Model niedokrwienno-reperfuzyjny ostrego uszkodzenia nerek i zwłóknienia pourazowego u myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie stałego, możliwego do przeżycia i funkcjonalnie mierzalnego stopnia niedokrwienia. Reperfuzja indukowała ostre uszkodzenie nerek u myszy poprzez jednostronne zaciśnięcie szypułki nerki, a następnie niedokrwienie nefrektomii po stronie przeciwnej. Uszkodzenie reperfuzyjne uzyskuje się poprzez wykonanie nacięcia grzbietowego i odsłonięcie lewej i prawej szypułki nerki.

Obejmuje to tętnicę nerkową i żyłę. Następnie wykonuje się nefrektomię kontralateralną po uwolnieniu nerki z otaczającej tkanki. Następnie lewa szypułka nerkowa jest zaciskana za pomocą zacisku naczyniowego, a nerka jest pokryta skórą.

Wreszcie, po określonym czasie, zacisk zostaje zwolniony, nerka może ulec reperfuzji, a nerka jest wpychana z powrotem do przestrzeni zaotrzewnowej. Ostatecznie analizę funkcjonalną uszkodzenia nerek można przeprowadzić poprzez analizę poziomu kreatyniny w surowicy za pomocą enzymatycznego testu kaskadowego 24 godziny po usunięciu przeciwległego niedokrwienia nerki. Uraz reperfuzyjny to model, który jest szeroko stosowany do badania mechanizmów i leczenia ostrego uszkodzenia nerek.

Sama technika jest stosunkowo prosta, ale istnieje wiele zmiennych, które spowodowały, że wiele laboratoriów uznało tę technikę za trudną do odtworzenia przy wysokiej śmiertelności, a także stosunkowo niskiej przepustowości, przy czym osoby są w stanie wykonać tylko od pięciu do 10 operacji dziennie. Dr Skrinick, który później zaprezentuje Państwu tę technikę, spędził wiele lat na rozwijaniu tej techniki w naszym laboratorium i opracował protokół, który okazał się znacznie bardziej powtarzalny przy niskiej śmiertelności i stosunkowo wysokiej przepustowości. W dobry dzień NA jest w stanie wykonać od 40 do 50 operacji dziennie, aby przygotować się do operacji.

Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne, jeśli będą używane dla wielu myszy, traktuj je za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami między zabiegami. Jeśli używasz systemu łaźni wodnej, ustaw temperaturę na 38 stopni Celsjusza na godzinę przed operacją, zważ mysz, a następnie podaj podskórne wstrzyknięcie 0,5 mililitra sterylnej normalnej soli fizjologicznej. Po znieczuleniu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszanki alainy, ketaminy, należy ogolić obszar chirurgiczny i nałożyć maść okulistyczną w celu ochrony rogówki myszy.

Przenieś mysz w pozycji leżącej na rozgrzaną powierzchnię wyłożoną chłonną podkładką stołową i przyklej nogi do powierzchni chirurgicznej za pomocą roztworu Betadyne. Szoruj od środka terenu w kierunku obrzeży, a następnie novacan w sumie trzy razy. Przykryj pole operacyjne sterylną obłożką chirurgiczną.

Następnie zbadaj palpacyjnie lokalizację nerki przez skórę. Następnie przetnij skórę grzbietową wzdłuż linii środkowej myszy nożyczkami i kleszczami. Oddziel warstwę skóry i podskórną po lewej i prawej stronie grzbietowej przez nacięcie.

Wykonaj małe nacięcie przez mięsień prawej strony i powięź nad prawą nerką i wyjdź na zewnątrz, ostrożnie wypreparuj górny i dolny biegun nerki wolny od otaczającej tkanki. Nadnercza są również delikatnie usuwane z górnego bieguna prawej nerki wraz z jej ukrwieniem poprzez delikatne oddzielenie tkanki kleszczami za pomocą zamaszystego ruchu od przyśrodkowego do bocznego. Jest to trochę trudne do zademonstrowania za pomocą wideo, ale można je zrozumieć.

Patrząc na anatomię nadnercza z jego dopływem krwi zilustrowanym na rysunku pierwszym, a następnie za pomocą czterech jedwabnych szwów zawiąż podwójny węzeł chirurgiczny wokół wnęki. Pozostaw jeden koniec szwu o długości około dwóch cali i użyj go do podtrzymania nerki, aby uwidocznić miejsce cięcia podczas cięcia dystalnie do węzła. Użyj sterylnej soli fizjologicznej do nawodnienia pnia.

Następnie za pomocą szwu wchłanialnego zamknij warstwę mięśniową przesuwającą się na lewą stronę. Wykonaj małe nacięcie przez lewy mięsień boczny i powięź nad lewą nerką i zewnętrznij je kleszczami. Ostrożnie przytrzymaj nerkę, jednocześnie uwalniając szypułkę nerki z otaczającej tkanki tłuszczowej za pomocą drugiego zestawu kleszczy.

Uważając, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku na nerki, co może spowodować uszkodzenie nerek. Jeśli w swoich eksperymentach włączasz pozorowane kontrole, myszy pozorowane powinny przejść dokładnie te same procedury, co myszy uszkodzone, w tym uwolnienie szypułki nerkowej z otaczającego tłuszczu, ale zacisk naczyniowy nie jest umieszczony na szypułce nerki. Następnie, stabilizując kleszcze podtrzymujące nerkę, użyj nieurazowego zacisku naczyniowego, aby zacisnąć lewą szypułkę nerkową, czas zaciskania będzie się różnić w zależności od obciążenia myszy i ciężkości urazu wymaganego przy nadal założonym zacisku.

Przykryj lewą nerkę skórą, a następnie użyj sterylnej gazy nasączonej solą fizjologiczną, aby zakryć nacięcie skóry. Następnie przykryj mysz sterylną serwetą, aby chronić pole operacyjne po pożądanym czasie, odsłoń nerkę. Sprawdź, czy ma jednolity, ciemny wygląd, a następnie zwolnij zacisk.

Nerka powinna szybko i jednolicie nabrać różowego wyglądu po reperfuzji. Delikatnie wepchnij nerkę z powrotem do przestrzeni zaotrzewnowej. Następnie zamknij warstwę mięśniową wchłanialnym szwem i zamknij skórę klipsami, podaj 0,05 mikrograma na gram znieczulenia buprenorfiny i 0,5 mililitra sterylnej normalnej soli fizjologicznej podskórnie.

Następnie przenieś mysz na poduszkę grzewczą i pozwól jej się obudzić przed przeniesieniem jej do pokoju dla zwierząt do pięciu godzin. Myszy można umieścić w każdej klatce po operacji, ściśle monitorować mysz i w razie potrzeby podawać dodatkowe środki przeciwbólowe co osiem do 12 godzin w przypadku bólu lub dyskomfortu w naszej dłoni. Jednostronne uszkodzenie IR z jednoczesnym kontralateralnym nefrektomią znacznie zmniejsza zmienność wyników w porównaniu z obustronnym uszkodzeniem IR.

Dzięki tej procedurze u 50 do 60% myszy rozwija się oczekiwana niewydolność nerek w ciągu 24 godzin po urazie. W praktyce oznacza to, że nadal istnieje znaczna zmienność przy użyciu tego modelu, ponieważ pozostałe myszy albo rozwijają bardzo małe obrażenia, albo mają znacznie poważniejsze obrażenia. Dla naszych celów jesteśmy w stanie zminimalizować ten problem.

Ponieważ grupy terapeutyczne, z których korzystamy, są zwykle rozpoczynane 24 godziny lub dłużej po początkowym urazie. W ten sposób myszy mogą być losowo przydzielane do różnych kończyn leczonych po uzyskaniu 24-godzinnego punktu czasowego kreatyniny. Myszy z wartościami kreatyniny poza z góry określonym zakresem są w tym momencie wykluczone z dalszych badań.

W przypadku umiarkowanych obrażeń zwykle wykluczamy myszy z wartościami kreatyniny w surowicy poza zakresem od 0,8 do 1,2 miligrama na decylitr. Oprócz wykonywania jednostronnego IR z jednoczesną nefrektomią przeciwległą, wykonujemy jednostronną IR samodzielnie. Myszy mogą przetrwać znacznie dłuższe okresy niedokrwienia i mają tendencję do rozwoju poważniejszego zwłóknienia po urazie.

Ponieważ jednak w tym modelu trudno jest ocenić powrót do zdrowia funkcjonalnego z jednostronnym uszkodzeniem w podczerwieni, nie ma sposobu, aby ocenić ciężkość urazu bez pobrania tkanek nerkowych, a to może nie być możliwe w przypadku badań długoterminowych. Z tego powodu opracowaliśmy protokół wywoływania ciężkiego jednostronnego uszkodzenia IR i oceny powrotu do czynności nerek poprzez wykonanie nefrektomii przeciwległej osiem dni po pierwotnym urazie. Stosując to podejście, od 90 do 100% myszy przeżywa uraz, ale co ważne, myszy rozwinęły bardzo spójne uszkodzenie nerek i można je ocenić pod kątem powrotu do sprawności funkcjonalnej po ostrym uszkodzeniu nerek od dziewiątego dnia.

Spójność i przewidywalność uszkodzenia nerek jest silnie uzależniona od spójności i precyzji czynności wykonywanych podczas operacji. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 35 do 40 minut i można ją wykonywać jednocześnie na dystansie od pięciu do 10 mil na raz. Użyliśmy tej metody do działania na dystansie od 40 do 50 mil dziennie, więc ciesz się i powodzenia.