Name: Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Poznaj metodę generowania ludzkich komórek NK z hESC i iPSC przy użyciu bezwłośnikowego podejścia z cytokinami. Technika umożliwia ekspansję progenitorów i obrazowanie in vivo aktywności przeciwnowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Melindzie Hexum za zainicjowanie protokołu spin EB w naszym laboratorium. Chcielibyśmy podziękować pozostałym członkom laboratorium, w tym Laurze E. Bendzick, Michaelowi Lepleyowi i Zhenya Ni za ich pomoc techniczną w tej pracy. Autorzy chcieliby również podziękować Bradowi Taylorowi z Caliper Life Sciences za jego fachowe porady techniczne.

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+colony-forming+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).</li>
<li>Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+clinical+therapies+using+hematopoietic+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells.</a> Blood. 114, 3513-3523 (2009).</li>
<li>Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+describing+the+use+of+a+recombinant+protein-based%2C+animal+product-free+medium+%28APEL%29+for+human+embryonic+stem+cell+differentiation+as+spin+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies.</a> Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).</li>
<li>Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust%2C+reproducible+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106, 1601-1603 (2005).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+CD34%2B+cells%3A+efficient+production+in+the+coculture+with+OP9+stromal+cells+and+analysis+of+lymphohematopoietic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential.</a> Blood. 105, 617-626 (2005).</li>
<li>Woll, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+differentiate+into+a+homogeneous+population+of+natural+killer+cells+with+potent+in+vivo+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity.</a> Blood. 113, 6094-6101 (2009).</li>
<li>Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+NK+cells+acquire+functional+receptors+and+cytolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity.</a> Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).</li>
<li>Ni, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pluripotent+Stem+Cells+Produce+Natural+Killer+Cells+That+Mediate+Anti-HIV-1+Activity+by+Utilizing+Diverse+Cellular+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms.</a> Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).</li>
<li>Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+spin+embryoid+bodies+and+a+description+of+the+hematopoietic+blast+colony+forming+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3(2008).</li>
<li>Denman, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-Bound+IL-21+Promotes+Sustained+Ex+Vivo+Proliferation+of+Human+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells.</a> PLoS ONE. 7, e30264(2012).</li>
<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+Purification%2C+and+Functional+Assessment+of+Human+Peripheral+Blood+NK+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells.</a> J. Vis. Exp. (48), e2540(2011).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+imaging+demonstrates+that+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+CD34%2B+cells+preferentially+develop+into+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells.</a> Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).</li>
<li>Wilber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+transposon-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer.</a> Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).</li>
<li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7, 827-829 (2010).</li>
<li>Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+luminescence+assays+using+scintillation+counters+for+quantitation+in+transfected+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).</li>
<li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Imaging.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 2, 537-540 (2005).</li>
<li>Santos, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+in+vivo+imaging+of+T+cells+using+a+membrane-bound+Gaussia+princeps+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase.</a> Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Proteins+and+Their+Applications+in+Imaging+Living+Cells+and+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues.</a> Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Lymphocytes+to+Study+In+Vivo+Trafficking+and+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy.</a> Stem Cells Dev. 28, 28(2013).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Decade+of+Imaging+Cellular+Motility+and+Interaction+Dynamics+in+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System.</a> Science. 336, 1676-1681 (2012).</li>
</ol>

Prace te były wspierane przez NIH/NHLBI R01-HL77923 (D.S.K.) oraz przez NIH MSTP grant T32 GM008244 (D.A.K.), Stem Cell Biology Training Grant T32 (D.A.K.)(T32HD060536), Grant Undergraduate Research Opportunities Program (UROP), University of Minnesota (A.M.B), fundusz badań nad białaczką University of Minnesota Cancer Center oraz Fundacja Williama L. i Blanche Hughes.

hESC są idealną platformą do badania różnych typów komórek i mają niezwykły potencjał w zakresie translacji klinicznej. Stosujemy zdefiniowane, spinowe podejście EB do różnicowania hESC/iPSC do hematopoetycznych komórek progenitorowych. Podejście spin EB pozwoliło na konsekwentne wyprowadzanie hematopoetycznych komórek progenitorowych i różnicowanie do komórek NK; Jednak nadal istnieją różnice w wydajności różnicowania między liniami komórkowymi i mogą wymagać modyfikacji w celu wytworzenia innych linii komórek krwiotwór...

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są niezróżnicowanymi, pluripotencjalnymi komórkami zdolnymi do nieograniczonego samoodnawiania się i różnicowania wieloliniowego. hESC zostały pomyślnie zróżnicowane na dojrzałe i funkcjonalne podzbiory każdej warstwy zarodkowej, w tym komórki układu krwiotwórczego1-3. Komórki NK (Natural Killer) to limfocyty wrodzonego układu odpornościowego, które mogą być pozyskiwane z hESC poprzez tworzenie ciał zarodkowych (EBs)4,5 lub kohodowlę z liniami komórek zrębu1,2,6-8. Komórki NK mają właściwości przeciwwirusowe i przeciwnowotworowe i mogą być skuteczne w walce z szerokim zakresem nowotworów złośliwych, ponieważ nie wymagają wcześniejszej stymulacji antygenowej do pełnienia swoich funkcji efektorowych. Tak więc komórki NK pochodzące z hESC są atrakcyjnym źródłem komórek do immunoterapii. Ponadto wyprowadzenie komórek NK z hESC zapewnia genetycznie podatny system do badania prawidłowego rozwoju in vitro.
Ponieważ dostarczają one genetycznie podatnego systemu, komórki NK pochodzące z hESC mogą być eksperymentalnie modyfikowane w celu ekspresji fluorescencyjnych i bioluminescencyjnych reporterów, co stanowi optymalny model do badania funkcji efektorów komórek NK in vitro i in vivo. Komórki NK pochodzące z hESC wykazują aktywność przeciwko różnym celom, w tym HIV 9, białaczce (K562) i innym typom raka 7,8. Jednak zdolność do skutecznego wyprowadzenia wystarczającej liczby komórek NK zdolnych do leczenia pacjentów pozostaje ważną barierą dla translacji klinicznej i, w mniejszym stopniu, stanowi ograniczenie dla szeroko zakrojonych badań przedklinicznych in vivo nad rozwojem komórek NK i funkcjami przeciwnowotworowymi. W tym przypadku stosujemy podejście spin EB w celu wyprowadzenia komórek progenitorowych układu krwiotwórczego z hESC 4,5,10. Po 11 dniach spinowe EB są przenoszone do hodowli komórek NK z karmownikami lub bez nich przez 28 dni. Po 4 tygodniach w pożywce do hodowli komórek NK, komórki NK są przenoszone do kohodowli z komórkami K562 zmodyfikowanymi do ekspresji interleukiny 21 (IL-21) związanej z błoną, które służą jako sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC). Dostosowując protokół do ekspansji komórek NK krwi obwodowej za pomocą tych sztucznych APC 11,12, jesteśmy w stanie rozszerzyć komórki NK 2-log, zachowując dojrzały fenotyp i zdolności cytotoksyczne.
Ten proces rozwoju i ekspansji dostarcza wystarczającą ilość komórek NK pochodzących z hESC do obszernej charakterystyki in vivo. W przypadku badań in vivo jesteśmy w stanie nieinwazyjnie monitorować długoterminowe wszczepianie i kinetykę wstrzykiwanej lucyferazy świetlika (Fluc+), komórek NK pochodzących z hESC za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Co więcej, jesteśmy w stanie śledzić interakcje komórek NK z komórkami nowotworowymi za pomocą schematu obrazowania podwójnego, bioluminescencyjnego lub fluorescencyjnego. We wcześniejszym badaniu przeprowadzonym przez naszą grupę wykorzystano obrazowanie bioluminescencyjne w modelu przeciwnowotworowym w celu śledzenia progresji guza i klirensu komórek Fluc + K562 in vivo 7. Teraz, poprzez inżynierię naszych hESC do ekspresji lucyferazy świetlika 13,14, możemy śledzić biodystrybucję i transport komórek NK do komórek nowotworowych K562, które wyrażają niedawno scharakteryzowane białko fluorescencyjne, turboFP650 15. Wybraliśmy ten podwójny system reporterowy, aby jednocześnie śledzić dwie populacje komórek in vivo (ryc. 1). Większość modeli podwójnego obrazowania to systemy podwójnej lucyferazy, ale systemy te mogą być technicznie trudne ze względu na wymagania dotyczące dostarczania koelenterazyny, substratu wymaganego do ekspresji większości reporterów lucyferazy Renilla i Gaussia 16-18. Reportery fluorescencyjne umożliwiły łatwe monitorowanie wielu linii komórkowych i konstruktów in vitro, ale odniosły ograniczony sukces w obrazowaniu in vivo ze względu na nakładanie się autofluorescencji tkanek i futra oraz widma emisyjne wielu powszechnie stosowanych reporterów fluorescencyjnych, w tym GFP, DsRed i TdTomato 15,19. Problem ten zachęcił do opracowania białek fluorescencyjnych dalekiej czerwieni, które pozwalają na lepszą penetrację tkanek i wyższy sygnał specyficzny w porównaniu z tłem 15,19. TurboFP650, białko fluorescencyjne pokazane w tym systemie, jest znacznie przesunięte ku czerwieni i rozwiązuje wiele problemów związanych z obrazowaniem białek fluorescencyjnych u żywych zwierząt.
Ta metoda rozwoju i ekspansji komórek NK pochodzących z hESC pozwoliła nam na dalsze scharakteryzowanie komórek NK pochodzących z hESC in vitro i in vivo, co jest niezbędne do lepszego zrozumienia funkcji komórek NK i klinicznie ważne dla poprawy obecnych terapii adoptywnych komórek NK. Jest również podatny na wyprowadzanie i ekspansję komórek NK pochodzących z iPSC. Schemat obrazowania podwójnej fluorescencji i bioluminescencji ma szerokie zastosowanie w systemach innych niż model przeciwnowotworowy, który tutaj pokazaliśmy.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materiały&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Pożywki&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Pożywka BPEL do generowania Spin EB&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Modyfikowane podłoże Dulbecco Iscove'a (IMDM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3022801</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina Nutrient Mixture F-12 z Glutamax I</td><td>Invitrogen</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3311</td><td>Komercyjnie dostępne BSA mogą być cytotoksyczne dla komórek ES. Dejonizacja roztworu może zmniejszyć potencjał cytotoksyczności.</td></tr><tr><td>Polioalkohol winylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Kwas linolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Kwas linolenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Synthechol 500X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5442</td><td></td></tr><tr><td>a-monotioglicerol (a-MTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5442</td><td></td></tr><tr><td>Bezbiałkowa mieszanina hybridoma mix II</td><td>Invitrogen</td><td>12040077</td><td></td></tr><tr><td>2-fosforan kwasu askorbinowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór 100X Insulin, Transferrin, Selenium (ITS)</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Pożywka do różnicowania NK &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Modyfikowane podłoże Eagle'a Dulbecco (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka F-12</td><td>Invitrogen</td><td>CX30315</td><td></td></tr><tr><td>15% ludzka surowica AB</td><td>Valley Biomed</td><td>HP1022HI</td><td></td></tr><tr><td>5 ng/ml selenianu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>50 uM etanolaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml kwasu askorbinowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>25 uM 2-merkapto&amp;#8211;etanolu (BME)</td><td>Gibco</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-glutaminy</td><td>Gibco</td><td>CX30310</td><td></td></tr><tr><td>1% Pen-Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Cytokiny&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">(wszystkie cytokiny użyte świeżo z mrożonych alikwotów)</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>300-07</td><td>40 ng/ml w pożywce BPEL; 20 ng/ml w pożywce NK). Zgodnie z protokołem Elefanty, a także w wyniku naszych doświadczeń z wadliwą partią BMP4, mogą występować różnice między partiami cytokin w odniesieniu do różnicowania hematopoetycznego. Zwłaszcza przy zakupie cytokin w dużych ilościach, należy pobrać próbkę z partii do testów przed zakupem. Porównać bezpośrednio z poprzednią partią.</td></tr><tr><td>rhBMP-4</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>314-BP</td><td>20 ng/ml w pożywce BPEL</td></tr><tr><td>rhVEGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>293-VE</td><td>20 ng/ml w pożywce BPEL</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-02</td><td>1 x 10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt; U/ml podawane myszom po wstrzyknięciu komórek NK; 50 U/ml stosowane w protokole ekspansji komórek NK</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-15</td><td>10 ng/ml podawane myszom po wstrzyknięciu komórek NK (tylko przez pierwsze 7 dni)</td></tr><tr><td>IL-3</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-03</td><td>5 ng/ml w pożywce NK</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-07</td><td>20 ng/ml w pożywce NK</td></tr><tr><td>Flt-3-Ligand</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>300-19</td><td>10 ng/ml w pożywce NK</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;&lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; Obrazowanie&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sód D-lucyferyny</td><td>Gold BioTechnology</td><td>Lucna-500</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid TurboFP650</td><td>Evrogen, Moskwa, Rosja</td><td>FP731</td><td>Subklonowany do plazmidu opartego na transpozonie Sleeping Beauty pod promotorem mCAGs. Komórki zostały następnie wyselekcjonowane metodą FACS pod kątem ekspresji turboFP650. Komórki i plazmidy można uzyskać z naszego laboratorium.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Sprzęt&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>System obrazowania IVIS Spectrum</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Komórki&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sztuczne komórki prezentujące antygen wykazujące ekspresję związanej z błoną IL-21</td><td><a href="http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> MD Anderson, Houston, TX</a></td><td></td><td>kontakt: Dean A. Lee. &lt;a href="http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood" target="_blank"&gt;http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>hESC wykazujące ekspresję lucyferazy świetlikowej</td><td>University of Minnesota, Minneapolis, MN</td><td></td><td>kontakt: Dan S. Kaufman. Komórki H9 zmodyfikowane metodą opartą na transpozonie Sleeping Beauty (referencje 13 i 14). Ekspresja lucyferazy świetlikowej jest sterowana przez promotor mCAGGS. Za genem lucyferazy świetlikowej znajduje się element IRES na końcu 5' konstruktu fuzji GFP:zeocyna.</td></tr><tr><td>Komórki K562 wykazujące ekspresję TurboFP650</td><td>University of Minnesota, Minneapolis, MN</td><td></td><td>kontakt: Dan S. Kaufman. Opis w sekcji uwag do plazmidu</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class="jove_content"&gt;&lt;strong&gt;Tabela materiałów.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek nk z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hesc) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (ipsc)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Przedstawiamy metodę wyprowadzania komórek NK (natural killer) z niezróżnicowanych hESC i iPSC przy użyciu podejścia bez feederu. Ta metoda powoduje wysoki poziom komórek NK po 4 tygodniach hodowli i może ulegać dalszej ekspansji 2-log za pomocą komórek prezentujących sztuczny antygen. Komórki NK pochodzące z hESC i iPSC rozwinięte w tym systemie mają dojrzały fenotyp i funkcję. Produkcja dużej liczby genetycznie modyfikowalnych komórek NK ma zastosowanie zarówno w podstawowych badaniach mechanistycznych, jak i przeciwnowotworowych. Ekspresja lucyferazy świetlika w komórkach NK pochodzących z hESC pozwala na nieinwazyjne podejście do śledzenia wszczepienia, dystrybucji i funkcji komórek NK. Opisujemy również schemat podwójnego obrazowania, który umożliwia oddzielne monitorowanie dwóch różnych populacji komórek w celu wyraźniejszego scharakteryzowania ich interakcji in vivo. Ta metoda wyprowadzania, ekspansji i podwójnego obrazowania in vivo zapewnia niezawodne podejście do wytwarzania komórek NK i ich oceny, co jest niezbędne do ulepszenia obecnych terapii adoptywnych komórek NK.

Generowanie hematopoetycznych komórek progenitorowych przy użyciu metody spin EB umożliwia optymalny rozwój komórek NK z hESC i iPSC. Jak pokazano na Rysunku 2, spin EB w 11. dniu zawierają wysokie odsetki komórek progenitorowych wykazujących ekspresję CD34, CD45, CD43 i CD31. Wysokie poziomy CD34 i CD45 pozwalają na bezpośredni transfer do warunków hodowli NK bez konieczności sortowania lub stosowania wspomagających komórek zstrojowych. W przypadku nieoptymalnej różnicowania spin EB zaleca się zastosowa...

Ten protokół opisuje rozwój, ekspansję i obrazowanie in vivo komórek NK pochodzących z hESC i iPSC.

Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie ludzkich komórek NK lub NK z rozmytych, silnych komórek macierzystych. Osiąga się to poprzez pierwsze wygenerowanie hematopoetycznych komórek progenitorowych. W drugim etapie krwiotwórcze komórki progenitorowe są różnicowane w komórki NK za pomocą zdefiniowanych cytokin.Następnie komórki NK mogą być testowane w różnych testach funkcjonalnych. W ostatnim etapie podwójne obrazowanie służy do monitorowania zdolności komórek NK do zabijania celów nowotworowych in vivo. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z tradycyjnymi istniejącymi metodami, takimi jak różnicowanie za pośrednictwem komórek zrębu lub regularne tworzenie EB, jest to, że kolczasty system B zapewnia całkowicie zdefiniowane, wolne od karmienia podejście do ekspansji komórek progenitorowych na dużą skalę, które można różnicować w komórki NK .Implikacje tej techniki rozszerzają się w kierunku leczenia przewlekłych infekcji wirusowych, a także raka, ponieważ wykazano, że komórki NK są ważnymi komórkami efektorowymi w obu tych chorobach. Aby przygotować się do posiewu ciała zarodka lub EB, najpierw odpipetuj 150 mikrolitrów sterylnej wody do 36 zewnętrznych dołków okrągłej płytki 96-dołkowej z niskim nasadką, aby zminimalizować parowanie. Następnie odessać pożywkę z embrionalnej łodygi i indukowanych pluripotencjalnych hodowli komórek macierzystych i dodać jeden mililitr Prewarm trip.Wybrać umieścić alejkę wycieczkową zawierającą płytki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie po pięciu minutach delikatnie odpipetować komórki z płytki, przenieść zdysocjowane komórki do stożkowej rurki i pipetować roztwór komórek w górę iw dół, aby rozbić wszelkie grudki. Teraz rozcieńczyć podróż Ali jedną równą objętością pożywki BPEL i co najmniej jedną równą objętością DPBS i wirować komórki przez pięć minut w temperaturze 480 razy G i ośmiu stopniach Celsjusza. Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach, pożywce BPEL plus pięć mililitrów DPBS.Po ponownym odwirowaniu komórek ponownie zawieś granulkę w pięciu do 10 mililitrach pożywki BPEL, a następnie przepuść komórki przez filtr 70 mikronów do świeżej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, aby usunąć wszelkie grudki. Po odliczeniu i odwirowaniu przefiltrowanych komórek Resus, zawieś podniebienie na trzy razy 10 do czwartej komórki na mililitrową płytkę, 100 mikrolitrów komórek do każdej z wewnętrznych 60 dołków wcześniej przygotowanych 96-dołkowych płytek, a następnie wiruj 96-dołkowe płytki przez cztery minuty w temperaturze 480 razy G i ośmiu stopniach Celsjusza. Następnie ostrożnie umieść płytki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą wielokanałowej pipety wysłanej do 100 mikrolitrów.Rozpocznij ten następny krok od przeniesienia sześciu spinowych EBS do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Następnie dodaj 400 mikrolitrów pożywki różnicującej NK zawierającej cytokiny do każdej studzienki, aby uzyskać całkowitą objętość w każdym dołku do około jednego mililitra. Inkubuj komórki przez 28 dni, karmiąc kultury co pięć do siedmiu dni różnicowaniem NK, pożywką zawierającą cytokiny.W 28 dniu komórki NK będą wyrażać dojrzały fenotyp po przeniesieniu do hodowli różnicowania komórek NK. Aby przetestować cytotoksyczność komórek NK, należy przeprowadzić czterogodzinny test uwalniania chromu w celu wygenerowania dużej liczby komórek NK do eksperymentów in vivo. Współhodowla komórek za pomocą sztucznego antygenu przy użyciu protokołu wcześniej zademonstrowanego przez Sochi i wsp.Rozpocznij ten krok od zawieszenia przez Resus żądanej liczby komórek nowotworowych w 200 mikrolitrach zmodyfikowanej pożywki delco lub IM DM uzupełnionej 20% FBS. Następnie za pomocą igły o rozmiarze 27 lub 28 wstrzyknij komórki nowotworowe podskórnie do lewej górnej części klatki piersiowej każdego sześcio- do ośmiotygodniowego nieotyłego diabetyka. Ciężki złożony niedobór odporności z myszą z nokautem łańcucha gamma.Pozwól komórkom nowotworowym wszczepić się przez cztery dni. Komórki powinny tworzyć bańkę pod skórą myszy. Następnie ponownie zawieś żądaną liczbę komórek NK pochodzących z HESC w 300 mikrolitrach IMDM, uzupełnionych 20% FBS bez antybiotyków.Następnie, używając nowej igły o rozmiarze 27 lub 28 dootrzewnowym, wstrzyknij komórki NK pochodzące z HESC każdej myszy z guzem. Następnie, aby monitorować wszczepianie komórek za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, wstrzyknij każdej myszy otrzewnej 120 mikrolitrów D lucyferianu. Po znieczuleniu myszy umieść zwierzęta w spektrum IVUS w ciągu 10 minut po wstrzyknięciu D lucyferian, zabezpiecz każdą mysz na plecach za pomocą rzepów, a następnie ustaw maszynę IVUS na właściwej platformie obrazowania.Teraz ustaw wygięcie na średnie, a stop F na jeden, a następnie uzyskaj obraz przez jedną minutę, aby wykonać obrazowanie fluorescencyjne dla turbo FP sześć 50 dodatnich komórek. Najpierw użyj kreatora obrazowania, aby skonfigurować skanowanie emisji w celu zmierzenia interesującej sondy, a także sygnału tła z listy sond. Wybierz wejście EM ex i wprowadź 605 dla wzbudzenia i 660 do 720 dla emisji dla sygnału guza.Następnie wybierz dodaj sondę dla sygnału tła. Ustaw wzbudzenie na 570, a emisję na 640 na 720. Filtry można również ustawić za pomocą przycisku konfiguracji filtra.Na koniec pozwól myszom w pełni wyzdrowieć ze znieczulenia przed przetransportowaniem ich z powrotem do obiektu dla zwierząt. Obrazy można analizować za pomocą pakietu oprogramowania do obsługi obrazu rzeczywistego w wersji 4.2. Dzień 11, spin EBS zawiera wysoki procent komórek progenitorowych eksprymujących CD 34, CD 43, CD 45 i CD 31.Wysokie poziomy CD 34 i CD 45 umożliwiają bezpośredni transfer do warunków komórek NK bez konieczności sortowania lub podtrzymywania komórek zrębu. Komórki NK można wykryć za pomocą cytometrii przepływowej. Po czterech tygodniach kultury.Komórki w obrębie chodu limfocytów są analizowane pod kątem ekspresji CD 56. Komórki CD 56 dodatnie mogą być następnie dalej analizowane pod kątem koekspresji markerów, takich jak CD one 17, CD 94 lub NK P 46. Komórki NK utrzymują ekspresję genów reporterowych, które zostały zmodyfikowane do macierzystej linii E-S-I-P-S i dlatego mogą być obserwowane in vivo.W tym przypadku widmo IVUS zostało wykorzystane do zademonstrowania jednoczesnego obrazowania zarówno komórek NK, jak i komórek nowotworowych. W tym samym mysim obrazowaniu bioluminescencyjnym lucyferazy świetlika, komórki nnk pochodzące z HESC w dniu zero siódmym i 14 po wstrzyknięciu komórek NK pokazano obrazowanie fluorescencyjne komórek turbo FP sześć 50 dodatnich komórek K 5 6 2 w dniu zero siedem i 14. Po wstrzyknięciu komórek NK pokazano tutaj sekwencję pokazującą autofluorescencję tkanek i sygnał fluorescencyjny z wygenerowanych komórek turbo FP sześć 50 dodatnich.Pokazano korzystanie z funkcji rozmieszania spektralnego w oprogramowaniu do obsługi obrazu na żywo. Te myszy są kontrolne bez wstrzykiwań i pokazują tylko sygnał tła. Podczas próbowania tej techniki ważne jest, aby utrzymać wysoką jakość hodowli ES i IPSL, a także przeprowadzić różnicowanie DYS spinny b zgodnie z opisem.

development-expansion-vivo-monitoring-human-nk-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Rozwój, Ekspansja i In vivo Monitorowanie Komórek NK Ludzkich pochodzących z Ludzkich Zarodkowych Komórek Macierzystych (hESC) i Indukowanych Komórek Macierzystych Wielopotencjalnych (iPSC)

W związku z rosnącym zainteresowaniem terapiami komórkami macierzystymi, techniki obrazowania molekularnego są idealne do monitorowania zachowania tych komórek po transplantacji. Geny reporterowe lucyferazy umożliwiły nieinwazyjną, powtarzalną ocenę przeżywalności, lokalizacji i proliferacji komórek in vivo. W niniejszym filmie zaprezentrowano sposób śledzenia proliferacji hESC w żywej myszy.

Obrazowanie genem reporterowym bioluminescencyjnym ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vitro i in vivo

W niniejszej pracy opisujemy metodę wydajnej ekspansji i oczyszczania dużych ilości ludzkich komórek NK oraz oceny ich funkcji.

Ekspansja, oczyszczanie i ocena funkcjonalna ludzkich komórek NK z krwi obwodowej

Jakość embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) zależy od wyboru odpowiedniego szczepu myszy, takiego jak CF-1. MEFs wspierające pluripotencję oraz pożywka warunkowana (CM) uzyskana z tych komórek powinny zawierać optymalne stężenia Activin A, Gremlin oraz Tgfβ1, które są niezbędne do współdziałania szlaków Activin/Nodal i FGF w celu utrzymania samoodnawiania i pluripotencji.

Przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych myszy odpowiednich do hodowli ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), oparte na wzroście pojedynczych komórek bez typu kolonijnego (NCM) zdysocjowanych pojedynczych komórek. Ta nowa metoda, wykorzystująca inhibitory kinaz związane z Rho lub izoformę lamininy 521 (LN-521), jest odpowiednia do wytwarzania dużych ilości jednorodnych hPSC, manipulacji genetycznych i odkrywania leków.

Alternatywne hodowle do produkcji, utrzymania i analizy genetycznej ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Protokoły opisują dwa systemy testów toksyczności rozwojowej in vitro (UKK i UKN1) oparte na ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych i badaniach transkryptomu. Systemy testowe przewidują zagrożenie toksycznym wpływem na rozwój człowieka i mogą przyczynić się do zmniejszenia liczby badań na zwierzętach, kosztów i czasu potrzebnego na przeprowadzenie badań bezpieczeństwa chemicznego.

Testy toksyczności rozwojowej na podstawie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badań przesiewowych bezpieczeństwa chemicznego i generowania danych z biologii systemowej

Opisane protokoły pozwalają laboratoriom na przeprowadzanie skalowalnych, przylegających hodowli komórek macierzystych z dużą wydajnością przy minimalnym nakładzie pracy, doświadczenia i inwestycji w sprzęt przy użyciu programowalnego robota do obsługi cieczy i 96-dołkowych płytek.  iPSC pasażowane ponad 20 razy w tym systemie utrzymywały pluripotencję, prawidłowe kariotypy i różnicowały się w kardiomiocyty.

Skalowalna hodowla i produkcja iPSC na 96-dołkowych płytkach przy użyciu zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Obecny protokół pokazuje, jak odróżnić komórki CD3−/CD45+CD56+ o łagodnej cytotoksyczności od ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale (hEPSC) zarówno w warunkach hodowli 3D, jak i 2D. Pozwala to na rutynową walidację fenotypową bez niszczenia złożonego mikrośrodowiska.

Generowanie komórek NK z ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale

Tutaj prezentujemy metodę różnicowania i rozszerzania ludzkich komórek NK wyrażających chimeryczny receptor antygenowy (CAR) pochodzących z ludzkiego iPSC z ulepszonym zabijaniem przeciwko różnym nowotworom złośliwym. Protokół ten demonstruje różnicowanie i ekspansję komórek CAR-NK pochodzących z iPSC zoptymalizowanych pod kątem metody NK oraz pomiar aktywności przeciwnowotworowej przeciwko różnym liniom komórek nowotworowych.

Postępy w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach NK wykazujących ekspresję receptora chimerycznego antygenu macierzystego

Poznaj metodę generowania ludzkich komórek NK z hESC i iPSC przy użyciu bezwłośnikowego podejścia z cytokinami. Technika umożliwia ekspansję progenitorów i obrazowanie in vivo aktywności przeciwnowotworowej.

Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) (Wideo) | JoVE Journal

Rozwój, ekspansja i monitorowanie in vivo ludzkich komórek NK z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)

Przeglądaj więcej filmów