Test mikroiniekcji rany i lokalizacja in vivo reporterów odpowiedzi naskórka na ranę w zarodkach Drosophila.

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja in vivo reportera odpowiedzi naskórka na ranę w zarodku drosophila. Osiąga się to poprzez zebranie najpierw etapu rozwojowego, w którym aktywność reportera może być konsekwentnie wykrywana. Drugim etapem zabiegu jest nakłucie zarodka za pomocą szklanej igły i aparatu do mikroiniekcji.

Trzecim krokiem jest znieczulenie zarodka w celu uwidocznienia osoby zgłaszającej. Ostatnim krokiem jest walidacja lokalizacji reportera poprzez wykrycie wzorca ekspresji sond RNA. Ostatecznie wyniki mogą wykazać specyficzną aktywację reportera odpowiedzi naskórka na ranę tylko w komórkach otaczających miejsce nakłucia za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, które polegają na zamykaniu ran, jest to, że możemy zaobserwować w żywych zarodkach ekspresję genów, która jest wyzwalana przez zranienie kłute. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie naprawy tkanek, takie jak to, w jaki sposób komórki otaczające uraz regulują natychmiastową reakcję rany, aby promować naprawę. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii lub diagnostyki regeneracji tkanek, ponieważ regulacja odpowiedzi rany jest początkowym krokiem.

Gojenie się ran można ocenić na każdym etapie rozwoju. Jednak na etapie 17 naskórek jest zbyt dojrzały. Osoby zgłaszające znane rany nie zostaną aktywowane.

Tak więc, aby zademonstrować, stadium od 15 do 16 zostanie zranione w celu pobrania zarodków. Zbierz dwu- lub trzydniowe dorosłe muchy, 50 samic i 25 samców. Przenieś je do klatki do pobierania zarodków ze świeżym talerzem soku jabłkowego, agarem i porcją pasty drożdżowej.

Trzymaj klatkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza każdego ranka przez następne trzy dni. Wymień talerz na nowy. Po południu trzeciego dnia pozwól jajom gromadzić się na świeżym talerzu przez dwie godziny.

Przechowuj tę płytkę przez 14 godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Dwugodzinne nieśność powinna dać około 200 zarodków następnego dnia. Dodaj kilka mililitrów wody do talerza i delikatnie zamieszaj.

Następnie za pomocą pędzla przenieś wodę i zarodki z płytki do kosza z nylonowej siatki w tubie zbiorczej. Teraz zrób płytką kąpiel wybielającą i zanurz w niej zarodki przez dwie minuty. Ten krok usuwa COR, czyli jaja.

Muszla zakręć kąpielą kilka razy, aby zapobiec zlepianiu się zarodków. Po dwóch minutach spłucz zarodki bieżącą wodą i płukaniem szalki Petriego przez pięć sekund każde. Następnie przenieś kosz na zarodki do ręcznika papierowego, aby wysuszyć zarodki.

Następnie za pomocą igły preparacyjnej przenieś około 50 zarodków z siatki na płytkę agarową wykonaną z zielonego barwnika spożywczego. Barwnik służy do zwiększenia widoczności jaj kolanowych. Pod lunetą sekcyjną wykonaj dwa równoległe rzędy zarodków w odległości około pięciu milimetrów od siebie.

Ustaw rzędy od siebie na szerokość zarodka, aby umożliwić wymianę gazową. Następnie ostrożnie dociśnij szkiełko z podwójną taśmą klejącą do zarodków, tak aby rzędy były prostopadłe do długości szkiełka. Aby zmniejszyć ich ciśnienie wewnętrzne, pozwól zarodkom wyschnąć na powietrzu.

W ten sposób nie pękną, gdy zostaną ranni. Po 25 minutach pierwsze przygotowane szkiełko powinno być suche. Teraz przykryj zarodki dwiema lub trzema kroplami olejku węglowego halo, aby zapobiec dalszemu odwodnieniu i natychmiast przystąp do ranienia suchych zarodków.

Umieścić szkiełko zarodkowe w mikroskopie iniekcyjnym. Znajdź zarodki w polu widzenia i ćwicz przesuwanie stolika mikroskopu odwróconego. Teraz skoncentruj się na środkowej płaszczyźnie zarodka wzdłuż grzbietowej osi brzusznej i umieść górny zarodek pierwszego wyrównanego rzędu w polu widzenia.

Następnie ostrożnie umieść i zabezpiecz wyciągniętą igłę w uchwycie igły. Użyj mikromanipulatora, aby przesunąć igłę w dół do szkiełka. Wyrównaj igłę z zarodkiem w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.

Teraz nie reguluj dalej manipulatora mikrom. Teraz przesuń stolik, aby przebić zarodek na wskroś. Następnie przejdź do następnego zarodka w rzędzie.

Po zranieniu pierwszego rzędu przesuń igłę całkowicie w górę i odsuń ją od sceny. Następnie obróć szkiełko i kontynuuj nakłuwanie zarodków w drugim rzędzie. Gdy wszystkie zarodki są już zranione, można je natychmiast utrwalić w celu hybrydyzacji lub barwienia przeciwciałami.

Aby zbadać fluorescencyjne reportery, odczekaj od czterech do sześciu godzin i przenieś zarodek do nowego na nowym szkiełku, umieść szklane koraliki wokół zarodków. Następnie dodaj kilka kropli 50%One phenoxy, dwóch propanoli, który jest środkiem znieczulającym, i umieść szkiełko nakrywkowe na zarodkach do mikrozastrzyków. Załadować igłę do wstrzykiwań od tyłu jednym mikrolitrem roztworu chemicznego i barwnika, takiego jak 0,6 molowy nadtlenek wodoru.

Pozwolić, aby działanie kapilarne wciągnęło roztwór chemiczny do końcówki igły. Następnie złamij końcówkę igły o krawędź szkiełka nakrywkowego w mieszance oleju węglowego halo. Najpierw ustaw zamontowaną igłę w pozycji ustawionej tak, aby krawędź szkiełka nakrywkowego znajdowała się pod kątem niecałych 90 stopni.

Następnie delikatnie przesunąć krawędź szkiełka nakrywkowego po końcówce igły, aż do jej pęknięcia. Następnie należy docisnąć aparat do mikroiniekcji i sprawdzić, czy roztwór wypływa z igły. Jeśli nie płynie, rozerwij igłę nieco bardziej.

Teraz wykonaj tę samą procedurę, która jest używana do nakłuwania zarodków. Tym razem należy wprowadzić roztwór w mikro iniekcję jednocześnie z nakłuciem. Najlepiej wstrzyknąć 10 nanolitrów.

Jeśli do zarodka zostanie wstrzyknięta zbyt duża ilość roztworu, błona Vitale pęknie, postępując zgodnie z procedurą utrwalania w protokole tekstowym, należy zwrócić szczególną uwagę na następujące kroki. Użyj szklanej pipety, a nie plastikowej, aby przepłukać heptan na szkiełku i użyj szkła, aby zakręcić zarodki do środka szklanej szalki Petriego. Później potrząsaj zarodkami w utrwalaczu przez 25 minut z prędkością od 220 do 230 obr./min.

Po wstrząśnięciu pozwól, aby bąbelki na granicy faz pękły, zanim całkowicie usuniesz dolną fazę wodną. Uważaj też, aby nie wyrwać zarodków. Po dodaniu metanolu zranione zarodki powinny później zbiec się na granicy faz, rozprowadzić zarodki wzdłuż powierzchni płytki w ten sposób i przenieść je w ten sposób na szkiełko z podwójną taśmą samoprzylepną.

Następnie ostrożnie wepchnij zarodki igłą preparacyjną, aby przebić błonę Vitale i przystąp do odwodnienia. Muchy typu dzikiego poddano transformacji za pomocą fluorescencyjnych reporterów połączonych z dekarboksylazą DOPA lub wzmacniaczami hydroksylazy tyrozynowej i poddano opisanemu testowi. W jasnym polu można było zobaczyć miejsce rany, podczas gdy w oświetleniu fluorescencyjnym można było zobaczyć aktywność reportera rany DCD.

Reporter hydroksylazy tyrozynowej wykazał podobny wynik. Oba obrazy zostały zebrane za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica SP z obiektywem 20x. Zabieg wykonano w przypadku utraty funkcji przepływu dwóch mutantów.

Wprowadzenie, aktywność reporterowa dekarboksylazy DOPA została rozszerzona w komórkach naskórka w celu poprawy przepływu funkcji dwóch mutantów generowanych z wszechobecną ekspresją we wszystkich komórkach. Hamowanie reportera obserwowano w całych komórkach naskórka. Kolejne zarodki zostały jednocześnie zranione i wstrzyknięte rozpuszczony związek oraz nadtlenek wodoru i woda zwiększały aktywność reporterową dekarboksylazy DOPA w komórkach naskórka, podobnie jak wstrzyknięcie cyklodekstryny metylowej B w wodorotlenku sodu przy użyciu hybrydyzacji wewnątrz U.

Aktywacją transkrypcyjną genów odpowiedzi na ranę była endogenna dekarboksylaza DOPA. Zaobserwowano, że ekspresja RNA jest zlokalizowana wokół miejsca rany i oczywiście stwierdzono również, że hydroksylaza tyrozyny, transkrypty RNA gromadzą się w miejscu rany. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 60 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie poświęcać zbyt wiele czasu na wyrównywanie zarodków i przechodzić do kolejnych kroków procedury.