Bioluminescencyjny ortotopowy model progresji raka trzustki

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie ortotopowego mysiego modelu raka trzustki, który wykorzystuje obrazowanie bioluminescencyjne in vivo do nieinwazyjnego monitorowania rozwoju guza. Osiąga się to poprzez pierwsze zawieszenie komórek rakowych znakowanych lucyferazy w Matrigel. Drugim krokiem jest wykonanie laparotomii w celu otwarcia jamy brzusznej oraz zlokalizowania i zabezpieczenia trzustki.

Następnie zawiesinę komórek nowotworowych w matriżelu wstrzykuje się do trzustki. Ostatnim krokiem jest wymiana trzustki i założenie szwów do zamknięcia jamy brzusznej. Ostatecznie obrazowanie bioluminescencyjne służy do monitorowania progresji guza i śledzenia odpowiedzi na interwencje terapeutyczne.

Główną zaletą tego modelu w porównaniu z testami komórkowymi in vitro lub podskórnymi modelami raka trzustki jest to, że naprawdę umożliwia nam badanie interakcji między komórkami nowotworowymi trzustki a mikrośrodowiskiem trzustki. Kinetyka progresji choroby w tym modelu jest wysoce powtarzalna i zachodzi w krótkim czasie, co czyni ten model przydatnym do badania nowych terapii w raku trzustki, co naprawdę ma kluczowe znaczenie dla wykazania tego modelu. Ponieważ wstrzyknięcie komórek nowotworowych musi być wykonane ostrożnie, aby zapobiec wyciekowi, Aby rozpocząć tę procedurę, hodowla.

Komórki raka trzustki, które zostały transdukowane w celu ekspresji lucyferazy, jak opisano w pisemnym protokole, aż osiągną 70% zlewania się, a następnie zbierz komórki z 0,05% trypiną EDTA i policz je za pomocą hemocytometru, upewnij się, że żywotność jest większa niż 90%Następnie osadź komórki, delikatnie odwirowując przy 200-krotności grawitacji przez pięć minut po odwirowaniu, Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki raka trzustki w ilości 20 milionów komórek na mililitr. W mieszaninie trzech do dwóch matrylu i schłodzonego PBS umieść mieszaninę na lodzie. Następnie za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 mililitra i rozmiarze 29.

Pobrać przygotowaną zawiesinę komórek matrigelu do strzykawki. Aby rozpocząć tę procedurę, znieczul mysz za pomocą dwóch do 3% wziewnego izofluranu. Po jednej do dwóch minut sprawdź głębokość znieczulenia, delikatnie ściskając palec myszy w palcu myszy, aby sprawdzić, czy nie ma odruchu pedałowania.

Następnie nałóż odpowiednią ilość lubrykantu na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu. Następnie połóż mysz na plecach na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i delikatnie obróć mysz, aby podnieść lewą stronę brzucha. Po prawidłowym ustawieniu przygotuj brzuch myszy do operacji.

Za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych wykonaj 1,5-centymetrowe nacięcie przez skórę około dwóch milimetrów w lewo od linii środkowej. Następnie wykonaj 1,5-centymetrowe nacięcie w leżącym poniżej mięśniu brzucha. Następnie zlokalizuj śledzionę za pomocą sterylnych kleszczy i delikatnie usuń ją do jamy brzusznej.

Zabezpiecz śledzionę wzdłuż sterylnego wacika, aby odsłonić leżącą pod spodem trzustkę. Następnie zlokalizuj ogon trzustki przylegający do resus śledziony. Zawiesić zawiesinę komórek matrigelu i wstrzyknąć 20 mikrolitrów w ogon trzustki po wstrzyknięciu.

Przytrzymaj strzykawkę na miejscu przez 30 do 60 sekund, aż matrigel zdąży zestalić się, ten ważny krok minimalizuje wyciek komórek. Po wyjęciu igły należy sprawdzić miejsce wstrzyknięcia, aby upewnić się, że nie doszło do wycieku. Następnie przywróć śledzionę i trzustkę do jamy brzusznej.

Zamknij mięśnie brzucha myszy wchłanialnym plecionym czteroma szwami z okrągłą igłą za pomocą ciągłego ściegu. Następnie zamknij zewnętrzną powłokę niewchłanialną żyłką. Sześć aut zszyj igłą tnącą za pomocą ciągłego ściegu i nałóż Betadine.

Następnie należy wyjąć mysz ze środka wziewnego i wstrzyknąć podskórnie od 0,05 do 0,1 miligrama na kilogram buprenorfiny. Jako pooperacyjny środek przeciwbólowy pozwól myszy dojść do siebie w klatce, umieszczonej na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody. Kontynuuj uważne monitorowanie myszy przez pierwsze kilka dni po zabiegu.

Jeśli mysz wykazuje oznaki bólu, takie jak garbienie się lub ograniczona ruchomość, buprenorfina może być podawana podskórnie co 12 godzin przez okres 36 godzin. Po zagojeniu się miejsca operowanego w ciągu siedmiu do 10 dni znieczulij mysz i usuń szwy zewnętrzne. Aby rozpocząć bioluminescencyjne śledzenie komórek raka trzustki.

Ponownie znieczulij mysz za pomocą dwóch do 3% wdychanego izofluoru i nałóż lubrykant na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Po znieczuleniu wstrzyknij 150 miligramów na kilogram Lucyfera poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej i odczekaj od jednej do dwóch minut, aby lucyferian przedostał się do komórek. Umieść mysz na prawym boku w systemie obrazowania bioluminescencyjnego tak, aby guz był skierowany w stronę kamery.

Tutaj używamy systemu obrazowania Illumina two . Następnie uchwyć obrazy w świetle białym i bioluminescencji za pomocą oprogramowania do obrazowania, jak opisano wcześniej w innych artykułach JOV. Po zakończeniu obrazowania wyjmij mysz z wziewnego środka znieczulającego i pozwól jej dojść do siebie w klatce domowej.

Powtarzaj te kroki przez cały czas trwania wzrostu guza, aby zbadać wzrost guza. Kinetyka. Zastosowanie linii komórkowych znakowanych lucyferazy zapewnia unikalny sposób pomiaru wzrostu guza. Nieinwazyjnie. Pokazano tutaj mysz 10 dni po wstrzyknięciu ze stosunkowo małym guzem, 31 dni po wstrzyknięciu, gdy guz się powiększył i pięć dni po wycięciu guza.

Bioluminescencja widoczna na tym zdjęciu pokazuje nawrót guza trzustki pięć dni po resekcji, a także przerzuty do pobliskiej wątroby. Pokazany tutaj wykres pokazuje podobne tempo wzrostu dla metody wstrzykiwania komórek matrigelowych. Opisano w tym filmie, porównano inną metodę, w której przeszczepiane są fragmenty guza trzustki, które wylądowały.

Podobną kinetykę wzrostu można zaobserwować zarówno w przypadku patelni, jak i kapsyny. Linie komórkowe po uśmierceniu, barwieniu H i D zostały przeprowadzone w celu wykazania inwazyjnego charakteru komórek raka trzustki do otaczającej tkanki trzustki, oznaczonej żółtymi gwiazdkami, a także przerzutów w innych narządach, w tym w wątrobie pokazanej tutaj. Po opanowaniu tej metody można ją wykonać w około 10 minut.

Ponadto biocentyczna wizualizacja progresji choroby przerzutowej i nawrotowej sprawia, że model ten jest klinicznie istotny, ponieważ obecnie większość terapii przeciwnowotworowych ma charakter paliatywny.