Obrazowanie na żywych komórkach wczesnych zdarzeń autofagii: omegasomy i nie tylko

Ogólnym celem tej procedury jest uchwycenie tworzenia lc trzech dodatnich autofagosomów w połączeniu z mikrosomami i lizosomami. Osiąga się to za pomocą limfocytów T HEC 2, 9, 3, które stabilnie eksprymowały GFPD, FCP, jeden marker A dla stref omega i transektując je za pomocą Ccfp lc trzy jeden i oznaczając lizosomy czerwonym trackerem lyo. Drugim krokiem jest przygotowanie komory inkubacyjnej.

Następnie komorę inkubacyjną umieszcza się na stoliku mikroskopu, a bogate podłoże zastępuje się podłożem głodowym w celu wywołania odpowiedzi autofagii. Ostatnim krokiem jest wybór odpowiednich komórek i ustawienie parametrów wideomikroskopii. Ostatecznie obrazowanie żywych komórek służy do pokazania, że trzy dodatnie fagosomy lc pochodzą z jednej dodatniej strefy omega DFCP i ostatecznie łączą się z lizosomami.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie komórek stałych, jest to, że możemy dokładnie monitorować postęp zdarzeń w tych samych komórkach w czasie. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w niepowodzeniu PHA, takie jak przyczyna zdarzeń prowadzących do powstania ogniska. W badaniu tym wykorzystano linię komórek T HEC 2 9 3, która stabilnie eksprymuje GFPD FCP jeden marker A dla stref omega, które są strukturami prekursorowymi prowadzącymi do powstania autofagosomów na 48 godzin przed obrazowaniem żywych komórek.

Zobacz niską liczbę przejść komórek na 22-milimetrowych okrągłych szkiełkach nakrywkowych w hodowli DMEM przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla do płynności od 30 do 40% następnego dnia. Przygotował mieszaninę kompleksu transfekcji dla każdej płytki zawierającą optymalny, zredukowany surowica średnio ekstremalna G dziewięć DNA, odczynnik do transfekcji i P-E-C-F-P lc trzy osocze DNA lc. Trzy to białko będące przedmiotem zainteresowania, którego udział w tworzeniu autofagosomów zostanie przeanalizowany w tym eksperymencie, delikatnie zmieszany przez pipetowanie w górę iw dół, a następnie inkubowany przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie odessać pożywkę z płytek komórek i dodać świeży DMEM podgrzany do 37 stopni Celsjusza. Dodaj kompleks transfekcji do komórek i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. 24 godziny później komórki powinny być w 80% zlewające się i gotowe do obrazowania żywych komórek w przypadku użycia markera organelli.

W eksperymencie usuń dwumililitrową porcję wcześniej przygotowanego mito trackera lub lyo trackera zawierającego pożywkę i podgrzej ją do 37 stopni Celsjusza. W tym eksperymencie czerwony tracker Lyo zostanie użyty do oznaczenia pożywki aspiracyjnej lizosomów z transfekowanych komórek. Zastąp na lyo tracker zawierający pożywkę i inkubuj komórki przez 30 do 60 minut.

Aby rozpocząć tę procedurę, oczyść metalowe i plastikowe O-ringi 75% etanolem i nałóż smar silikonowy na obręcz metalowego O-ringu. Za pomocą kleszczyków usuń szkiełko nakrywkowe z płytki i osusz nadmiar podłoża od spodu szkiełka nakrywkowego. Ma to na celu uniknięcie mieszania zbyt dużej ilości medium ze smarem, co zwiększy prawdopodobieństwo wycieku.

Pozostaw szkiełko nakrywkowe na półce plastikowego o-ringu i zamontuj metalowy o-ring na plastikowym o-ringu z szkiełkiem nakrywkowym umieszczonym pomiędzy nimi. W celu stworzenia zamkniętej komory należy uzupełnić komorę pożywką z płytki Od tego momentu należy unikać długotrwałej inkubacji komórek w pożywce DMEA bez środka buforującego, aby zapobiec zmianom pH. Następnie umieść komorę inkubacyjną na stoliku mikroskopu, aby zagłodzić komórki i wywołać odpowiedź autofagii.

Odessać całe podłoże i przemyć dwukrotnie dwoma mililitrami pożywki głodowej. Po drugim praniu dodaj dwa mililitry świeżej pożywki głodowej i ustaw timer na odpowiednim systemie obrazowania skonfigurowanym do fluorescencji epi w szerokim polu żywych komórek, która jest wymagana do tego eksperymentu. System ten zazwyczaj składa się z odwróconej ramy mikroskopu klasy badawczej, lustra źródła światła o intensywnym szerokim spektrum i filtry specyficzne dla interesujących białek fluorescencyjnych lub barwników, wysokiej jakości soczewkę obiektywową, czułą kamerę C-C-D-S-C-M-O-S i komorę inkubacyjną.

Najważniejszym czynnikiem jest zastosowanie systemu o wysokiej czułości, tak aby poziomy ekspresji reporterów fluorescencyjnych można było ograniczyć do minimum pod względem wyboru odpowiednich komórek do obrazowania dużych i płaskich komórek, co pozwoli na uchwycenie większej liczby zdarzeń powstawania autofagosomów. Ponadto wybierz komórki, które już zaczęły wytwarzać większą liczbę stref omega. Użyj soczewki o dużym powiększeniu, aby zapobiec fotowybielaniu, dostosuj intensywność światła wzbudzającego do 10 do 20% maksimum.

Ustaw aparat na ekspozycję od 100 do 500 milisekund, dwa na dwa obracanie i 100 wzmocnienia. Ustaw szybkość akwizycji obrazu na jedną klatkę co 10 sekund. Rozpocznij przechwytywanie wideo po 30 minutach lub w trakcie odpowiedzi autofagii, aby uchwycić większy stosunek zdarzeń tworzenia autofagosomów na film.

W tym badaniu komórki wykazujące ekspresję G-F-P-D-F-C-P jeden i CCF PLC trzy były głodzone przez 30 minut, a następnie obrazowane z częstotliwością jednej klatki co 10 sekund. Ten film pokazuje zdarzenie tworzenia autofagosomu. Szybkość odtwarzania wynosi cztery klatki na sekundę.

Montaż reprezentatywnego zdarzenia tworzenia autofagosomów uchwyconego na filmie jest pokazany na tym rysunku: sygnały z zielonego kanału wskazujące DFCP jeden są pseudo pokolorowane na zielono, a sygnały z niebieskiego kanału wskazujące lc trzy są pseudo pokolorowane na czerwono. Powstanie strefy omega staje się widoczne od drugiej klatki w postaci małej plamki wskazanej strzałką. Strefa omega zaczyna się rozszerzać, tworząc charakterystyczną strukturę przypominającą pierścień i osiąga maksymalną średnicę po około sześciu minutach.

Następnie strefa omega zaczyna się zapadać i ostatecznie znika po około 10 minutach. Gdy tworzenie się struktury lc trzy dodatniej lub autofagosomu umieszcza się w kontekście tworzenia strefy Omega, zaobserwowano, że autofagosom pojawia się po strefie omega i staje się wyraźnie widoczny. Po około półtorej minuty autofagosom zaczyna się rozszerzać w ścisłym związku z plamką strefy Omega, a następnie dzwoni, gdy strefa omega zaczyna się zapadać, autofagosom zawiązuje się.

W końcu autofagosom pozostaje, najwyraźniej po to, aby połączyć się z lizosomami po zniknięciu strefy omega. W następnym filmie dodano tracker lizosomów oznaczony na niebiesko w celu uchwycenia czasowego i przestrzennego związku tworzącego się autofagosomu. W przypadku lizosomów szybkość odtwarzania wynosi cztery klatki na sekundę.

Strzałka wskazuje po pierwsze utworzenie strefy omega, a po drugie, fuzję autofagosomu z lizosomem. Ten rysunek jest montażem wydarzeń uchwyconych na filmie, jak wskazuje grot strzałki. Kilka minut po zapadnięciu się strefy omega powstający autofagosom zaczyna kojarzyć się z lizosomami i ostatecznie łączy się z jedną fuzją lizosomów autofagosomu z lizosomem, w dużej mierze wygaszając fluorescencję CFPL C3, prawdopodobnie z powodu wystawienia znacznika CFP na kwaśne środowisko lizosomu.

Jednak ten sam rodzaj analizy może czasami dawać nieinterpretowalne wyniki z różnych powodów. W tym przykładzie wyniki stają się niemożliwe do zinterpretowania z powodu dryfu ostrości. Analiza obrazów pokazuje, że tworzenie autofagosomu jest na początku z powodzeniem rejestrowane za pomocą wideo.

Jednak przesunięcie ostrości następuje po upływie trzech minut. Przechwytywanie wideo jest kontynuowane bez ostrości przez następne sześć minut, ale ostatecznie ostrość jest ręcznie korygowana po upływie dziewięciu do 10 minut. Niestety, analiza ta uniemożliwia rozróżnienie, czy zdarzenie tworzenia autofagosomu uchwycone po korekcji ostrości jest zdarzeniem początkowym, które jest prawie zakończone, czy nowym, które rozpoczęło się po dryfie ostrości.

Aby zapobiec odchyleniu ostrości, obraz wideo powinien być stale monitorowany i w razie potrzeby wprowadzany jest korekt, ręcznie lub za pomocą funkcji autofokusa mikroskopu, jeśli jest dostępna. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w nie więcej niż godzinę na film filmowy, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować mikroskop do zastosowań związanych z obrazowaniem żywych komórek, w tym śledzić tworzenie autofagosomu z mikrosomami i lizosomami.