Szybkie testy kolorymetryczne w celu jakościowego rozróżnienia RNA i DNA w próbkach biomolekularnych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ustalenie, czy potencjalnie niejednorodna próbka biomolekuł zawiera kwas nukleinowy i/lub cukry redukujące. A jeśli tak, rozróżnij RNA i DNA na podstawie różnej reaktywności ich ugrupowań cukrowych. Osiąga się to poprzez zastosowanie najpierw testu Benedicta w celu określenia, czy mieszanina biomolekularna zawiera wolne cukry redukujące.

W drugim kroku stosuje się arsen lub test, który określa, czy jakiekolwiek składniki cukru zawierają pierścienie pento. Następne potrawy Odczynnik difenyloaminy służy do określenia, czy cukier pento jest dezoksyrybozą, jak w DNA, czy nie, jak w RNA. Wyniki pokazują rodzaj biopolimeru opartego na łatwo rozróżnialnych produktach barwnych utworzonych przez zróżnicowane reaktywności składników na bazie cukru w próbce, które można analizować w stosunku do krzywych standardowych za pomocą pomiarów spektrofotometrycznych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak elektroforeza przy użyciu barwników fluorescencyjnych, zieleni pico lub cyberzłota, jest to, że nie ma ograniczeń opartych na rozmiarze, ładunku lub składniku cukrowym i jest wydajna pod względem czasu i kosztów Test na redukcję cukrów. Przygotować odpowiednią objętość sześciu x odczynnika Benedicta składającego się z 940 milimolowych bezwodnych, węglanu sodu 588 milimolowych, dwuwodnego cytrynianu sodu i 68 milimolowych miedzi. Dwusiarczanowy penta hydrat.

Dla każdej próbki, która ma być testowana, dodaj 100 mikrolitrów sześciu x odczynnika Benedicta do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Dodaj od 10 do 500 mikrolitrów próbki do każdej probówki i dodaj podwójnie destylowaną wodę, aby doprowadzić końcową objętość do 600 mikrolitrów wiru lub pipety. Aby wymieszać roztwór.

Próbki należy inkubować we wrzącej łaźni wodnej przez 20 minut, a następnie pozostawić do ostygnięcia przez 10 minut przed centryfuzją z prędkością około 10 000 obr./min przez pięć minut. Aby osadzać jakiekolwiek cząstki stałe, przenieś supinat do czystego vete po wygaszeniu UV w porównaniu ze spektrofotometrem wodą o długości 475 nanometrów.

Zmierzyć chłonność próbki w celu oznaczenia na obecność cukrów pento. Przygotować świeży odczynnik o stężeniu 24,2 milimolowym, sześciomolowym chlorowodoru i sześciowodnym chlorku żelaza o stężeniu wagowym 0,025 na objętość zgodnie z protokołem tekstowym. Do każdej próbki dodać 500 mikrolitrów odczynnika żółciowego do mikroprobówki wirówkowej.

Dodaj od 10 do 500 mikrolitrów próbki do każdej probówki i dodaj podwójnie destylowaną wodę, aby doprowadzić końcową objętość do jednego mililitra. Mieszanka. Gotować próbki przez 20 minut, a następnie schłodzić je w temperaturze pokojowej przez 10 minut po odwirowaniu próbki w celu osadzenia cząstek stałych, zmierzyć absorbancję przy 660 nanometrach, używając wody jako ślepej próby.

Przygotuj dwie potrawy x odczynnik difenyloaminy składający się z 60 milimolowej difenyloaminy, siedmiu molowych lodowatych kwasów octowych, 179 milimolowych kwasów siarkowych i 62% objętości na objętość. Etanol. Do każdej reakcji połącz 500 mikrolitrów odczynnika, próbkę i podwójnie destylowaną wodę, aby uzyskać całkowitą objętość do jednego mililitra. Po gotowaniu próbek przez 20 minut, schłodzeniu w temperaturze pokojowej i odwirowaniu, zmierz absorbancję przy 600 nanometrach.

Pokazano tutaj jej reprezentatywne dane jakościowe dla arsenału i potraw Benedicts Biles, testy difenyloaminy dla znanych związków referencyjnych. Lewy panel pokazuje zarówno kontrole pozytywne, jak i negatywne, a prawe panele wyświetlają widoczny zakres wykrywania testów. Panel ten ilustruje solidność testów, pokazując reakcję naczynia z próbkami o różnej niejednorodności.

Na przykład DNA z RNA lub DNA z białkiem. Należy zauważyć, że pozytywne wyniki testu Disha są zachowane dla próbek zawierających DNA nawet w obecności zanieczyszczającego RNA lub białka. Zakresy rozcieńczeń w poprzednich próbkach różnią się, ponieważ każda reakcja ma odrębną granicę wykrywalności wizualnej.

W zależności od rodzaju oznaczanego cukru, do poprawy zakresów pomiarowych, jak pokazano na tej krzywej standardowej, można zastosować detekcję fotometryczną, a nie wizualną. W przypadku testu Benedicta, po opanowaniu, technikę tę można wykonać w mniej niż 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.