Metoda pomidorów/GFP-FLP/FRT do obrazowania na żywo mozaikowych dorosłych komórek fotoreceptorowych Drosophila

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest analiza rozwoju i przetrwania mozaikowych neuronów fotoreceptorowych w siatkówce żyjących drosophila. Osiąga się to poprzez skrzyżowanie stada muchowego, niosącego mutację rekombinowaną na chromosomie FRT z pomidorem G-F-P-F-L-P-F-R-T. W potomstwie klony mozaiki są generowane przez rekombinację mitotyczną podczas rozwoju.

W drugim kroku żywe muchy są osadzane w aeros, co utrzymuje muchę w bezruchu. Następnie siatkówka unieruchomionej żywej muchy jest obrazowana za pomocą mikroskopu konfokalnego w celu wyświetlenia mozaiki neuronów fotoreceptorowych, wszystkie fotoreceptory wyrażają zielone białko fluorescencyjne, GFP, typ dziki i heterozygotyczne fotoreceptory wyrażają czerwoną fluorescencyjną pomidora białkowego na obrazie łączenia. Homozygotyczne receptory zmutowane są zielone, podczas gdy fotoreceptory typu dzikiego i heterozygotycznego są żółte.

Uzyskuje się wyniki, które pokazują wady rozwojowe i degenerację neuronów fotoreceptorowych na podstawie wizualizacji tej samej muchy w ciągu dni lub tygodni. Metoda pomidorowa, G-F-P-F-L-P-F-A, może pomóc odpowiedzieć na szybkie pytanie w dziedzinie zwyrodnienia neuronów i wykazać zapotrzebowanie na specyficzne geny do przetrwania i funkcji fotoreceptorów u dorosłej muszki. Metoda ta jest również przydatna do rozwiązywania problemów z S w mutantach wpływających na rozwój, takich jak te, w których wpływa na ustalenia polarności komórek PNA w porównaniu z klasycznym przekrojem histologicznym siatkówki.

Pierwszą zaletą tej metody jest to, że jest szybka i dlatego może być stosowana do przesiewania przepustowości lodu. Drugą zaletą tej metody jest to, że wykonuje się ją u żywych drosophila, co umożliwia analizę przebiegu w czasie degeneracji fotoreceptorów na poziomie pojedynczej komórki i przez kilka tygodni. W celu wizualizacji fotoreceptorów techniką neutralizacji rogówki, muchy muszą być unieruchomione na płytkach aros.

Zacznij od napełnienia butelki ze spryskiwaczem wodą i umieść ją na lodzie. Następnie przygotuj 200 mililitrów 1,5% aros i utrzymuj go w temperaturze 55 stopni Celsjusza, aż zostanie zużyty. Teraz znieczulaj muchy CO2 przez co najmniej minutę.

Wlej ciepły roztwór aros do szalki Petriego o średnicy 35 milimetrów lub 65 milimetrów i natychmiast umieść znieczuloną Drosophilę w aros. Zacznij od 10 much na danie. Ucząc się techniki z praktyką, można jednocześnie przesiać nawet 20 much.

Pod mikroskopem preparacyjnym zorientuj muszkilę na boku za pomocą kleszczy. Wepchnij jedno skrzydło w aros tak, aby skrzydło i połowa ciała były osadzone w aros. Przyklej drugie skrzydło do powierzchni aros.

Głowa nie jest osadzona. Jeśli muchy nie są osadzone wystarczająco głęboko, mucha będzie mogła swobodnie poruszać głową, powodując problemy. Wysokie temperatury aros mogą uszkodzić rogówkę, ale jeśli aros jest zbyt chłodny, trudno będzie osadzić muchę.

Gdy wszystkie muchy zostaną osadzone, przenieś naczynie do lodu i pozwól agros stwardnieć. Gdy aros zastygnie, włóż czaszę z powrotem do lunety i ustaw każdą głowę tak, aby jedno oko było wystawione na obiektyw zanurzeniowy. Kiedy pseudoźrenica, ciemna plama znajduje się pośrodku oka, głowa jest dobrze zorientowana.

Usuń również wszelkie nogi lub risi zasłaniające oko. Krok orientacji jest krytycznym krokiem, który ma na celu znalezienie obszaru oka o najszerszym polu ostrości. Fotoreceptory, zwykle jest to środek oka.

Po zorientowaniu wszystkich oczu przykryj muchy lodem, zimną wodą i umieść naczynie na lodzie, aby utrzymać znieczulenie, aż muchy zostaną uwidocznione. Aby zobrazować fotoreceptory, zacznij od umieszczenia szalki Petriego na szklanym szkiełku przymocowanym do stolika mikroskopowego, tak aby możliwe było płynne manipulowanie położeniem szalki na stoliku. Zanurz obiektyw zanurzeniowy w wodzie na szalce Petriego i umieść głowę muchy pod wiązką wzbudzenia.

Zacznij od filtra GFP. Jeśli trudno jest odróżnić części ciała muchy, zwłaszcza dystalną część brzucha i głowę, spójrz bezpośrednio na etap i zmień położenie drosophila. Przesuwaj stolik w górę i w dół, aż wiązka zbiegnie się na oku.

Gdy oko znajduje się na odpowiednim poziomie, odbija światło wzbudzenia. Patrząc przez okular lub na ekran, wyśrodkuj pole widzenia na oku i ustaw ostrość poniżej rogówki. W ten sposób uwidoczniono fluorescencyjne fotoreceptory.

Aby poprawić obraz konfokalny, otwórz otwór otworkowy szerzej niż jest to zwykle zalecane dla obiektywu. Na przykład użyj wartości 2 0 4 zamiast domyślnej 98 dla otworu otworkowego. Mikroskopia konfokalna stanowi dobrą alternatywę dla standardowej mikroskopii fluorescencyjnej, ponieważ obrazy mają mniejsze tło i szersze pole skoncentrowanych fotoreceptorów, aby śledzić los pojedynczego fotoreceptora w tym samym oku przez pewien okres czasu.

Najpierw zmniejsz temperaturę aros do 45 stopni Celsjusza, aby zmaksymalizować przeżycie zwierzęcia. Po drugie, umieść tylko jedną Drosophila na talerzu, aby muchy nie zostały pomieszane podczas obserwacji. Pamiętaj też, aby ustawić muchę po tej samej stronie, aby view to samo oko.

Następnie pod mikroskopem konfokalnym rozpoznaj ten sam klon fotoreceptora po jego kształcie i polaryzacji oka. Jeśli interesujący klon zostanie zgubiony w polu widzenia, zmień orientację oka pod wodą, aby przechowywać muchę. Aby ponownie wyświetlić później, spuść wodę z naczynia.

Następnie delikatnie wyciągnij muchę z aros za pomocą kleszczy, a następnie osusz muszkilę na tkance i przenieś ją do fiolki. Ustaw fiolkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza, upewniając się, że mucha nie utknęła w jedzeniu. Opisana metoda pomidorowa, G-F-P-F-L-P-F-R-T została wdrożona jako szybkie badanie przesiewowe w kierunku mutacji klonalnych w fotoreceptorach.

Badanie przesiewowe ujawniło wady rozwojowe wpływające na różne procesy i śmierć komórek neuronów fotoreceptorowych. Szczegółowe wyniki są dostępne online. Siedem zaocznie jest wymagane do rekrutacji fotoreceptorów, szczególnie dla R seven, jednego z wewnętrznych fotoreceptorów.

Utrata siedmiu zaocznie spowodowała utratę wewnętrznych fotoreceptorów i niektórych zewnętrznych fotoreceptorów. Ziarnista głowa bierze udział w ustalaniu polaryzacji komórek płaskich. Stwierdzono, że niektóre Oma TIA są odwrócone w klonach zmutowanych głów ziarnistych, a ziarnista głowa jest wymagana w fotoreceptorach R trzech do prawidłowej polaryzacji komórek płaskich, okruchów i białka błony wierzchołkowej wymaganej dla rabdo.

Stwierdzono, że morfogeneza prowadzi do nieregularnych, większych lub mniejszych fotoreceptorów po mutacji. Korzystając z opisanego protokołu, wykorzystano podłużne śledzenie poszczególnych fotoreceptorów, aby śledzić ich losy w wieku dorosłym. W ten sposób odkryto mutację tłuszczu P, która indukuje postępującą degenerację fotoreceptorów w wieku dorosłym.

W mozaikach fotoreceptory typu dzikiego nie były naruszone. Metoda ta była możliwa, ponieważ poszczególne fotoreceptory można było ponownie zidentyfikować na podstawie morfologii i polaryzacji klonu, do którego należą. Aby potwierdzić rolę tłuszczu P w mutancie tłuszczu P, zapobieżono degeneracji neuronów fotoreceptorowych poprzez ekspresję tłuszczu P typu dzikiego w zewnętrznych fotoreceptorach.

W tle mutantów, Po obejrzeniu tego filmu, powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować fotoreceptory mozaiki, neuro neuro w życiu do badania nad degeneracją i rozwojem neuro.