2.9: Oczyszczanie plazmidu

Plazmidy są kolistymi, pozachromosomalnymi cząsteczkami DNA, a w biologii molekularnej działają jako nośniki lub wektory dla określonego fragmentu DNA. Bakterie są wykorzystywane do replikacji plazmidów, dzięki czemu interesujące Cię DNA jest produkowane masowo. Proces, w którym naukowcy uzyskują plazmidy z bakterii, nazywa się oczyszczaniem plazmidu, co zostanie wyjaśnione w tym filmie.

Oczywiście oczyszczanie plazmidów polega na oczyszczaniu plazmidów, ale co to dokładnie oznacza? Aby oczyścić plazmidy, należy je wyizolować z chromosomu bakteryjnego, białek, błony bakteryjnej i rybosomów bakteryjnych.

Chociaż istnieje wiele różnych zestawów do oczyszczania plazmidów, podstawowa zasada oczyszczania plazmidu pozostaje taka sama dla wszystkich. Po pierwsze, wybrana kolonia bakteryjna jest hodowana w odpowiedniej pożywce hodowlanej, która zawiera odpowiednie antybiotyki. Dzięki genowi oporności na antybiotyki, kodowanemu przez plazmid, tylko bakterie zawierające plazmid będą rosły w tym podłożu. Bakterie są zbierane i poddawane lizie w warunkach wysokiego pH. pH jest neutralizowane, dodaje się sól, a następnie mieszaninę odwirowuje się w celu usunięcia zanieczyszczeń i genomowego DNA.

Zneutralizowany lizat komórkowy dodaje się do kolumny krzemionkowej. Uważa się, że plazmidowe DNA przylega do kolumny poprzez mechanizm zwany wymianą anionów, w którym DNA, silny anion, wiąże się z ujemnie naładowaną kolumną za pośrednictwem mostka soli kationowej. Inny materiał z lizatu, taki jak białka, jest przemywany przez kolumnę za pomocą buforów o wysokiej zawartości soli. Wreszcie, oczyszczony plazmid jest uwalniany z kolumny, gdy dodaje się bufor o niskiej zawartości soli, przerywając mostek solny.

Do tej procedury należy nosić fartuch laboratoryjny, jednorazowe rękawiczki i okulary ochronne.

Kultury bakteryjne, które są przekształcane z pożądanym plazmidowym DNA, powinny być hodowane przez noc w pożywkach wzrostowych z odpowiednim antybiotykiem w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37°C.

Następnego dnia kultura bakterii jest granulowana przez odwirowanie, a supernatant jest usuwany. Pozostały osad jest ponownie zawieszany w buforze do lizy.

Po ponownym zawieszeniu bakterie można przenieść do mniejszej probówki, w której dodaje się bufor do lizy. Bufor do lizy ma wysokie pH i zawiera detergenty, takie jak dodecylosiarczan sodu, które rozrywają błony bakteryjne, powodując w ten sposób lizę bakterii. Roztwór stanie się mętny po dodaniu buforu do lizy, a po wymieszaniu roztwór stanie się bardziej klarowny. Mieszanina nie powinna być wirowana ze względu na możliwość ścinania lub rozpadu genomowego DNA, co mogłoby następnie zanieczyścić oczyszczanie plazmidowego DNA.

Następnie dodaje się bufor neutralizacyjny w celu zneutralizowania warunków zasadowych i obniżenia pH. Przy delikatnym mieszaniu genomowe DNA, a także wszelkie białka z nim związane wytrącą się, podczas gdy plazmidowe DNA pozostanie w roztworze. Po raz kolejny unikaj wirowania, aby twoje plazmidy były wolne od zanieczyszczenia genomowego DNA.

Mieszanina jest następnie odwirowywana, a genomowy osad DNA/białkowy jest granulowany. Supernatant zawiera plazmidowe DNA, a także rozpuszczalne białka.

Ten supernatant umieszcza się w kolumnie przez dekantację, co jest fantazyjną nazwą oznaczającą jego wylanie lub pipetowanie. Granulkę można wyrzucić.

Następnie bufor płuczący o wysokiej zawartości soli przechodzi przez kolumnę, podczas gdy DNA pozostaje związane z krzemionką. Powtarzające się etapy mycia buforem o wysokiej zawartości soli usuwają endonukleazy, RNA, białka, barwniki i zanieczyszczenia o niskiej masie cząsteczkowej. Przepływ etapów mycia należy odrzucić. Po ostatnim etapie mycia upewnij się, że filtr jest całkowicie suchy, bez pozostałego bufora. Plazmidowe DNA nadal znajduje się na filtrze.

Plazmidowe DNA jest eluowane sterylną wodą lub buforem elucyjnym. DNA jest łatwo dostępne do natychmiastowego wykorzystania w szerokim zakresie zastosowań.

Istnieje wiele sposobów weryfikacji czystości plazmidów po oczyszczeniu. Spektrometr może być używany do porównywania absorbancji przy różnych długościach fal w celu określenia stężenia plazmidowego DNA. Analiza oczyszczonego plazmidu w żelu agarozowym może określić, czy plazmid ma prawidłowy rozmiar i czy nie ma zanieczyszczeń. Ten krok zapewnia, że nie ma zanieczyszczenia genomowego DNA, a plazmid nie został zmodyfikowany przez bakterie.

Procedura oczyszczania plazmidu może być modyfikowana w celu dostosowania do różnych rozmiarów plazmidów, liczby kopii, objętości kultury i może obejmować różne urządzenia do etapów wiązania, płukania i elucji. Wydajność jest jedną z najważniejszych różnic między preparatami plazmidowymi i często dzieli się je na minipreparat lub miniprep, midiprep, maxiprep i megaprep w zależności od pożądanej wydajności.

Jeśli chodzi o dalsze zastosowania, jedną z procedur, która zwykle następuje po oczyszczaniu plazmidu, jest transfekcja, która polega na wprowadzeniu plazmidowego DNA do komórek eukariotycznych. Często celem eksperymentu z transfekcją jest wizualizacja struktury komórek i tkanek z białkami reporterowymi, takimi jak te znakujące neurony na obrazach, które tutaj widzisz.

Czasami wiele plazmidów oczyszczonych za pomocą kilku preparatów oczyszczających można wprowadzić do tych samych bakterii, odtwarzając w ten sposób cały szlak biosyntezy poprzez produkcję wielu enzymów kodowanych przez plazmidy. Efektem końcowym jest wytwarzanie przez komórkę złożonego związku, takiego jak antybiotyk, który tu widzisz.

Oczyszczone plazmidy mogą być ponownie wprowadzone do bakterii w celu wytworzenia dużych ilości białka kodowanego przez plazmid. Tutaj widzisz, jak komórki bakteryjne są homogenizowane i poddawane lizie, zanim będzie można przeprowadzić technikę zwaną oczyszczaniem powinowactwa w celu wyizolowania docelowego białka. Oczyszczone białko jest krystalizowane, a następnie identyfikowana jest jego struktura.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do oczyszczania plazmidu. W tym filmie omówiliśmy podstawowe zasady stojące za tą metodą, jej opis krok po kroku oraz kilka zastosowań preparatu plazmidowego. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!