Izolacja podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie komórek jednojądrzastych z krwi pępowinowej za pomocą wirowania w gradiacji gęstości. W drugim etapie antygeny powierzchniowe komórek są znakowane przeciwciałami sprzężonymi z biotyną, aby magnetycznie zubożyć dowolne z pozostałych komórek innych niż B.

Następnie wyizolowane limfocyty B są znakowane fluorescencyjnie przeciwciałami przeciwko antygenom powierzchniowym komórek CD 19, CD 34 i CD 45. W ostatnim etapie komórki są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu odzyskania podzbiorów prekursorowych komórek B. Ostatecznie można pozyskać komórki o wystarczającej liczbie i jakości do wykorzystania w dalszych testach wymagających wysokiej jakości DNA i RNA.

Jedną z zalet strategii sortowania komórek w porównaniu z alternatywnymi metodami jest to, że nasza strategia wymaga mniej czasu na cytometr przepływowy i tylko trzech przeciwciał fluorescencyjnych, co znacznie obniża koszt eksperymentu. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą zmagać się z różnorodnością dostępnych metod przygotowania komórek krwi pępowinowej do cytometrii przepływowej oraz złożonością przygotowania cytometru przepływowego. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w zdrowe prekursorowe limfocyty B, może być również stosowana do innych typów komórek obecnych we krwi pępowinowej, takich jak limfocyty T, lub do badań nad chorobami obejmującymi dowolne komórki krwiotwórcze, takie jak białaczka lub chłoniak.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ trudno jest opisać właściwe techniki wymagane do przetwarzania krwi pępowinowej i komórek w sposób, który maksymalizuje żywotność komórek i zmniejsza obecność zanieczyszczeń. Aby wyizolować komórki jednojądrzaste z krwi pępowinowej, najpierw rozcieńcz osiem mililitrów podwielokrotności krwi pępowinowej 24 mililitrami DPBS. Następnie powoli ułóż każdą rozcieńczoną mieszaninę krwi na 15 mililitrach ALI watów fipa plus w 50-mililitrowych stożkowych probówkach, uważając, aby warstwy były oddzielone.

Następnie odwiruj krew przez 40 minut w temperaturze 400 razy G i 20 stopni Celsjusza, podczas gdy komórki są rozdzielane za pomocą etykiety gradientu gęstości z siedmioma pięciomililitrowymi probówkami z okrągłym dnem z datą identyfikacji próbki i wszelkimi innymi odpowiednimi informacjami, jak opisano w tabeli. Po oddzieleniu komórki jednojądrzaste pozostaną na granicy faz osocza fi nieprzezroczystego, podczas gdy granulocyty i erytrocyty będą teraz osadzać się w górnych warstwach plazmy, unikając kontaktu z warstwami komórek jednojądrzastych. Następnie użyj szklanej pipety o pojemności 10 mililitrów, aby ostrożnie zebrać warstwy komórek jednojądrzastych z trzech z 50-mililitrowych probówek do jednej nowej 50-mililitrowej probówki.

Napełnij tę nową probówkę PBS, delikatnie wymieszaj zawiesinę komórek, a następnie umyj komórki dwa razy przez 10 minut w temperaturze 300 razy G i 20 stopni Celsjusza. Po pierwszym praniu ponownie zawiesić granulki i przenieść do pojedynczej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Po drugim praniu delikatnie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach PBS, przenieść jeden mikrolitr zawiesiny komórek na jeden mililitr PBS w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej w celu zliczenia.

Następnie umyj komórki w 50-mililitrowej probówce większą ilością PBS, a następnie całkowicie usuwając supernatant bez naruszania osadu. Aby wyizolować limfocyty B od komórek jednojądrzastych, najpierw Resus zawiesił właśnie umytą pastylkę w 160 mikrolitrach o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Świeżo przygotowany bufor DGAs E-D-T-A-P-B-S.

Następnie wymieszaj 40 mikrolitrów zestawu do izolacji komórek B, koktajlu przeciwciał bio ITIN z zawiesiną komórkową. Po inkubacji komórek przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, zmyj wolne przeciwciało w jednym mililitrze czterech stopni Celsjusza, buforze E-D-T-A-P-B-S na 10 milionów komórek. Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 320 mikrolitrach buforu E-D-T-A-P-B-S o czterech stopniach Celsjusza.

Teraz wymieszaj 80 mikrolitrów mikrogranulek antybiotyny z zawiesiną komórkową po 15 minutach inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie umyj komórki, gdy komórki się obracają. Umieść kolumnę LS w polu magnetycznym separatora max i przelej przez kolumnę trzy mililitry buforu E-D-T-A-P-B-S o czterech stopniach Celsjusza.

Następnie ponownie zawieś do 100 milionów umytych komórek w 500 mikrolitrach o temperaturze czterech stopni Celsjusza, buforze E-D-T-A-P-B-S. Następnie odpipetować zawiesinę komórek na kolumnę, zbierając nieoznakowane komórki, które przechodzą przez kolumnę w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Dodaj dodatkowe dwa mililitry buforu E-D-T-A-P-B-S o czterech stopniach Celsjusza do ścianek oryginalnej stożkowej probówki, po jednym mililitrze na raz, a następnie delikatnie wymieszaj i pipetuj pozostałą zawiesinę komórek na kolumnę za każdym razem, aby mieć pewność odzyskania wszystkich komórek.

Na koniec napełnij stożkową probówkę zawierającą nieoznakowane komórki PBS. Po odwirowaniu komórki ostrożnie usuwają supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Następnie delikatnie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach buforu E-D-T-A-P-B-S.

Rozpocznij znakowanie przeciwciałami. Postępuj zgodnie z krokami, najpierw przenosząc jeden mikrolitr zawiesiny komórek do wcześniej oznaczonej niebarwionej probówki. Dodaj 500 mikrolitrów buforu E-D-T-A-P-B-S do probówki i przechowuj go na lodzie.

Wyłącz wszystkie światła, a następnie dodaj po 20 mikrolitrów przeciwciał CD 19, CD 34 i CD 45 na 1 milion komórek do pozostałej zawiesiny komórkowej. Dobrze wymieszaj i umieść probówkę w ciemności na 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś 40 mikrolitrów zawiesiny komórkowej znakowanej przeciwciałem do probówki znakowanej siedmioma A a D.

Umyj komórki w jednym mililitrze PBS, a następnie ponownie zawieś paletę w 100 mikrolitrach buforu wiążącego. Dodać siedem mikrolitrów po siedem A a d do tych komórek, a następnie inkubować je w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej, podczas gdy komórki są znakowane siedmioma A a d uzupełnić probówkę komórek znakowanych przeciwciałami PBS, umyć komórki znakowane przeciwciałem, a następnie ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu E-D-T-A-P-B-S. Teraz przenieś całą objętość zawiesiny komórek znakowanej przeciwciałem do probówki znakowanej CD 19 dodatniej CD 34 dodatniej CD 45.

Przepłukać probówkę dodatkowym mililitrem buforu E-D-T-A-P-B-S i przenieść pozostałą zawiesinę komórek do probówki CD 19 dodatniej CD 34 dodatniej CD 45 znakowanej dodatnio. Na koniec dodaj 300 mikrolitrów buforu wiążącego do probówki z siedmioma A a D, aby posortować komórki za pomocą cytometru przepływowego MO flow XDP. Najpierw skonfiguruj przepływ MO do sortowania, uruchom odpowiednie kontrole kompensacji, a następnie utwórz protokół zawierający wykresy, jak pokazano na tym rysunku.

Upewnij się, że system ewakuacji aerozolu działa przez cały czas, a następnie użyj niebarwionej próbki do ustawienia napięcia i wzmocnienia dla przednich i bocznych wykresów rozproszenia. Identyfikacja populacji o ujemnej fluorescencji. Ustaw próg na mniej niż lub równy 1%, aby DNA zawierające szczątki nie zanieczyściło odzyskanych próbek.

Uruchom około 50 000 zdarzeń próbki CD 19 dodatniej CD 34 dodatniej CD 45. Aby ustawić strategię bramkowania, jak właśnie pokazano, bramkowanie wsteczne niezakwaszonej populacji CD 19 dodatniej CD 34 na wykresie rozproszenia bocznego w porównaniu z wykresem rozproszenia do przodu. Aby upewnić się, że chód limfocytów zawiera potencjalne komórki pro B.

Użyj tej próbki, aby również ustawić populację ujemnej fluorescencji dla barwienia siedmioma a a d. Następnie uruchom próbkę z siedmioma a a d, aby określić żywotność próbki, sortuj komórki tylko z próbki o żywotności większej lub równej 95% na początku, ponieważ martwe komórki będą plamić się bezkrytycznie i mogą zanieczyścić populacje sortowania, które teraz ustalają decyzje o sortowaniu do zbierania dla populacji CD 19 dodatnich, CD 34 dodatnich CD 19, CD 34 ujemna CD 45, niska CD 19 dodatnia, CD 34 ujemna, CD 45 średnia i CD 19 dodatnia. CD 34 negatyw CD 45 wysoki.

Uwzględnij bramki dyskryminacji limfocytów i dubletów w decyzjach sortowania wszystkich populacji, aby zapobiec zatorom. W końcówce sortującej przefiltrować CD 19 dodatnią CD 34 dodatnią próbkę CD 45 przez sitko o średnicy 40 mikronów bezpośrednio przed sortowaniem. Następnie umieść oznakowane probówki zbiorcze pokryte 2%FBS w PBS w uchwycie na probówki wypełnione lodem i posortuj komórki do odpowiedniej probówki zbiorczej natychmiast po zakończeniu sortowania.

Ekstrakcja DNA między odmianami próbki odgrywa rolę w sukcesie komórki, sortuj w dobrym sortowaniu. W chodzie limfocytów występuje wysoki odsetek komórek. Próbki o dobrych wskaźnikach powodzenia zawierają niski poziom zanieczyszczeń, o czym świadczy niewielka liczba zdarzeń, które mieszczą się poniżej i na lewo od bramkowanej populacji limfocytów.

Próbki o słabych wskaźnikach powodzenia zawierają wysoki poziom zanieczyszczeń. Słabe próbki wskazują na wyraźny wzrost tych zdarzeń. Komórki posortowane przepływowo i następnie DNA wyizolowane z każdego podzbioru prekursorowych komórek B są odpowiednie pod względem ilości i jakości, aby można było przeprowadzić dalsze analizy.

Rutynowo wykorzystywaliśmy to DNA w Myrze do wzbogacenia z metylowanego DNA, tutaj DNA, wyizolowane z komórek CD 19 dodatnich CD 34 CD 19 dodatnich, CD 34 ujemnych CD 45 niskich komórek CD 19 dodatnich, CD 34 ujemnych CD 45 średnich komórek i CD 19 dodatnich CD 34. Ujemne komórki o wysokim poziomie CD 45 poddano sonikacji na wysokim poziomie przez łącznie dziewięć minut, kolumnie oczyszczono, a następnie zwizualizowano na 1% żelu aros z barwnikiem żelu z cyber zielonym kwasem nukleinowym na tym pasie. Przeprowadzono również kontrolną drabinę 100 par zasad po Myrze przy użyciu metody aktywnego motywu, kolektora ultra kit PCR z kontrolną metylacją SLC 25 A 37 i kontrolną niemetylowaną genami APC one, aby potwierdzić wzbogacenie metylowanego DNA.

Wyższe wzmocnienie SLC 25. A 37 potwierdza wzbogacenie metylowanego DNA w podzbiorach prekursorowych komórek B Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu 10 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby traktować komórkę bardzo delikatnie i używać zoptymalizowanej ilości przeciwciał, aby zminimalizować wytwarzanie zanieczyszczeń Zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, można przeprowadzić, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak geny metylowane i podzbiory prekursorowych komórek B. Nie zapominaj, że praca z żywymi komórkami ludzkimi może być niezwykle niebezpieczna, a środki ostrożności, takie jak uruchomienie systemu ewakuacji aerozolu, powinny być podejmowane przez cały czas wykonywania tej procedury.