Name: Izolacja podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Naucz się izolować podzbiory prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej przy użyciu cytometrii przepływowej i gradientu gęstości. Ta metoda zapewnia wysokiej jakości kwas nukleinowy do dalszych badań immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NCI R00 CA132784) dla K.T.

1. Izolacja komórek jednojądrzastych z krwi pępowinowej
<ol>
 <li>Przygotować bufor EDTA-PBS - dodać 5 ml roztworu podstawowego albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 95 ml buforu do płukania (rozcieńczenie 1:20). Odgazuj bufor i utrzymuj bufor na lodzie. ważny: Brak odgazowania buforu może skutkować mniej niż optymalnymi wynikami podczas izolowania komórek B CD19 +, ponieważ pęcherzyki mogą blokować kolumnę izolacyjną.</li>
 <li>Przygotować stożkowe probówki o pojemności 50 ml do wirowania w gradiacji gęstości. Określ liczbę probówek potrzebnych do przetworzenia krwi pępowinowej (1 probówka może przetworzyć 8 ml krwi) i dodaj 15 ml Ficoll-Paque PLUS do każdej probówki.</li>
 <li>Rozcieńczyć 8 ml krwi pępowinowej w 24 ml DPBS (1X) i ostrożnie nałożyć rozcieńczoną mieszaninę krwi pępowinowej na wierzch Ficoll-Paque PLUS w każdej ze stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Nie mieszać krwi z Ficoll-Paque PLUS. ważny: Aby uniknąć mieszania się krwi pępowinowej i Ficoll-Paque PLUS, trzymaj probówkę pod kątem 45 stopni i powoli nakładaj mieszaninę krwi.</li>
 <li>Wirować przy 400 x g przez 40 minut w temperaturze 20 °C. Komórki jednojądrzaste (MNC) pozostaną na granicy faz osocza-Ficoll-Paque PLUS, podczas gdy granulocyty i erytrocyty osadzają się ze względu na większą gęstość przy ciśnieniu osmotycznym Ficoll-Paque PLUS. Oznaczyć siedem okrągłodennych probówek o pojemności 5 ml przeznaczonych do użycia w części 3 numerem identyfikacyjnym próbki, datą i następującymi informacjami:</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="zawsze">
 <tbody>
 <tr>
 <td>rura</td>
 <td>etykieta</td>
 <td>cel</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1</td>
 <td>Niepoplamione</td>
 <td>Niebarwione komórki do normalizacji podczas cytometrii przepływowej</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cyfra arabska</td>
 <td>7AAD powiedział:</td>
 <td>Określenie żywotności podczas cytometrii przepływowej</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3</td>
 <td>+++</td>
 <td>Zawiera komórki, które zostaną posortowane</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4</td>
 <td>34+ </td>
 <td>Aby zebrać komórki CD34+/CD19+ (późne pro-B - wczesne pre-BI)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5</td>
 <td>45niski</td>
 <td>Do zbierania komórek CD34-/CD19+/CD45o niskiej zawartości (pre-BI)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6</td>
 <td>45śr. </td>
 <td>Pobieranie komórek CD34-/CD19+/CD45med (pre-BII)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>7</td>
 <td>45wysoki</td>
 <td>Aby zebrać CD34-/CD19+/CD45(niedojrzałe komórki B)</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Pokryj probówki 4, 5, 6 i 7 2% FBS i umieść wszystkie probówki na lodzie.
<ol start="5">
 <li>Ostrożnie zasysać górną warstwę osocza i unikać kontaktu z warstwą komórek jednojądrzastych. Za pomocą szklanej pipety o pojemności 10 ml ostrożnie przenieś warstwę komórek jednojądrzastych do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Połączyć komórki jednojądrzaste z trzech probówek w jedną probówkę o pojemności 50 ml.</li>
 <li>Napełnić probówkę PBS, delikatnie wymieszać i odwirować przy sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C. Ostrożnie zassać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Powtórz 1x. Po pierwszym umyciu ponownie zawiesić granulki i przenieść do pojedynczej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
 <li>Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 200 μl PBS. Pobrać 1 μl zawiesiny komórek, dodać ją do 1 ml PBS w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i odstawić do liczenia (policzyć komórki po umieszczeniu 50 ml zawiesiny komórek w wirówce). Napełnij probówkę PBS i odwiruj przy 200 x g przez 15 minut w celu usunięcia płytek krwi. Usunąć supernatant całkowicie, nie naruszając osadu komórkowego.</li>
</ol>
2. Zmodyfikowana izolacja komórek B z komórek jednojądrzastych za pomocą separacji MACS
<ol>
 <li>Zawiesić osad z kroku 1.7 za pomocą 160 μl zimnego (4 °C) buforu EDTA-PBS.</li>
 <li>Dodać 40 μl koktajlu przeciwciał biotynowych B-CLL. Dobrze wymieszać pipetą i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Umyć komórki - dodać 1 ml zimnego (4 °C) buforu EDTA-PBS na 10 milionów komórek (liczba komórek określona w kroku 1.7) i odwirować przy 300 x g przez 10 min. Całkowicie odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórek w 320 μl zimnego (4 °C) buforu EDTA-Pbs.</li>
 <li>Dodać 80 μl mikrokulek antybiotyny, dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Umyć komórki - dodać 1 ml zimnego (4 °C) buforu EDTA-PBS na 10 milionów komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 min. Ponownie zawiesić do 100 milionów komórek w 500 μl zimnego (4 °C) buforu EDTA-PBS. Skaluj wolumin buforu zgodnie z numerem komórki.</li>
 <li>Przygotuj kolumny MACS i separatory MACS podczas wirowania (krok 2.5). Umieścić kolumnę LS w polu magnetycznym separatora MACS, dodać 3 ml zimnego (4 °C) buforu EDTA-Pbs na kolumnę i pozwolić, aby bufor przepłynął przez kolumnę. Użyj pojemnika, aby złapać przepływ. Odrzuć przepływ.</li>
 <li>Umieścić stożkową probówkę o pojemności 50 ml pod kolumną i odpipetować zawiesinę komórek na kolumnę. Pozwolić, aby nieoznakowane komórki przesączyły się przez kolumnę i trafiły do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. WAŻNE: Są to komórki, które będą używane do znakowania przeciwciał i sortowania komórek. Nie wyrzucaj przepływu. Aby odzyskać wszystkie komórki z kroku 2.5, dodać dodatkowy 1 ml zimnego (4 °C) buforu EDTA-PBS do ścianek stożkowej probówki. Delikatnie wymieszać i odpipetować pozostałą zawiesinę komórek na kolumnę. Powtórz 1x. Przejdź do kroku 2.8, używając nieoznakowanych komórek zebranych w stożkowej probówce po przejściu przez kolumnę.</li>
 <li>Napełnić stożkową probówkę zawierającą nieoznakowane komórki PBS i wirować przy 300 x g przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Dodać 200 μl buforu EDTA-PBS i delikatnie zawiesić komórki.</li>
</ol>
3. Znakowanie przeciwciał i przygotowanie do sortowania komórek
<ol>
 <li>Odessać 1 μl zawiesiny komórkowej i umieścić w probówce oznaczonej jako "niebarwiona" (krok 1.4). Dodać 500 μl buforu EDTA-PBS i przechowywać probówkę na lodzie.</li>
 <li>Dodaj 20 μl każdego przeciwciała (CD19, CD34 i CD45) na milion komórek do pozostałej zawiesiny komórkowej. Dobrze wymieszaj i umieść probówkę w ciemności na 30 minut w temperaturze pokojowej. Przeciwciała CD są wrażliwe na światło, wykonaj kroki 2-4 przy wyłączonych światłach.</li>
 <li>Po 30 minutach inkubacji z przeciwciałami odessać 40 μl zawiesiny komórkowej i umieścić ją w probówce oznaczonej "7AAD". Dodać 1 ml PBS do probówki i odwirować przy 500 x g przez 2 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu wiążącego. Dodać 7 μl 7AAD (7-Aminoactinomycyny D) i inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Podczas 10-minutowej inkubacji wykonać krok 3.4.</li>
 <li>Dodać PBS do górnej części probówki zawierającej pozostałe komórki znakowane przeciwciałami CD. Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant, dodać 500 μl buforu EDTA-PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy. Przenieść całą objętość zawiesiny komórek do probówki oznaczonej "+++". Aby odzyskać całą zawiesinę komórkową, dodać dodatkowy 1 ml buforu EDTA-PBS do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przenieść do probówki oznaczonej "+++".</li>
 <li>Po inkubacji (krok 3.3) dodać 300 μl buforu wiążącego do probówki 7AAD. Próbki "niebarwione", "7AAD" i "+++" oraz probówki "34 +", "45low", "45med" i "45 high" są gotowe do cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
4. Sortowanie komórek za pomocą cytometru przepływowego MoFlo XDP
<ol>
 <li>Konfiguracja MoFlo do sortowania: Wyrównaj lasery, ustabilizuj strumień kropli, określ opóźnienie upuszczania.</li>
 <li>Przygotuj pojedyncze kontrolki kompensacji kolorów za pomocą zestawu koralików Invitrogen AbC Mouse (lub podobnego) zgodnie z instrukcjami producenta. Uruchom sterowanie pojedynczym kolorem, dostosowując napięcia kanałów fluorescencyjnych w celu optymalnej separacji populacji dodatnich i ujemnych. Ustaw współczynniki kompensacji i zastosuj skompensowany parametr do protokołu odbioru. Przywróć współczynniki kompensacji za każdym razem, gdy uzyskuje się nową partię przeciwciał.</li>
 <li>Utwórz protokół zawierający wykresy, jak pokazano na rysunku 2.</li>
 <li>Uruchom niebarwioną próbkę, ustaw napięcie i wzmocnienie dla rozproszenia do przodu i bocznego oraz zidentyfikuj populacje fluorescencji ujemnej. Ponieważ celem jest odzyskanie DNA, próg powinien być ustawiony na niskim poziomie (≤1%), aby szczątki zawierające DNA nie zanieczyszczały odzyskanych próbek. *Upewnij się, że system ewakuacji aerozolu jest uruchomiony przez cały czas, gdy żywe komórki ludzkie są uruchamiane na MoFlo.</li>
 <li>Uruchom małą porcję próbki +++ (~ 50 000 zdarzeń), aby ustawić strategię bramkowania (Rysunek 2). Ponieważ komórki progenitorowe komórek B nie rozpraszają się identycznie jak dojrzałe komórki B, należy umieścić niezainfekowaną populację CD19 + / CD34 + na wykresie SSC vs FSC, aby upewnić się, że brama limfocytów zawiera potencjalne komórki Pro-B. Z tej próbki ustalono również populację ujemnej fluorescencji dla 7AAD.</li>
 <li>Uruchom próbkę 7AAD, aby określić żywotność próbki. Sortuj tylko komórki z próbki o wysokiej żywotności na początku (≥95%), ponieważ martwe komórki będą się barwić bezkrytycznie i mogą zanieczyścić populacje sortu.</li>
 <li>Skonfiguruj decyzje sortowania, aby zebrać cztery populacje: CD19+/CD34+; CD19+/CD34-/CD45niski; CD19+/CD34-/CD45med.; i CD19+/CD34-/CD45wysoki. Uwzględnij bramki dyskryminacji limfocytów i dubletów w decyzjach dotyczących sortowania we wszystkich populacjach.</li>
 <li>Aby zapobiec zatykaniu się końcówki sortującej, należy przefiltrować próbkę +++ przez sitko komórkowe o wielkości 40 μm bezpośrednio przed sortowaniem i ponownie przefiltrować, jeśli podczas sortowania w próbce wystąpi jakakolwiek agregacja.</li>
 <li>Posortuj komórki do probówek zbiorczych (krok 1.4) pokrytych 2% FBS w PBS w schłodzonym lub wypełnionym lodem uchwycie na probówki.</li>
 <li>Natychmiast po zakończeniu sortowania wyekstrahuj DNA.</li>
</ol>

<ol><li>Song, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+%28TDMs%29+with+differential+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression.</a> PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).</li>
<li>Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+The+DNA+methylation+profile+of+tissue-dependent+and+differentially+methylated+regions+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells.</a> Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).</li>
<li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequential+determination+model+of+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The sequential determination model of hematopoiesis.</a> Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).</li>
<li>Clark, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+subsets+in+normal+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte subsets in normal bone marrow.</a> Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).</li>
<li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow.+II.+Normal+B+lymphocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development.</a> Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).</li>
<li>Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+precursors+in+normal+pediatric+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">B-cell precursors in normal pediatric bone marrow.</a> American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).</li>
<li>Tucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+cord+blood+B+cells+functionally+mature%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Are cord blood B cells functionally mature?</a> Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).</li>
<li>Ghia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+of+human+bone+marrow+B+lymphocyte+precursors+by+single-cell+polymerase+chain+reaction+analyses+of+the+rearrangement+status+of+the+immunoglobulin+H+and+L+chain+gene+loci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci.</a> J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).</li>
<li>Noordzij, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+precursor+B-cell+compartment+in+bone+marrow+from+patients+with+X-linked+agammaglobulinemia+compared+with+healthy+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children.</a> Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).</li>
<li>van Zelm, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ig+gene+rearrangement+steps+are+initiated+in+early+human+precursor+B+cell+subsets+and+correlate+with+specific+transcription+factor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression.</a> J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).</li>
<li>Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIRA+method+for+DNA+methylation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MIRA method for DNA methylation analysis.</a> Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).</li>
<li>Kanof, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , Suppl 19. 7.1.1-7.1.7 (1996).</li>
<li>LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+human+B-cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fates of human B-cell precursors.</a> Blood. 96 (1), 9-23 (2000).</li>
<li>Schmid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+society+for+analytical+cytology+biosafety+standard+for+sorting+of+unfixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells.</a> Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).</li>
<li>Malaspina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+of+immature%2Ftransitional+B+cells+in+HIV-infected+individuals+with+advanced+disease%3A+correlation+with+increased+IL-7%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7.</a> PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Czynnikiem, który ma największy wpływ na powodzenie protokołu, jest obecność zanieczyszczeń. W przypadku zamawiania krwi z banku krwi pępowinowej ważne jest, aby krew została wysłana jak najszybciej po pobraniu. Ponadto próbki sklasyfikowane jako limfocytoza zawierają większą liczbę limfocytów; jednak próbki te nie mają odpowiedniej liczby prekursorowych limfocytów B i nie powinny być używane. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania wystarczającej liczby komórek dla każdego z podzbiorów prekursorów, zalecamy rozpoczęcie od co najmniej 85 ml krwi pępowinowej.
Ważne jest, aby pamiętać, że w przeciwieństwie do separacji krwi obwodowej u dorosłych, podczas frakcjonowania krwi pępowinowej warstwa jednojądrzasta jest często zanieczyszczona czerwonymi krwinkami12. Protokół ten obejmuje dodatkowy etap płukania w celu usunięcia zanieczyszczających płytek krwi. Protokoły opisujące separację jednojądrzastą od krwi pępowinowej sugerują włączenie etapu lizy w celu usunięcia niechcianych krwinek czerwonych. Nie zalecamy tego kroku, ponieważ powoduje on powstawanie zanieczyszczeń i ma negatywny wpływ na powodzenie sortowania komórek.
W celu zmniejszenia liczby komórek, które muszą być rozróżniane za pomocą cytometrii przepływowej, konieczne jest wykonanie wzbogacenia komórek B przed sortowaniem komórek. Protokół dostarczony przez Miltenyi Biotec, który towarzyszy zestawowi do izolacji komórek B (B-CLL), został zoptymalizowany pod kątem krwi obwodowej i zaleca stosowanie 10 μl koktajlu przeciwciał biotyny B-CLL na 10 milionów komórek. W tym etapie wykorzystuje się przeciwciała przeciwko CD2 (limfocyty T; Komórki NK), CD4 (limfocyty T), CD11b (granulocyty; monocyty; makrofagi), CD16 (komórki NK; makrofagi; komórki tuczne), CD36 (płytki krwi), CD235a (komórki erytroidalne) w celu zubożenia komórek innych niż B z krwi pępowinowej. Ważne jest, aby używać opisanego zestawu, a nie zestawu do izolacji komórek B II, ponieważ poprzedni zestaw zawiera przeciwciało przeciwko CD43, które jest obecne na komórkach pro-B. Podczas naszej optymalizacji tego protokołu stwierdziliśmy, że łącznie 40 μl koktajlu przeciwciał biotynowych B-CLL wystarcza do uzyskania pozytywnego wyniku sortowania komórek. Ponadto stwierdziliśmy, że użycie zaledwie 5 μl więcej koktajlu przeciwciał biotynowych B-CLL miało niekorzystny wpływ na rodzaj komórek. Dlatego zdecydowanie zalecamy użycie 40 μl koktajlu przeciwciał biotynowych B-CLL dla całkowitej liczby komórek jednojądrzastych między 175-250 milionami. Jeśli zaczynasz od mniejszej lub większej liczby komórek, może być konieczne odpowiednie skalowanie odczynników.
Istnieje wiele sprzecznych publikacji opisujących markery, które można wykorzystać do rozróżnienia subpopulacji komórek B. Większość rozbieżności można wytłumaczyć faktem, że różnicowanie jest procesem ciągłym i że obecność lub brak markerów na powierzchni komórki zachodzi w sposób stopniowy, a nie w sposób "wszystko albo nic". W tym protokole CD34-/CD19 + i poziom intensywności ekspresji CD45 + (niska, średnia, wysoka) wykorzystano do rozróżnienia komórek B pre-BI, pre-BII i niedojrzałych ze wzrostem poziomu ekspresji CD45 odpowiadającym progresji różnicowania6. Komórki Pro-B zostały opisane przez niektórych jako CD19 + / CD34 + 13 , podczas gdy inni wykazali, że komórki pro-B to CD19 / CD34 + , a komórki pre-BI to CD19 + / CD34 + 9,10. Na podstawie tych rozbieżności oznaczyliśmy komórki CD19 + / CD34 + jako późne komórki pro-B / wczesne komórki pre-BI. Należy zauważyć, że strategia ta została opracowana w celu wyizolowania podzbiorów prekursorowych limfocytów B, które odpowiadają komórkom dotkniętym chorobą ostrej białaczki limfoblastycznej. Istnieje jednak wiele strategii sortowania, które można zastosować w zależności od podtypu komórki będącej przedmiotem zainteresowania.
Kombinacje przeciwciało-fluorochrom należy dobierać w oparciu o możliwości dostępnego sortera komórek. Zgodnie z ogólną zasadą, najjaśniejszy fluorochrom w panelu powinien być używany do oznaczania najmniej zaludnionego antygenu i odwrotnie. W wykrywaniu podwójnie barwionych populacji, zwłaszcza rzadkich zdarzeń, takich jak te, dyskryminacja dubletowa (Figura 2B) jest niezwykle ważną częścią strategii bramkowania. Gwarantuje to, że zdarzenia podwójnie dodatnie są naprawdę pojedynczymi komórkami wybarwionymi obydwoma przeciwciałami, a nie tylko dwiema pojedynczymi barwionymi komórkami przylegającymi do siebie.
Szybkie, 4-kierunkowe sortowanie komórek z konieczności tworzy kontrolowane środowisko aerozolowe. Dlatego sortowanie żywych komórek ludzkich powinno być wykonywane z dużą ostrożnością. Opublikowane wytyczne dotyczące bezpieczeństwa i dekontaminacji są dostępne i powinny zostać przejrzane i wdrożone przed sortowaniem14. Przed sortowaniem może być wymagane zatwierdzenie przez Instytucjonalne Komitety ds. Bezpieczeństwa Biologicznego lub ich odpowiedniki. W celu prawidłowego odkażenia po sortowaniu należy dodać wybielacz do pojemnika na odpady do końcowego stężenia 10%. Podobnie, wszystkie rurki do pobierania próbek, a także wszystkie powierzchnie w bezpośrednim sąsiedztwie powinny być dokładnie odkażone świeżo przygotowanym 10% roztworem wybielacza.
Podsumowując, protokół ten zapewnia strategię uzyskiwania rzadkich populacji prekursorowych komórek B i może być modyfikowany w celu wyizolowania dowolnej rzadkiej populacji obecnej we krwi pępowinowej, w tym hematopoetycznych komórek macierzystych i niedojrzałych komórek T. Ostatnio zidentyfikowano niedojrzałe limfocyty B we krwi obwodowej osób z zaawansowanym wirusem HIV15. Dlatego użyteczność tej metody wykracza poza badanie nowotworów krwi. Wreszcie, nie przeprowadziliśmy jeszcze izolacji RNA na komórkach posortowanych przepływowo; jednak metoda ta powinna być możliwa do dostosowania z zastrzeżeniem, że podczas sortowania komórek komórki powinny być sortowane bezpośrednio do trizolu lub równoważnego rozwiązania kompatybilnego z RNA, takiego jak RLT z zestawu RNeasy dostępnego za pośrednictwem Qiagen.

Aby zidentyfikować aberracje, które są obecne w chorobie, niezwykle ważne jest, abyśmy używali zdrowych tkanek lub komórek, które odpowiadają tkance lub typowi komórki dotkniętej chorobą. Jednym z powodów takiego stanu rzeczy jest to, że zmienność epigenetyczna między typami tkanek jest odpowiedzialna za regulację ekspresji genów i ma kluczowe znaczenie dla różnicowania komórek podczas normalnego rozwoju człowieka1,2. Drugim powodem jest to, że nieprawidłowa regulacja genów specyficznych dla tkanek może mieć tragiczne konsekwencje dla prawidłowego rozwoju i wiadomo, że przyczynia się do wielu stanów chorobowych, w tym raka. Dlatego lepsze zrozumienie choroby, która obejmuje komórki krwiotwórcze, wymaga wiedzy na temat zdrowych komórek krwiotwórczych.
Rozwój komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym przebiega poprzez systematyczny porządek zdarzeń charakteryzujących się zmianami w ekspresji markerów powierzchni komórki3. Badania z udziałem dorosłych uczestników wykazały, że szpik kostny zwykle zawiera małą liczbę prekursorowych limfocytów B4,5; mając na uwadze, że badania z udziałem uczestników pediatrycznych wykazały, że odsetek prekursorowych limfocytów B jest stosunkowo wysoki u osób w wieku poniżej 5 lat6. Krew pępowinowa jest wykorzystywana jako źródło hematopoetycznych komórek macierzystych w leczeniu chorób i nowotworów złośliwych związanych z krwią, jest łatwo dostępna za pośrednictwem banków krwi pępowinowej i jest wzbogacana o niedojrzałe limfocyty B i T7, które są komórkami docelowymi wielu zaburzeń, w tym białaczki i chłoniaków.
Prekursorowe komórki B w szpiku kostnym zostały dokładnie fenotypowane8,9 i mogą być zdefiniowane przez obecność specyficznych markerów powierzchni komórek, które mogą być użyte do sortowania tych komórek na odrębne podzbiory. Normalne różnicowanie komórek B przebiega przez szereg etapów w szpiku kostnym, zaczynając od najwcześniejszych komórek pro-B, a kończąc na niedojrzałych lub naiwnych komórkach B. Według van Zelma i współpracowników10, komórki pro-B charakteryzują się obecnością CD34, a podczas przejścia do etapu 2 (Pre-BI) dochodzi do nabycia CD19. Komórki etapu 3 (Pre-BII) nie wykazują już ekspresji CD34 i zaczynają wyrażać cytoplazmatyczne IgM. Wreszcie, cechą charakterystyczną etapu 4 (niedojrzałe komórki B) jest ekspresja powierzchniowej IgM. Strategia sortowania opisana w tym protokole została po raz pierwszy opisana przez Caldwella i współpracowników6 i obejmuje użycie tylko 3 markerów powierzchni komórek, co znacznie zmniejsza złożoność i koszt przeprowadzania eksperymentów sortowania komórek. W swojej pracy ustalono związek między CD45 a etapami różnicowania limfocytów B. Zaobserwowali, że limfocyty B w szpiku kostnym wykazują zmienne poziomy ekspresji CD45. W szczególności komórki, które wyrażały wysoki poziom CD45, odpowiadały komórkom, które wyrażały powierzchniowe IgM (niedojrzałe komórki B), te, które wyrażały pośredni poziom CD45, odpowiadały komórkom, które wyrażały cytoplazmatyczne IgM (komórki pre-BII), a te, które wyrażały niski poziom CD45, odpowiadały komórkom, które nie wyrażały cytoplazmatycznego IgM (komórki pre-BI). Protokół ten wykorzystuje strategię opracowaną przez Caldwella i współpracowników6 w celu wyizolowania podzbiorów prekursorowych limfocytów B z krwi pępowinowej (ryc. 1), które można wykorzystać w dalszych testach wymagających wysokiej jakości kwasów nukleinowych, takich jak test odzyskiwania wyspy metylowanej CpG (MIRA)11 i ilościowe testy PCR w czasie rzeczywistym. Metoda wykorzystuje wstępną separację za pomocą kulek magnetycznych w celu wyczerpania wszystkich komórek innych niż B z krwi pępowinowej i wymaga barwienia tylko 3 przeciwciałami (CD34, CD19 i CD45). Odzyskane komórki reprezentują 4 etapy różnicowania limfocytów B: 1) CD34+; CD19+ (późny pro-B i wczesny pre-BI); 2) CD34-; CD19+; CD45niski (późny pre-BI); 3) CD34-; CD19+; CD45med (przed BII); oraz 4) CD34-; CD19+; Wysoki poziom CD45 (niedojrzałe komórki B).

<table><tbody><tr><td>DPBS (1X)</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna LS</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multi Stand</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separator MidiMACS</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek B (B CLL)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-660</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu ATLANTA Biologicals</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówki (1,5 ml)</td><td>MIDSCI</td><td>SS1500</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen 7-AAD (7-aminoaktynomycyna D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>DB Pharmingen APC Mysz anty-ludzka CD19</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>555415</tr><tr><td>DB Pharmingen PE Mysz Anti-Human CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>560941</td><td></td></tr><tr><td>CD45 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347463</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Roztwór do płukania</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Roztwór podstawowy</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 5 ml polistyrenowa tuba okrągłodenna</td><td>BD Biosciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50 ml Tubka</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>PuraFlow Płyn osłonowy, 8X</td><td>Beckman Coulter</td><td>CY30230</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck Stopki wyrównujące</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Rainbow Stopki wyrównujące</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>ViroSafe Aerozolowy filtr ewakuacyjny</td><td>Beckman Redlica</td><td>ML01330</td><td></td></tr><tr><td>ABC Zestaw koralików do myszy</td><td>Invitrogen</td><td>A-10344</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Sitko do komórek</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Hemocytometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Model 3R Wirówka stołowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-516</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy MoFlo XDP</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka ewakuacji aerozoli</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja podzbiorów prekursorowych komórek b z krwi pępowinowej

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Krew pępowinowa jest bardzo wzbogacona dla krwiotwórczych komórek progenitorowych na różnych etapach zaangażowania w linię. Opracowaliśmy protokół izolacji prekursorowych limfocytów B na czterech różnych etapach różnicowania. Ponieważ geny ulegają ekspresji, a modyfikacje epigenetyczne zachodzą w sposób specyficzny dla tkanki, konieczne jest rozróżnienie między tkankami i typami komórek, aby móc zidentyfikować zmiany w genomie i epigenomie, które mogą prowadzić do rozwoju choroby. Metodę tę można dostosować do każdego typu komórek obecnych we krwi pępowinowej na każdym etapie różnicowania.	
Ta metoda składa się z 4 głównych kroków. Najpierw komórki jednojądrzaste są rozdzielane przez wirowanie gęstości. Po drugie, limfocyty B są wzbogacane za pomocą przeciwciał sprzężonych z biotyną, które rozpoznają i usuwają komórki inne niż B z komórek jednojądrzastych. Po trzecie, limfocyty B są znakowane fluorescencyjnie przeciwciałami białkowymi na powierzchni komórki specyficznymi dla poszczególnych etapów rozwoju komórek B. Na koniec znakowane fluorescencyjnie komórki są sortowane i odzyskiwane są poszczególne populacje. Odzyskane komórki mają wystarczającą ilość i jakość, aby można je było wykorzystać w dalszych testach kwasów nukleinowych.

Zmienność międzypróbkowa odgrywa istotną rolę w sukcesie sortowania komórek (Tabela 1). Próbki o wysokim stopniu powodzenia charakteryzują się niskim poziomem zanieczyszczeń w postaci debris (Rysunek 3A), natomiast próbki o niskim stopniu powodzenia wykazują wysoki poziom zanieczyszczeń w postaci debris (Rysunek 3B). Zmienność międzypróbkową można w pewnym stopniu kontrolować, jeśli próbka krwi pępowinowej została pobrana w ciągu 24 h przed wysyłką (pierwszy priorytet O/N).
Komórki posortowane za pomocą cytometrii przepływowej z każdej subpopulacji prekursorowych limfocytów B są obecne w ilości i jakości wystarczającej do przeprowadzenia izolacji kwasów nukleinowych. Izolowane DNA jest wysokiej jakości i może być wykorzystane w dalszych analizach. Rutynowo wykorzystujemy to DNA w metodzie MIRA11 w celu wzbogacenia w zmetylowane DNA (Rysunek 4).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Dane ośrodka przechowywania krwi pępowinowej</td>
 <td>Niewłaściwa segregacja</td>
 <td>Właściwa segregacja</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robocza objętość krwi z antykoagulantem (ml)</td>
 <td>110</td>
 <td>104</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leukocyty [103/ μl]</td>
 <td>8.68</td>
 <td>11.19</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Limfocyty [103/ μl]</td>
 <td>3.88</td>
 <td>3.76</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Limfocyty (%)</td>
 <td>44.70</td>
 <td>33.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Erytrocyty [106/ μl]</td>
 <td>3.65</td>
 <td>3.05</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">Dane wewnętrzne</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liczba komórek po zastosowaniu Ficoll-Paque</td>
 <td>206 M</td>
 <td>309 M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liczba komórek po separacji MACS</td>
 <td>22 M</td>
 <td>16,5 M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Całkowita liczba zdarzeń (MoFlo XDP)</td>
 <td>30,57 M</td>
 <td>19,97 M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Żywotność (%)</td>
 <td>98.00</td>
 <td>98.00</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Odsetek komórek w bramce limfocytów (%)</td>
 <td>17.00</td>
 <td>50.00</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">CD19+/CD34+</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Całkowita liczba komórek</td>
 <td>10959</td>
 <td>48316</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>% całkowitej liczby zdarzeń</td>
 <td>0.04</td>
 <td>0.24</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wydajność</td>
 <td>88%</td>
 <td>88%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">CD19+/CD34-/CD45niski</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Całkowita liczba komórek</td>
 <td>16619</td>
 <td>26941</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>% całkowitej liczby zdarzeń</td>
 <td>0.05</td>
 <td>0.13</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wydajność</td>
 <td>89%</td>
 <td>87%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">CD19+/CD34-/CD45med</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Całkowita liczba komórek</td>
 <td>469745</td>
 <td>507540</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>% całkowitej liczby zdarzeń</td>
 <td>1.54</td>
 <td>2.54</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wydajność</td>
 <td>89%</td>
 <td>89%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td colspan="3">CD19+/CD34-/CD45wysoki</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Całkowita liczba komórek</td>
 <td>1896062</td>
 <td>2047142</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>% całkowitej liczby zdarzeń</td>
 <td>6.2</td>
 <td>10.25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wydajność</td>
 <td>91%</td>
 <td>90%</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Reprezentatywne statystyki sortowania komórek. Wiersze 1-5 zawierają liczby dostarczone przez ośrodek krwi pępowinowej. Pozostałe wiersze stanowią dane zebrane w naszym laboratorium. Słabe sortowanie charakteryzowało się wysokim poziomem zanieczyszczeń oraz niskim odsetkiem komórek w bramce limfocytów.
<img alt="Proces izolacji subpopulacji limfocytów B; cytometria przepływowa, przeciwciała; schemat przebiegu eksperymentu." src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Schemat procedury. Krew z krwi pępowinowej jest przetwarzana, a komórki monocytyczne są izolowane przy użyciu Ficoll-paque plus. Wprowadzono dodatkowy etap płukania w celu usunięcia zanieczyszczających płytek krwi. Limfocyty B są izolowane z komórek monocytycznych przy użyciu zestawu do izolacji ludzkich limfocytów B MACS (B-CLL). Na tym etapie wykorzystuje się biotynylowane przeciwciała monoklonalne (CD2, CD4, CD11b, CD36, Anti-IgE oraz CD235a) w celu usunięcia wszystkich komórek innych niż limfocyty B. Odzyskane limfocyty B są znakowane przeciwciałami CD19-APC, CD34-PE i CD45-FITC, a następnie sortowane za pomocą cytometru przepływowego MoFlo XDP w celu wyodrębnienia subpopulacji prekursorowych limfocytów B: CD19+/CD34+; CD19+/CD34-/CD45low; CD19+/CD34-/CD45med; oraz CD19+/CD34-/CD45high.
<img alt="Schemat analizy cytometrii przepływowej przedstawiający populacje komórek, wykresy rozrzutu FSC, CD34, CD19, CD45." src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Strategia bramkowania w celu identyfikacji i sortowania populacji. Czerwone strzałki wskazują bramkę zastosowaną do kolejnego wykresu. Bramki R4, R5, R6 i R7 wskazują posortowane populacje. a) Wykres rozpraszania światła w przód (FSC) względem rozpraszania bocznego (SSC) przedstawiający wzbogaconą populację limfocytów. R1, bramka limfocytów. b) Wykres wysokości względem szerokości rozpraszania w przód w celu identyfikacji pojedynczych komórek w odróżnieniu od dubletów. R2, bramka pojedynczych komórek. c) Komórki CD19-APC dodatnie dzielą się na populacje CD34-PE ujemne i dodatnie. R3, bramka CD19+/CD34-; R4, bramka CD19+/CD34+ wskazująca pożądaną populację do sortowania. d) Komórki CD19+/CD34- dzielą się na trzy dość wyraźne populacje CD45-FITC. R5 i R6 to odpowiednio populacje CD19+/CD34-/CD45low oraz CD19+/CD34-/CD45med. R7, ze względu na dużą liczbę komórek w populacji CD19+/CD34-/CD45high, ta bramka sortująca obejmuje tylko część populacji. Nie wszystkie komórki tej populacji muszą być zbierane do dalszych analiz.
<img alt="Wykres kropkowy cytometrii przepływowej; diagram FSC vs SSC przedstawiający bramkowanie populacji komórek do analizy." src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. a) Niski poziom zanieczyszczeń szczątkami po wzbogacaniu kolumnowym. R1, bramka limfocytów. b) Wysoki poziom zanieczyszczeń szczątkami po wzbogacaniu kolumnowym.
<img alt="Wyniki elektroforezy żelowej; rozdział DNA; analiza przejrzystości prążków; prążki genów SLC25A37, APC1." src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Wzbogacenie zmetylowanego DNA z subpopulacji prekursorowych limfocytów B. a) Sonikowane DNA wyizolowane z subpopulacji prekursorowych limfocytów B jest wysokiej jakości. Do konstrukcji bibliotek DNA sonikowano do średniej wielkości 200-600 bp. Ścieżka 1: drabinka Promega 100 bp (nr katalogowy #G2101); ścieżka 2: całkowite DNA wyizolowane z komórek CD19+/CD34+; ścieżka 3: całkowite DNA wyizolowane z komórek CD19+/CD34-/CD45low; ścieżka 4: 100 ng DNA wyizolowanego z komórek CD19+/CD34-/CD45med; ścieżka 5: 100 ng DNA wyizolowanego z komórek CD19+/CD34-/CD45high. DNA sonikowano za pomocą urządzenia Diagenode Bioruptor w trybie High przez łącznie 9 min (30 s włączone; 30 s wyłączone). DNA oczyszczono kolumnowo i uwizualizowano na 1% żelu agarozowym przy użyciu barwnika do kwasów nukleinowych SYBR green. b) Po przeprowadzeniu MIRA z użyciem zestawu ActivMotif MethylCollector Ultra wykonano reakcję PCR dla SLC25A37 (1-6) oraz APC1 (7-12), aby potwierdzić wzbogacenie zmetylowanego DNA. 1&amp;7: sonikowane DNA genomiczne (bez MIRA); 2&amp;8: DNA MIRA-CD19+/CD34+; 3&amp;9: DNA MIRA-CD19+/CD34-/CD45low; 4&amp;10: DNA MIRA-CD19+/CD34-/CD45med; 5&amp;11: DNA MIRA-CD19+/CD34-/CD45high; 6&amp;12: kontrola z wodą. Silniejsza amplifikacja SLC25A37 potwierdza wzbogacenie zmetylowanego DNA w subpopulacjach prekursorowych limfocytów B.

Tutaj opisujemy protokół izolacji podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej. Wystarczająca ilość i jakość kwasów nukleinowych może zostać wyekstrahowana z komórek i wykorzystana w kolejnych testach z wykorzystaniem DNA lub RNA.

Izolacja podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie subpopulacji prekursorowych limfocytów B z krwi pępowinowej. Osiąga się to najpierw poprzez izolację komórek mononuklearnych z krwi pępowinowej za pomocą wirowania w gradiencie gęstości. W drugim kroku antygeny powierzchniowe komórek są znakowane przeciwciałami sprzężonymi z biotyną, aby magnetycznie usunąć wszystkie pozostałe komórki inne niż limfocyty B.Następnie wyizolowane limfocyty B są znakowane fluorescencyjnie przeciwciałami przeciwko antygenom powierzchniowym CD 19, CD 34 i CD 45. W ostatnim kroku komórki są sortowane metodą cytometrii przepływowej w celu odzyskania subpopulacji prekursorowych limfocytów B. W rezultacie można pozyskać komórki w liczbie i jakości wystarczającej do zastosowania w dalszych analizach wymagających wysokiej jakości DNA i RNA.Jedną z zalet strategii sortowania komórek w porównaniu z alternatywnymi metodami jest fakt, że nasza strategia wymaga krótszego czasu pracy na cytometrze przepływowym i wykorzystuje tylko trzy przeciwciała fluorescencyjne, co znacznie obniża koszt eksperymentu. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą mieć trudności z mnogością dostępnych sposobów przygotowania komórek krwi pępowinowej do cytometrii przepływowej oraz ze złożonością konfiguracji cytometru przepływowego. Choć metoda ta pozwala na analizę zdrowych prekursorowych limfocytów B, może być ona również zastosowana do innych typów komórek obecnych we krwi pępowinowej, takich jak limfocyty T, lub w badaniach nad chorobami obejmującymi dowolne komórki krwiotwórcze, na przykład białaczką lub chłoniakami.Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ trudno jest opisać właściwe techniki niezbędne do przetwarzania krwi pępowinowej i komórek w sposób, który maksymalizuje żywotność komórek i ogranicza obecność zanieczyszczeń w postaci debris. Aby wyizolować komórki mononuklearne z krwi pępowinowej, należy najpierw rozcieńczyć 8 ml alikwoty krwi pępowinowej w 24 ml DPBS. Następnie każdą rozcieńczoną mieszaninę krwi należy powoli nanieść na 15 ml alikwoty Ficoll-Paque Plus w 50 ml probówkach stożkowych, dbając o to, aby warstwy pozostały rozdzielone.Następnie odwiruj krew przez 40 minut przy 400 ×g i 20 °C, aby oddzielić komórki za pomocą gradientu gęstości. Oznacz siedem probówek o okrągłym dnie o pojemności 50 ml, wpisując identyfikator próbki, datę oraz wszelkie inne odpowiednie informacje, zgodnie z zestawieniem w tabeli. Po separacji monocyty i limfocyty pozostaną na granicy fazy osocza i warstwy nieprzezroczystej, natomiast granulocyty i erytrocyty opadną na dno. Teraz odessaj górne warstwy osocza, unikając kontaktu z warstwą komórek mononuklearnych. Następnie za pomocą szklanej pipety 10 ml ostrożnie zbierz warstwy komórek mononuklearnych z trzech probótek 50 ml do jednej nowej probówki 50 ml.Napełnij tę nową probówkę PBS, delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową, a następnie dwukrotnie przemyj komórki przez 10 minut przy 300 ×g i 20 °C. Po pierwszym przemyciu resuspenduj osady i przenieś je do jednej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Po drugim przemyciu delikatnie resuspenduj osad komórkowy w 200 µL PBS, a następnie przenieś 1 µL zawiesiny komórkowej do 1 ml PBS w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml w celu wykonania odczytu.Następnie przemyć komórki w probówce 50 ml kolejną porcją PBS, po czym całkowicie usunąć nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu. Aby wyizolować limfocyty B z komórek mononuklearnych, w pierwszej kolejności resuspendować świeżo przemyty osad w 160 µL świeżo przygotowanego buforu DGAs EDTA-PBS w temperaturze 4 °C.Następnie wymieszaj 40 µL koktajlu przeciwciał bio ITIN z zestawu do izolacji limfocytów B z zawiesiną komórek. Po inkubacji komórek przez 10 minut w temperaturze 4 °C, wypłucz wolne przeciwciała, stosując 1 mL buforu EDTA-PBS o temperaturze 4 °C na 10 milionów komórek. Następnie resuspenduj osad komórkowy w 320 µL buforu EDTA-PBS o temperaturze 4 °C.Następnie, po 15 minutowej inkubacji w temperaturze 4 °C, wymieszaj 80 µl mikrokulek antybiotynowych z zawiesiną komórkową. Ponownie przemyj komórki podczas wirowania. Umieść kolumnę LS w polu magnetycznym separatora Max i przepuść przez kolumnę 3 mL buforu EDTA-PBS w temperaturze 4 °C.Następnie resuspenduj do 100 milionów wypłukanych komórek w 500 µL buforu E-D-T-A-P-B-S w temperaturze 4 °C. Potem nanieś zawiesinę komórkową na kolumnę, zbierając nieoznakowane komórki przepływające przez kolumnę do probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Do ścianek pierwotnej probówki stożkowej dodaj kolejne 2 mL buforu E-D-T-A-P-B-S w temperaturze 4 °C, dodając po 1 mL za każdym razem, a następnie delikatnie wymieszaj i nanieś pozostałą zawiesinę komórkową na kolumnę, aby upewnić się, że odzyskano wszystkie komórki.Na koniec do probówki stożkowej zawierającej nieoznaczone komórki należy dolać PBS. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć nadsącz, tak aby nie naruszyć granulatu komórkowego. Następnie delikatnie resuspender komórki w 200 µL buforu E-D-T-A-P-B-S.Rozpocznij znakowanie przeciwciałami. W pierwszym kroku przenieś 1 µL zawiesiny komórkowej do wcześniej oznakowanej, niezbarwionej probówki. Dodaj do probówki 500 µL buforu EDTA-PBS i przechowuj ją na lodzie.Wyłączyć wszystkie światła, a następnie dodać po 20 µL przeciwciał CD 19, CD 34 i CD 45 na 1 milion komórek do pozostałej zawiesiny komórkowej. Dobrze wymieszać i pozostawić probówkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieść 40 µL zawiesiny komórkowej z oznakowanymi przeciwciałami do probówki oznaczonej jako 7A-D.Przemyj komórki w 1 ml PBS, a następnie zawieś osad w 100 µl buforu wiążącego. Dodaj do tych komórek 7 µl 7-AAD, a następnie inkubuj je w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu znakowania komórek 7-AAD. Uzupełnij probówkę z komórkami znakowanymi przeciwciałami za pomocą PBS, przemyj te komórki, a następnie zawieś osad w 500 µl buforu EDTA-PBS. Teraz przenieś całą objętość zawiesiny komórek znakowanych przeciwciałami do probówki oznaczonej jako CD19-dodatnia, CD34-dodatnia, CD45-dodatnia.Opłucz probówkę dodatkowym jednym mililitrem buforu E-D-T-A-P-B-S i przenieś pozostałą zawiesinę komórkową do probówki oznakowanej jako CD 19 pozytywna, CD 34 pozytywna, CD 45 pozytywna. Na koniec dodaj 300 µL buforu wiążącego do probówki siedem A a D, aby posortować komórki przy użyciu cytometrycznego analizatora przepływowego MO flow XDP. Najpierw skonfiguruj urządzenie MO flow do sortowania, uruchom odpowiednie kontrole kompensacji, a następnie stwórz protokół obejmujący wykresy przedstawione na tej rycinie.Należy upewnić się, że system odprowadzania aerozoli pracuje przez cały czas, a następnie wykorzystać niebarwioną próbkę do ustawienia napięcia i wzmocnienia dla wykresów rozprosiania przedniego i bocznego. Służy to do zidentyfikowania populacji o negatywnej fluorescencji. Ustaw próg na wartość mniejszą niż lub równą 1%, aby uniknąć zanieczyszczenia odzyskanych próbek przez resztki zawierające DNA.Zanalizuj około 50 000 zdarzeń z próbki CD 19+, CD 34+ i CD 45+. Aby ustawić strategię bramkowania w sposób zaprezentowany powyżej, wykonaj wsteczne bramkowanie (back gating) niebramkowanej populacji CD 19+ CD 34+ na wykresie rozprosiania bocznego (side scatter) względem rozprosiania przedniego (forward scatter). Ma to na celu upewnienie się, że brama limfocytów obejmuje potencjalne pro-limfocy B.Użyj tej próbki również do wyznaczenia populacji o negatywnej fluorescencji dla barwienia 7-AAD. Następnie przeanalizuj próbkę z 7-AAD, aby określić żywotność komórek; sortuj komórki tylko z próbki o żywotności większej niż lub równej 95% na początku procesu, ponieważ martwe komórki barwią się niespecyficznie i mogą zanieczyścić sortowane populacje. Teraz skonfiguruj parametry sortowania, aby zebrać cztery populacje: CD19 dodatnią, CD34 dodatnią; CD19 dodatnią, CD34 ujemną, CD45 niską; CD19 dodatnią, CD34 ujemną, CD45 średnią oraz CD19 dodatnią, CD34 ujemną, CD45 wysoką.W decyzjach sortowania dla wszystkich populacji należy uwzględnić bramki dyskryminujące limfocyty i dublety, aby zapobiec zatorom. W końcówce sortującej próbkę CD 19 dodatnią, CD 34 dodatnią i CD 45 dodatnią należy przefiltrować przez sitko komórkowe o oczkach 40 µm bezpośrednio przed sortowaniem. Następnie należy umieścić opisane probówki zbiorcze powlekane 2% FBS w PBS w uchwycie do probówek z lodem i przelać posortowane komórki do odpowiedniej probówki zbiorczej niezwłocznie po zakończeniu sortowania.Wyodrębnij DNA; zmienność między próbkami odgrywa rolę w sukcesie komórki, sortując w odpowiedni sposób. W bramce limfocytów znajduje się wysoki odsetek komórek. Próbki o dobrych wskaźnikach sukcesu zawierają niskie poziomy zanieczyszczających debris, co potwierdza niska liczba zdarzeń znajdujących się poniżej i na lewo od bramkowanej populacji limfocytów.Próbki o niskim wskaźniku sukcesu zawierają wysokie poziomy zanieczyszczeń w postaci debris. W przypadku słabych próbek obserwuje się wyraźny wzrost liczby tych zdarzeń. Komórki wyizolowane metodą sortowania przepływowego oraz wyodrębnione z nich następnie DNA z każdego podzbioru prekursorowych limfocytów B charakteryzują się ilością i jakością umożliwiającymi przeprowadzenie dalszych analiz.Rutynowo wykorzystywaliśmy to DNA w Myra do wzbogacania w celu wyodrębnienia zmetylowanego DNA; tutaj DNA wyizolowane z komórek CD 19 dodatnich CD 34 dodatnich, CD 19 dodatnich CD 34 ujemnych CD 45 niskich, CD 19 dodatnich CD 34 ujemnych CD 45 średnich oraz CD 19 dodatnich CD 34 ujemnych CD 45 wysokich poddano sonikacji w wysokim ustawieniu przez łącznie dziewięć minut, oczyszczono kolumnowo, a następnie zwizualizowano na żelu agarozowym 1% z zastosowaniem barwnika do kwasów nukleinowych Cyber Green. W tej ścieżce przeprowadzono również kontrolną drabinę 100 par zasad. Po zastosowaniu Myra, przy użyciu zestawu Active Motif MethylLight PCR, przeprowadzono reakcję z kontrolnymi genami zmetylowanym SLC 25 A 37 oraz niezmetylowanym APC 1 w celu potwierdzenia wzbogacenia zmetylowanego DNA.Wyższa amplifikacja SLC 25. A 37 potwierdza wzbogacenie zmetylowanego DNA w podzbiorach prekursorowych limfocytów B. Po opanowaniu techniki, jej przeprowadzenie zajmuje 10 godzin, pod warunkiem właściwego wykonania. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o bardzo delikatnym traktowaniu komórek oraz stosowaniu zoptymalizowanej ilości przeciwciał, aby zminimalizować powstawanie zanieczyszczających odłamków w wyniku wykonania tej procedury.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak określenie, które geny są zmetylowane oraz identyfikacja podzbiorów prekursorowych limfocytów B, można zastosować inne metody, np. sekwencjonowanie nowej generacji. Należy pamiętać, że praca z żywymi ludzkimi komórkami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy przez cały czas przestrzegać środków ostrożności, takich jak korzystanie z systemu odsysania aerozoli.

isolation-of-precursor-b-cell-subsets-from-umbilical-cord-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja podzbioru komórek prekursorowych limfoidnych typu B z krwi pępowinowej

W niniejszej pracy opisujemy pierwszą zgodną z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) metodę produkcji wirusowo-specyficznych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) z krwi pępowinowej, która jest źródłem głównie naiwnych limfocytów T.

Ekspansja cytotoksycznych limfocytów T z krwi pępowinowej nakierowanych na cytomegalowirus, wirusa Epstein-Barr i adenowirusa

Film wyjaśnia sposób oczyszczania limfocytów B poprzez celowanie immunomagnetyczne i separację od zawiesiny komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Metoda ta polega na znakowaniu niepożądanych typów komórek specyficznymi przeciwciałami lub ligandami (połączonymi z cząstkami magnetycznymi) skierowanymi przeciwko określonym białkom powierzchniowym komórki, które mają zostać usunięte z heterogenicznej zawiesiny komórkowej przez separację magnetyczną.

Negatywna selekcja immunomagnetyczna: metoda oczyszczania limfocytów B z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

W tym filmie pokazujemy izolację limfocytów B z ludzkiej krwi obwodowej za pomocą biotynylowanych przeciwciał specyficznych dla komórek innych niż B oraz mikrokulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną.

Izolacja i oczyszczanie limfocytów B z ludzkiej krwi obwodowej

Ten film demonstruje technikę generowania myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS). Krwiotwórcze komórki macierzyste CD34 + (HSC) są izolowane z ludzkich komórek kożucha krwi pępowinowej za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami. HSC CD34+ są namnażane w pożywce wzrostowej wzbogaconej o cytokiny i kriokonserwowane. Na koniec rozmrożone HSC wstrzykuje się do mysiego szczeniaka z niedoborem odporności w celu ustalenia mysiego modelu HIS.

Izolowanie hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej w celu wytworzenia myszy z ludzkim układem odpornościowym

Tutaj zapewniamy zoptymalizowany protokół izolacji i klonowania rzadkiej jednostki limfocytów T obwodowych komórek T Vδ1+CD4+, która jest, jak wykazaliśmy ostatnio, pozatymicznym progenitorem limfocytów T αβ. Technika ta pozwala na ilościowe wyizolowanie, sklonowanie i efektywną ekspansję tych komórek w hodowli ex vivo.

Izolacja i hodowla ex vivo limfocytów T Vδ1+CD4+γδ, pozatymicznego progenitora komórek αβT

Ludzka krew obwodowa jest powszechnie używana do oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano metody izolowania ludzkich limfocytów B z krwi obwodowej, różnicowania ludzkich komórek B w limfocyty B wydzielające przeciwciała (Ab) (ASC) w hodowli oraz liczenia całkowitych IgM- i IgG-ASC za pomocą testu ELISpot.

Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich limfocytów B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Wysoce czystą populację megakariocytów można uzyskać z komórek CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej. Opisano tutaj metodę izolacji komórek CD34+ i różnicowania megakariocytów.

Różnicowanie megakariocytów i tworzenie płytek krwi z ludzkich komórek CD34 + pochodzących z krwi pępowinowej

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki immunofenotypowej i indukowanego cytokinami różnicowania hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej do czterech linii szpikowych. Zastosowania tego protokołu obejmują badania nad wpływem mutacji choroby szpikowej lub małych cząsteczek na różnicowanie szpiku komórek CD34+.

Różnicowanie szpikowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych CD34+ pochodzących z krwi pępowinowej

Przedstawiamy prosty protokół izolacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej z krwi pełnej uzyskanej od pacjentów, u których zdiagnozowano zespół Sézary'ego, a następnie selekcję limfocytów T CD4+, ich stymulację octanem forbolu12-mirystynian13 i jonoforem A23187 oraz przygotowanie RNA do profilowania transkryptomicznego.

Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i limfocytów T CD4+ od pacjentów z zespołem Sézary'ego w celu profilowania transkryptomicznego

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę kompatybilną z automatyzacją o wysokiej przepustowości, polegającą na izolowaniu ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej do biobankowania i innych celów.

Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od kożuchów za pomocą wysokoprzepustowej separacji kulek immunomagnetycznych

Naucz się izolować podzbiory prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej przy użyciu cytometrii przepływowej i gradientu gęstości. Ta metoda zapewnia wysokiej jakości kwas nukleinowy do dalszych badań immunologicznych.

Izolacja podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej

Przeglądaj więcej filmów