. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRice%2C+PA+%22Protein-nucleic+acid+interactions%3A+Structural+biology%22">Protein-nucleic acid interactions: Structural biology</a>. , RSC Pub. (2008).</li>
<li>Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cations+in+charge%3A+Magnesium+ions+in+RNA+folding+and+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. , (2012).</li>
<li>Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+histone-like+protein+HU+specifically+recognizes+similar+structures+in+all+nucleic+acids.+DNA%2C+RNA%2C+and+their+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids.</a> J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li>
<li>Benedict, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reagent+for+the+detection+of+reducing+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A reagent for the detection of reducing sugars.</a> J. Biol. Chem. 277, e5(1908).</li>
<li>Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simultaneous+estimation+method+of+DNA+and+RNA+by+the+orcinol+reaction+and+a+study+on+the+reaction+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism.</a> J. Biochem. 67, 629-633 (1970).</li>
<li>Almog, R., Shirey, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+orcinol+test+for+the+specific+determination+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modified orcinol test for the specific determination of RNA.</a> Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).</li>
<li>Dische, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+color+reactions+for+determination+of+sugars+in+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Biochem.+Anal%22%5BJournal%5D)">New color reactions for determination of sugars in polysaccharides.</a> Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).</li>
<li>Burton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+conditions+and+mechanism+of+the+diphenylamine+reaction+for+the+colorimetric+estimation+of+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid.</a> Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).</li>
<li>Vogel, J., Luisi, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq+and+its+constellation+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hfq and its constellation of RNA.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).</li>
<li>Deckert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+electron+microscopy+structure+of+affinity-purified+human+spliceosomal+B+complexes+isolated+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions.</a> Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).</li>
<li>Stevens, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+functional+characterization+of+the+yeast+spliceosomal+penta-snRNP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP.</a> Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).</li>
<li>Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+protein+assay+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Appl.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Colorimetric protein assay techniques.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 29 (Pt. 2), 99-108 (1999).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przedstawione tutaj testy kolorymetryczne oferują proste podejście do szybkiej oceny chemicznego charakteru mieszanin biomolekularnych, takich jak te, które występują podczas oczyszczania białek, RNA lub kompleksów z lizatu całokomórkowego w ramach przygotowań do dalszych badań. W miarę jak biologia strukturalna dąży do tworzenia coraz bardziej natywnych zespołów, coraz większe wyzwania, takie jak niejednorodność próbek, będą stwarzane przez skomplikowane i wieloskładnikowe kompleksy. Zespoły supramolekularne są często t...

Duża część biologii komórki zachodzi poprzez interakcje molekularne obejmujące DNA i RNA. 4 Te naturalnie występujące kwasy nukleinowe (NA) oddziałują ze sobą,5 z białkami,6 oraz z wieloma drobnocząsteczkowymi związkami i ligandami in vivo (np. kationami dwuwartościowymi7). Interakcje mogą być krótkotrwałe lub długotrwałe (kinetycznie), mogą wahać się od wysokiego przez umiarkowane do niskiego powinowactwa (siła termodynamiczna), a także mogą wykazywać znaczne różnice we właściwościach chemicznych i swoistości - niektóre powiązania są dość specyficzne (np. DNA···czynniki transkrypcyjne, RNA····czynniki splicingowe), podczas gdy inne interakcje są z konieczności znacznie bardziej ogólne (np., DNA···bakteryjne białka histone-podobne do HU8). Niespecyficzne interakcje z NAs mogą mieć praktyczne konsekwencje dla doświadczeń in vitro obejmujących mieszaniny biomolekuł, ponieważ jest możliwe, a nawet prawdopodobne, że niektóre NA będą kojarzyć się z biomolekułami będącymi przedmiotem zainteresowania, przynajmniej w pewnym podzbiorze stosowanych warunków eksperymentalnych (siła jonowa, pH roztworu itp.).
Rozważ, na przykład, produkcję białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) poprzez heterologiczną nadekspresję białka rekombinowanego w hodowli komórkowej Escherichia coli; taka procedura jest rutynowo wykonywana w praktycznie każdym laboratorium biologii strukturalnej. 9 Przygotowując się do dalszych eksperymentów, takich jak charakterystyka biochemiczna/biofizyczna, krystalizacja itp., początkowe wysiłki koncentrują się na ogół na uzyskaniu wystarczającej ilości POI w możliwie najczystszej formie, najlepiej jako chemicznie jednorodny i biofizycznie monodyspersyjny próbk. Po rozerwaniu komórek gospodarza, wczesne etapy typowego procesu oczyszczania mają na celu wyizolowanie POI od białek E. coli, kwasów nukleinowych, szczątków ściany komórkowej i innych składników lizatu komórkowego. Jednak NA-NA gospodarza mogą oczyszczać się jednocześnie z POI z kilku powodów fizykochemicznych - wysoce zasadowy POI może niespecyficznie ściągać w dół DNA/RNA gospodarza; POI może mieć ogólną aktywność wiążącą NA (np. wspomniany HU); POI może być dość specyficznym białkiem wiążącym NA, ale wykazywać reaktywność krzyżową z RNA lub DNA gospodarza; NA-NA gospodarza mogą wchodzić w interakcje z matrycą chromatograficzną, a tym samym po prostu koeluować z POI; i tak dalej. Bezkrytyczne, wysokie powinowactwo wiązania NAs gospodarza z POI może stanowić irytujący problem, ponieważ zanieczyszczenia NA prawdopodobnie będą zakłócać dalsze eksperymenty (np. Testy anizotropii fluorescencji wiązania POI•RNA10). Alternatywnie, nieprzewidziane powiązania POI···NA mogą być również postrzegane przypadkowo, ponieważ takie interakcje rzucają światło na zdolność POI do wiązania kwasów nukleinowych. Tak czy inaczej, niezależnie od tego, czy NA są kluczowymi składnikami, czy zanieczyszczeniami, należy najpierw określić ilościowo i zidentyfikować typ (DNA, RNA) współoczyszczających NA w ramach przygotowań do dalszych eksperymentów.
Istnieje kilka metod analitycznych do wykrywania i ilościowego oznaczania NAs w próbce. Większość dostępnych metod to metody spektrofotometryczne (np. wartości absorbancji A260 i proporcje A260/A280), fluorometryczne (np. wiązanie oranżu tiazolowego lub innych barwników fluorescencyjnych z NA) lub kolorymetryczne (podatność nukleozydów na reakcje chemiczne, w wyniku których powstają chromofory absorbujące się w obszarze uv-vis widma elektromagnetycznego), jak niedawno opisali De Mey i wsp. 1 Jednak kluczowy krok identyfikacji typu polinukleotydu jako RNA lub DNA wykracza poza zakres wielu z tych podejść do oceny ilościowej. Tutaj przedstawiamy zestaw testów kolorymetrycznych do szybkiej identyfikacji rodzajów składników NA w próbce białkowej.
Opisane tutaj protokoły mogą być efektywnie wykonane bez dodatkowych etapów izolowania potencjalnych zanieczyszczeń NA i polegać na teście Benedicta dla redukcji cukrów11, teście orcyny dla pentoz12,13 i reakcjach difenyloaminy14,15 2'-deoksypentozów (Rysunki 1 i 2). Test Benedicta (ryc. 2a) wykorzystuje zdolność liniowej, otwartej (aldehydowej) formy cukru aldozowego do redukcji Cu2+, z jednoczesnym utlenianiem karbonylu cukru do ugrupowania karboksylowego i wytwarzaniem Cu2O jako nierozpuszczalnego czerwonego osadu. Ta reakcja będzie pozytywna w przypadku wolnych cukrów redukujących, takich jak aldozy i ketozy (które przekształcają się w odpowiednie aldozy za pośrednictwem produktów pośrednich enediolu), ale nie w przypadku cukrów pentozowych, które są zablokowane w formie cyklicznej jako część kowalencyjnego szkieletu polinukleotydu DNA lub RNA. Ze względu na minimalistyczny wymóg funkcjonalności wolnego półacetalu, inne związki, które mogą dać wynik pozytywny w tym teście - a zatem działać jako potencjalne zakłócenia - obejmują α-hydroksyketony i krótkie oligosacharydy (np. disacharyd maltozę). Zarówno reakcje orcyny Biala (ryc. 2b), jak i difenyloaminy Dische'a (ryc. 2c) opierają się na początkowym zniszczeniu szkieletu polinukleotydowego poprzez deurinację nukleozydu i dalszą katalizowaną kwasem lub zasadą hydrolizę nukleotydów macierzystych, w celu uzyskania pochodnych furan-2-karbaldehydu (furfuralu); Pochodne te następnie reagują z odczynnikami polihydroksyfenolowymi, takimi jak orcynol (Bial) lub difenyloamina (Dische), tworząc kolorowe produkty kondensacji o w dużej mierze nieznanej strukturze chemicznej. Specyficzność DNA w stosunku do RNA w teście Dische'a wynika z faktu, że cukier pentozowy musi być odtleniony 2', aby był podatny na utlenianie do aldehydu ω-hydroksylewulinylu, który dalej reaguje z difenyloaminą w warunkach kwaśnych, dając jasnoniebieski kondensat (ryc. 2c). Korzystając z opisanych tutaj uproszczonych protokołów, odkryliśmy, że te specyficzne dla cukru reakcje kolorymetryczne mogą różnicować RNA i DNA, a także wskazują na obecność wolnych cukrów redukujących, takich jak glukoza, fruktoza lub ryboza w próbce biomolekularnej.

<table><tbody><tr><td>Bezwodny węglan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S263</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu dwuwodny</td><td>Sigma</td><td>S-4641</td><td></td></tr><tr><td>Pięciowodny siarczan miedzi (II)</td><td>VWR</td><td>VW3312-2</td><td></td></tr><tr><td>Orcynol jednowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1875</td><td></td></tr><tr><td>Skoncentrowany HCl</td><td>VWR</td><td>BDH3030</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek żelaza</td><td>Sigma</td><td>F-2877</td><td></td></tr><tr><td>Difenyloamina</td><td>Aldrich</td><td>112763</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A28</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Koptec</td><td>V1101</td><td></td></tr><tr><td>Ryboza</td><td>Sigma</td><td>R-7500</td><td>przygotowanie przy 1% w/v w H2O</td></tr><tr><td>Kwas rybonukleinowy z drożdży piekarskich (S. cerevisiae)</td><td>Sigma</td><td>R6750</td><td>przygotować w dawce 10 mg/ml w H2O; przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Kwas dezoksyrybonukleinowy (sól sodowa), z grasicy cielęcej</td><td>Sigma</td><td>D1501</td><td>przygotować w dawce 10 mg/ml w H2O; przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td colspan="4"> Odczynniki, sprzęt i Safety Materiały są wymienione w poniższej tabeli w kolejności, w jakiej pojawiają się w sekcji Protokół. O ile nie zaznaczono inaczej (powyżej), wszystkie odczynniki można przechowywać w temperaturze pokojowej otoczenia i przy oświetleniu. W przypadku wszystkich produktów niewymienionych poniżej (np. probówki do mikrowirówek , można użyć zwykłej marki / modelu / odmiany znajdującej się w standardowym laboratorium biochemicznym (np. , probówki do mikrofug marki Eppendorf o pojemności 1,5 ml). Standardowe probówki do mikrofug z tworzywa sztucznego powinny być używane do etapów obejmujących wirowanie (np. , w celu osadzenia cząstek stałych pod koniec każdego protokołu). Żaden konkretny materiał nie jest preferowany, o ile rurki można uszczelnić; Dobrze sprawdzają się typowe rurki polipropylenowe znajdujące się w laboratoriach biochemicznych. Jeśli chodzi o kwestie bezpieczeństwa i utylizację odpadów, należy zachować standardowe laboratoryjne środki ostrożności (okulary ochronne, dygestoria) przy wstępnym przygotowywaniu, pracy i utylizacji roztworów zawierających stężone kwasy octowe, solne lub siarkowe. W przypadku odczynników organicznych, takich jak orcynol lub difenyloamina, rękawice nitrylowe są lepsze niż zwykła odmiana lateksu (kauczuku naturalnego).</td></tr></tbody></table>

szybkie testy kolorymetryczne w celu jakościowego rozróżnienia rna i dna w próbkach biomolekularnych

Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Eksperymenty biochemiczne zazwyczaj wymagają dokładnej wiedzy, na wczesnym etapie, o kwasie nukleinowym, białku i innych składnikach biomolekularnych w potencjalnie heterogenicznych próbkach. Kwasy nukleinowe można wykrywać za pomocą kilku uznanych podejść, w tym metod analitycznych, które są spektrofotometryczne (np. A260), fluorometryczne (np. wiązanie barwników fluorescencyjnych) lub kolorymetryczne (chromogenne reakcje chemiczne specyficzne dla nukleozydów). 1 Chociaż nie można łatwo odróżnić RNA od DNA, stosunek A260 / A280 jest powszechnie stosowany, ponieważ oferuje prostąi szybką 2 ocenę względnej zawartości kwasu nukleinowego, który wchłania głównie w pobliżu 260 nm i białka, które wchłania głównie w pobliżu 280 nm. Proporcje < 0,8 są traktowane jako wskazujące na "czyste" próbki białek, podczas gdy czysty kwas nukleinowy (NA) charakteryzuje się stosunkami > 1,53.
Są jednak scenariusze, w których zawartość białka/NA nie może być tak jasno i wiarygodnie wywnioskowana z prostych pomiarów spektrofotometrycznych uv-vis. Na przykład (i) próbki mogą zawierać jedno lub więcej białek, które są stosunkowo pozbawione aminokwasów aromatycznych odpowiedzialnych za wchłanianie przy ≈280 nm (Trp, Tyr, Phe), jak ma to miejsce w przypadku niektórych małych białek wiążących RNA, oraz (ii) próbki mogą wykazywać pośrednie proporcje A260/A280 (~0,8 < ~1,5), gdzie zawartość białka / NA jest znacznie mniej wyraźna i może nawet odzwierciedlać pewne wysokie powinowactwo między białkiem a składnikami NA. W przypadku takich scenariuszy opisujemy tutaj zestaw testów kolorymetrycznych w celu szybkiego rozróżnienia RNA, DNA i cukrów redukujących w potencjalnie mieszanej próbce biomolekuł. Metody opierają się na zróżnicowanej wrażliwości pentoz i innych węglowodanów na odczynniki Benedicta, Biala (orcynol) i Dische'a (difenyloamina); Uproszczone protokoły można ukończyć w ciągu kilku minut, bez żadnych dodatkowych kroków związanych z koniecznością izolowania komponentów. Testy można wykonywać równolegle, aby rozróżnić RNA i DNA, a także wskazać obecność wolnych cukrów redukujących, takich jak glukoza, fruktoza i ryboza (ryc. 1).

Wyniki zastosowania tych testów kolorymetrycznych do znanych związków referencyjnych przedstawiono na Rysunku 3. Reprezentatywne dane jakościowe pokazano dla testu Benedicta (a), testu Bial’a z orcinolem (b) oraz testu Dische’a z difenyloaminą (c), natomiast krzywe wzorcowe dla tych trzech testów przedstawiono na Rysunku 4. W panelach 3(a-c) lewe części obrazu przedstawiają eksperymenty z kontrolą pozytywną/negatywną z użyciem odpowiednio reaktywnych/niereaktywnych analitów; wyniki wizua...

Opisano zestaw testów kolorymetrycznych do szybkiego rozróżniania białek, RNA, DNA i cukrów redukujących w potencjalnie heterogenicznych próbkach biomolekularnych.

Szybkie testy kolorymetryczne w celu jakościowego rozróżnienia RNA i DNA w próbkach biomolekularnych

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ustalenie, czy potencjalnie niejednorodna próbka biomolekuł zawiera kwas nukleinowy i/lub cukry redukujące. A jeśli tak, rozróżnij RNA i DNA na podstawie różnej reaktywności ich ugrupowań cukrowych. Osiąga się to poprzez zastosowanie najpierw testu Benedicta w celu określenia, czy mieszanina biomolekularna zawiera wolne cukry redukujące.W drugim kroku stosuje się arsen lub test, który określa, czy jakiekolwiek składniki cukru zawierają pierścienie pento. Następne potrawy Odczynnik difenyloaminy służy do określenia, czy cukier pento jest dezoksyrybozą, jak w DNA, czy nie, jak w RNA. Wyniki pokazują rodzaj biopolimeru opartego na łatwo rozróżnialnych produktach barwnych utworzonych przez zróżnicowane reaktywności składników na bazie cukru w próbce, które można analizować w stosunku do krzywych standardowych za pomocą pomiarów spektrofotometrycznych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak elektroforeza przy użyciu barwników fluorescencyjnych, zieleni pico lub cyberzłota, jest to, że nie ma ograniczeń opartych na rozmiarze, ładunku lub składniku cukrowym i jest wydajna pod względem czasu i kosztów Test na redukcję cukrów. Przygotować odpowiednią objętość sześciu x odczynnika Benedicta składającego się z 940 milimolowych bezwodnych, węglanu sodu 588 milimolowych, dwuwodnego cytrynianu sodu i 68 milimolowych miedzi. Dwusiarczanowy penta hydrat.Dla każdej próbki, która ma być testowana, dodaj 100 mikrolitrów sześciu x odczynnika Benedicta do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Dodaj od 10 do 500 mikrolitrów próbki do każdej probówki i dodaj podwójnie destylowaną wodę, aby doprowadzić końcową objętość do 600 mikrolitrów wiru lub pipety. Aby wymieszać roztwór.Próbki należy inkubować we wrzącej łaźni wodnej przez 20 minut, a następnie pozostawić do ostygnięcia przez 10 minut przed centryfuzją z prędkością około 10 000 obr./min przez pięć minut. Aby osadzać jakiekolwiek cząstki stałe, przenieś supinat do czystego vete po wygaszeniu UV w porównaniu ze spektrofotometrem wodą o długości 475 nanometrów.Zmierzyć chłonność próbki w celu oznaczenia na obecność cukrów pento. Przygotować świeży odczynnik o stężeniu 24,2 milimolowym, sześciomolowym chlorowodoru i sześciowodnym chlorku żelaza o stężeniu wagowym 0,025 na objętość zgodnie z protokołem tekstowym. Do każdej próbki dodać 500 mikrolitrów odczynnika żółciowego do mikroprobówki wirówkowej.Dodaj od 10 do 500 mikrolitrów próbki do każdej probówki i dodaj podwójnie destylowaną wodę, aby doprowadzić końcową objętość do jednego mililitra. Mieszanka. Gotować próbki przez 20 minut, a następnie schłodzić je w temperaturze pokojowej przez 10 minut po odwirowaniu próbki w celu osadzenia cząstek stałych, zmierzyć absorbancję przy 660 nanometrach, używając wody jako ślepej próby.Przygotuj dwie potrawy x odczynnik difenyloaminy składający się z 60 milimolowej difenyloaminy, siedmiu molowych lodowatych kwasów octowych, 179 milimolowych kwasów siarkowych i 62% objętości na objętość. Etanol. Do każdej reakcji połącz 500 mikrolitrów odczynnika, próbkę i podwójnie destylowaną wodę, aby uzyskać całkowitą objętość do jednego mililitra. Po gotowaniu próbek przez 20 minut, schłodzeniu w temperaturze pokojowej i odwirowaniu, zmierz absorbancję przy 600 nanometrach.Pokazano tutaj jej reprezentatywne dane jakościowe dla arsenału i potraw Benedicts Biles, testy difenyloaminy dla znanych związków referencyjnych. Lewy panel pokazuje zarówno kontrole pozytywne, jak i negatywne, a prawe panele wyświetlają widoczny zakres wykrywania testów. Panel ten ilustruje solidność testów, pokazując reakcję naczynia z próbkami o różnej niejednorodności.Na przykład DNA z RNA lub DNA z białkiem. Należy zauważyć, że pozytywne wyniki testu Disha są zachowane dla próbek zawierających DNA nawet w obecności zanieczyszczającego RNA lub białka. Zakresy rozcieńczeń w poprzednich próbkach różnią się, ponieważ każda reakcja ma odrębną granicę wykrywalności wizualnej.W zależności od rodzaju oznaczanego cukru, do poprawy zakresów pomiarowych, jak pokazano na tej krzywej standardowej, można zastosować detekcję fotometryczną, a nie wizualną. W przypadku testu Benedicta, po opanowaniu, technikę tę można wykonać w mniej niż 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

rapid-colorimetric-assays-to-qualitatively-distinguish-rna-dna

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Szybkie pomiary kolorymetryczne do jakościowego rozróżniania RNA i DNA w próbkach biomolekularnych

Ten film przedstawia protokół wykrywania sygnału podczas chromogenicznej hybrydyzacji RNA in situ. Technika ta może być stosowana do wizualnego diagnozowania aktywnej infekcji onkogennej w nienaruszonej próbce tkanki.

Wykrywanie sygnału RNA CISH: technika wykrywania sygnałów chromogennych podczas hybrydyzacji RNA in situ w nienaruszonych próbkach tkanek

Celem tej publikacji jest wizualizacja i dyskusja na temat etapów działania protokołu Enhanced Northern Blot na RNA ekstrahowanym z zarodków, komórek i tkanek Drosophila melanogaster. Protokół ten jest szczególnie przydatny do skutecznego wykrywania małych gatunków RNA.

Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorofenylcorol i jego wolnozasadowy analog wykazują niską cytotoksyczność komórek mikromolowych. W tym artykule opisano reakcję transkrypcji RNA, obrazowanie RNA za pomocą żelu barwionego bromkiem etydyny oraz ilościowe oznaczanie RNA za pomocą spektroskopii UV-Vis, w celu oceny hamowania transkrypcji przez korole i demonstruje prostą metodę oceny właściwości kandydatów przeciwnowotworowych.

Test enzymatyczny in vitro do pomiaru hamowania transkrypcji przez korole galu(III) i H3 5,10,15-tris(pentafluorofenylo)korole

Opisujemy cyfrowy test końcowy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych za pomocą uproszczonego (analogowego) odczytu. Mierzymy fluorescencję masową kropelkowych testów cyfrowych za pomocą standardowej maszyny qPCR, a nie specjalistycznego oprzyrządowania, i potwierdzamy nasze wyniki za pomocą mikroskopii.

Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Tutaj prezentujemy protokół śledzenia zanieczyszczenia genomowym DNA (gDNA) w próbkach RNA. W prezentowanej metodzie wykorzystuje się startery specyficzne dla wewnętrznego transkrybowanego regionu dystansowego (ITS) genów rybosomalnego DNA (rDNA). Metoda ta nadaje się do niezawodnego i czułego wykrywania zanieczyszczenia DNA u większości eukariontów i prokariontów.

Ocena zanieczyszczenia DNA w próbkach RNA na podstawie rybosomalnego DNA

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Badanie to przedstawia solidną metodę izolacji mRNA aksonalnych za pomocą wkładek z błony porowatej, umożliwiając całkowite rozdzielenie neuronów od neurytów oraz oczyszczanie RNA. W połączeniu z RTddPCR podejście pozwala na absolutną ilościową ilościową ilościową transkrypcję o niskiej liczbie kopii, ułatwiając badania transportu mRNA i lokalnej translacji o wysokiej czułości, powtarzalności i szerokim zastosowaniu eksperymentalnym.

Izolacja i ilościowa ilościowość mRNA aksonalnych z użyciem wkładek z błony porowatej oraz RTddPCR

Opisujemy eksperymentalne szczegóły syntezy wzorcowych i rekonfigurowalnych cząstek z dwuwymiarowych (2D) prekursorów. Metodologia ta może być stosowana do tworzenia cząstek o różnych kształtach, w tym wielościanów i urządzeń chwytających, w skalach długości od mikro do centymetrów.

Inspirowany origami samomontaż wzorzystych i rekonfigurowalnych cząstek

Poznaj szybkie testy kolorymetryczne do jakościowego rozróżniania RNA i DNA w próbkach biomolekularnych. Metoda wykorzystuje reaktywność cukrów w kwasach nukleinowych do identyfikacji biopolimerów.

Szybkie testy kolorymetryczne w celu jakościowego rozróżnienia RNA i DNA w próbkach biomolekularnych

Przeglądaj więcej filmów