Name: Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-26T21:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Odkryj metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu do obrazowania komórek nowotworowych w 3D. Technika ta umożliwia wizualizację cytoszkieletu i migracji komórek w inwazyjnym środowisku macierzy zewnątrzkomórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Vasily'emu Gurchenkovowi (Instytut Curie) za pozyskiwanie i przetwarzanie obrazów na rysunku 3 oraz Placówce Obrazowania PICT-IBISA (Instytut Curie). Prace te były wspierane przez ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 oraz 3D – Complex in vitro cellular models.

1. TAMRA-kolagen I Etykietowanie
<ol>
	<li>Przygotować roztwór TAMRA o stężeniu 10 mg/ml, dodając 2,5 ml DMSO do dołączonego proszku 25 mg TAMRA. Rozpuść go przez wirowanie, aż do całkowitego rozpuszczenia. Przechowywać w temperaturze -20 ºC i chronić przed światłem.</li>
	<li>Przygotować 2 l buforu do etykietowania (0,25 M NaHCO3, 0,4 M NaCl). Doprowadzić pH do 9,5 za pomocą 10 M roztworu NaOH. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Od tego momentu wszystkie operacje są wykonywane w temperaturze 4 ºC, chyba że zaznaczono inaczej, a materiał fluorescencyjny jest chroniony przed światłem za pomocą folii aluminiowej.</li>
	<li>Napełnij jednorazową strzykawkę o pojemności 1 ml 1 ml wysoce stężonego roztworu kolagenu z ogona szczura I. Roztwory kolagenu o wysokim stężeniu są zwykle dostarczane w stężeniach około 10 mg/ml i są bardzo lepkie. Pamiętaj, aby manipulować nim powoli, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Za pomocą igły podskórnej o sile 21 G wstrzyknij kolagen do namoczonej kasety dializacyjnej o pojemności 3 ml z odciętymi 10 000 MWCO. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia membrany igłą. Usunąć całe powietrze z kasety do dializy, pociągając tłok strzykawki do góry. Dializuj go przez noc w 1 l buforu do etykietowania.</li>
	<li>Zmieszać 100 μl 10 mg/ml roztworu TAMRA z 900 μl buforu do etykietowania. Uwaga: Należy to zrobić zarówno za pomocą roztworu TAMRA, jak i buforu do etykietowania w temperaturze pokojowej, ponieważ DMSO zamarza w temperaturze 4 ºC. Po wymieszaniu doprowadzić rozcieńczony roztwór produktu TAMRA z powrotem do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie wyjąć kolagen z kasety dializacyjnej za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 2 ml z igłą podskórną o sile 21 G. Zmieszać 1 ml dializowanego roztworu kolagenu z 1 ml rozcieńczonego roztworu produktu TAMRA za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę kolagenu/TAMRA do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i inkubować przez noc z rotacją.</li>
	<li>Przenieś 2 ml kolagenu znakowanego TAMRA do wstępnie nasączonej kasety dializacyjnej o pojemności 3 ml i dializ przez noc na 1 l buforu do znakowania, aby usunąć nadmiar wolnego barwnika.</li>
	<li>Aby przywrócić kolagen znakowany TAMRA do oryginalnego roztworu kolagenu, umieść kasetę dializacyjną w 1 l 0,2% (v/v) roztworu kwasu octowego o pH 4 i dializa przez noc.</li>
	<li>Zmierzyć końcową objętość kolagenu znakowanego TAMRA i obliczyć jego końcowe stężenie, biorąc pod uwagę początkową objętość i stężenie użytego roztworu kolagenu. Przechowywać w temperaturze 4 ºC.</li>
</ol>
2. 3D Matryce kolagenowe TAMRA z wbudowanymi pojedynczymi komórkami
<ol>
	<li>Obliczyć objętość 2 mg/ml TAMRA-Collagen Mix niezbędną do przeprowadzenia eksperymentu. Zawsze przygotuj 20% więcej, aby uwzględnić straty w pipetowaniu spowodowane wysoką lepkością kolagenu.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy składający się z 10 PBS i 1 N NaOH. Filtrować-sterylizować i utrzymywać w temperaturze 4 ºC. Od tego momentu wszystkie operacje są przeprowadzane na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej i w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Wymieszaj 10x PBS i 1 N NaOH w odpowiednich objętościach, aby osiągnąć pożądane stężenie kolagenu i pH 7,4. Na przykład, aby uzyskać końcową objętość 1 ml TAMRA-Collagen Mix o pH 7,4, połącz 100 μl 10x PBS z 5 μl 1N NaOH. Dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Dodaj odpowiednie objętości zarówno kolagenu znakowanego TAMRA, jak i kolagenu nieznakowanego w stosunku 1:6, aby uzyskać końcowe całkowite stężenie kolagenu 2 mg / ml. Na przykład, aby uzyskać końcową objętość 1 ml 2 mg/ml TAMRA-Collagen Mix, dodaj 90,48 μl 3,68 mg/ml kolagenu znakowanego TAMRA i 415,71 μl 4,01 mg/ml kolagenu nieznakowanego. Dobrze i powoli mieszać pipetując, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Dodać komórki zawieszone w odpowiedniej objętości schłodzonej pożywki komórkowej bez FBS do TAMRA-Collagen Mix, aby uzyskać końcową gęstość komórek10-5 komórek/ml i końcowe stężenie kolagenu 2 mg/ml. Na przykład na 1 ml 2 mg/ml TAMRA-Collagen Mix dodać 388,81 μl pożywki zawierającej 105 komórek. Dobrze i powoli mieszać pipetując, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Potwierdź pH, testując 10 μl mieszaniny na pasku testowym pH.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl kropli TAMRA-Collagen Mix na szklane naczynia i pozostawić do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez 30-45 min. 100 μl kropli kolagenu ma typową średnicę 7 mm i wysokość 2 mm. Po polimeryzacji kolagen zamienia się w biało-biały żel. Uwaga: Umożliwienie polimeryzacji kolagenu bez zamykania naczynia pozwoli uniknąć tworzenia się filmu wodnego wokół kropli kolagenu, zmniejszając odklejanie się od szkła. Aby zwiększyć przyczepność, szklane naczynia można pokryć poli-L-lizyną w stężeniu 100 μg/ml.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj wystarczającą ilość pożywki hodowlanej, aby pokryć krople kolagenu/komórek. Unikaj dużych strumieni mediów lub nagłych ruchów, ponieważ krople kolagenu mogą łatwo się oderwać. Przechowywać w temperaturze 37 ºC w 10% nawilżonym powietrzu CO2 przez wystarczająco długi czas, aby komórki migrowały w matrycy (zwykle 1-3 dni).</li>
</ol>
3. 3D Matryce kolagenowe TAMRA z wbudowanymi sferoidami komórkowymi
<ol>
	<li>Obliczyć objętość 2 mg/ml TAMRA-Collagen Mix niezbędną do przeprowadzenia eksperymentu. Zawsze przygotuj 20% więcej, aby uwzględnić straty w pipetowaniu spowodowane wysoką lepkością kolagenu.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy składający się z 10 PBS i 1 N NaOH. Filtrować-sterylizować i utrzymywać w temperaturze 4 ºC. Od tego momentu wszystkie operacje są przeprowadzane na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej i w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Wymieszaj 10x PBS, 1 N NaOH i pożywkę komórkową bez FBS w odpowiednich ilościach, aby osiągnąć pożądane stężenie kolagenu i pH 7,4. Na przykład, aby uzyskać końcową objętość 1 ml TAMRA-Collagen Mix o pH 7,4, połącz 100 μl 10x PBS, 5 μl 1 N NaOH i 388,81 μl pożywki. Dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Dodaj odpowiednie objętości zarówno kolagenu znakowanego TAMRA, jak i kolagenu nieznakowanego w stosunku 1:6, aby uzyskać końcowe całkowite stężenie kolagenu 2 mg / ml. Na przykład, aby uzyskać końcową objętość 1 ml 2 mg/ml TAMRA-Collagen Mix, dodaj 90,48 μl 3,68 mg/ml kolagenu znakowanego TAMRA i 415,71 μl 4,01 mg/ml kolagenu nieznakowanego. Dobrze i powoli mieszać pipetując, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Potwierdź pH, testując 10 μl mieszaniny na pasku testowym pH.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl kropli TAMRA-Collagen Mix na szklane naczynia i pozostawić do rozpoczęcia polimeryzacji przez 2-5 minut. Pomoże to zapobiec zapadaniu się sferoid poprzez nieznaczne zwiększenie lepkości żelu. 100 μl kropli kolagenu ma typową średnicę 7 mm i wysokość 2 mm.</li>
	<li>Zbierz sferoidę komórkową i umieść ją na czystej szalce Petriego. Usunąć nadmiar płynu i ponownie zamieszać go w 10 μl TAMRA-Collagen Mix. Jest to ważne, aby zapobiec rozcieńczeniu kolagenu pożywką komórkową.</li>
	<li>Za pomocą pipety P20 zbierz sferoidę zawieszoną w kolagenie i umieść ją na środku kropli 100 μl TAMRA-Collagen Mix. Uwaga: Nie umieszczaj więcej niż jednej sferoidy na kroplę kolagenu, ponieważ mogą one wpływać na swoją zdolność do inwazji i/lub migracji.</li>
	<li>Pozostaw mieszankę TAMRA-Collagen do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez 30-45 minut. Po polimeryzacji kolagen zamienia się w biało-biały żel. Uwaga: Umożliwienie polimeryzacji kolagenu bez zamykania naczynia pozwoli uniknąć tworzenia się filmu wodnego wokół kropli kolagenu, zmniejszając odklejanie się od szkła. Aby zwiększyć przyczepność, szklane naczynia można pokryć poli-L-lizyną w stężeniu 100 μg/ml.</li>
	<li>Ostrożnie dodaj wystarczającą ilość pożywki hodowlanej, aby pokryć krople kolagenu/sferoidów. Unikaj dużych strumieni mediów lub nagłych ruchów, ponieważ krople kolagenu mogą łatwo się oderwać.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 37 ºC w 10% nawilżonym powietrzu CO2 przez wystarczająco dużo czasu, aby komórki mogły zaatakować/migrować w matrycy (zwykle 1-3 dni).</li>
</ol>
4. 3D Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń pożywkę komórkową i przepłucz matryce kolagenowe zawierające komórki/sferoidy PBS.</li>
	<li>Jednocześnie utrwalaj i ekstrahuj komórki przez inkubację z buforem ekstrakcyjnym/utrwalającym (4% PFA, 0,3% Triton X-100, 5% sacharozy w PBS) przez 5 minut. Uzupełnij bufor 2 μM falloidyną i 2 μM taksolem w celu wizualizacji cytoszkieletu lub białek związanych z cytoszkieletem.</li>
	<li>Następnie utrwal komórki za pomocą 4% PFA, 5% sacharozy w PBS przez 30 min. Płukać 0,05% Tween-20 w PBS.</li>
	<li>Przygotować roztwory przeciwciał pierwszorzędowych w PBS. Inkubować komórki z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 ºC. Upewnij się, że dodałeś wystarczającą ilość roztworu, aby pokryć całą kroplę kolagenu. W przypadku naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm konieczne będzie 1,5-2 ml roztworu. Uwaga: Aby zmniejszyć objętość roztworu przeciwciała, wokół kropli kolagenu można umieścić nierozpuszczalną w wodzie barierę, taką jak okrągła linia smaru silikonowego lub pierścień PDMS.</li>
	<li>Prać 3x 30 min z 0,05% Tween-20 w PBS.</li>
	<li>Przygotuj przeciwciała drugorzędowe sprzężone z Alexą, roztwory falloidyny sprzężonej z Alexą i DAPI w PBS. Inkubować komórki z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Prać 3x 30 min z 0,05% Tween-20 w PBS.</li>
	<li>Usuń nadmiar płynu, dodaj wystarczającą ilość materiału montażowego, aby wypełnić dno szklanego dna naczynia (ok. 500 μl) i umieść szkiełko nakrywkowe o średnicy 24 mm na górze, aby uszczelnić. Nie dociskaj szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć ściśnięcia kropli kolagenu i uszkodzenia organizacji 3D.</li>
</ol>
5. Obrazowanie próbki
Można używać klasycznych lub wirujących mikroskopów konfokalnych. Do określenia odległości obrazowanych komórek od szklanego dna należy preferować system odwrócony. System wykorzystany do tej pracy to odwrócony konfokalny dysk wirujący wyposażony w obiektywy olejowe 40X/1,3NA i 60X/1,4NA (odległości robocze odpowiednio 200 μm i 130 μm), kamera fotometryczna CoolSNAP HQ2, matryca obrazowania 1392 x 1040, piksele 6,45 x 6,45 μm i sterowany przez oprogramowanie do obrazowania Metamorph. Lasery 405 nm, 491 nm, 561 nm i 633 nm są zwykle używane przy mocy 30–50%, wzmocnieniu 1 i binningu 2 x 2 w celu skrócenia czasu ekspozycji. Mikroskop jest również wyposażony w lampę Hg i kostki filtrujące do DAPI (exc 400-418 nm; em 450-465), FITC (exc 478-495; em 510-555) i Texas Red (exc 560-580; em 600-650) do użytku z okularem.
<ol>
	<li>Za pomocą świetlówki umieść obiektyw 40X na środku kropli kolagenu. Zapoznaj się z omówieniem przykładu, zarówno na osi x-y, jak i na osi z. Upewnij się, że nie odchylasz się o więcej niż 100 μm od krawędzi żelu na osi x-y podczas pozyskiwania obrazów, aby uniknąć efektów krawędzi. Podczas obrazowania sferoid upewnij się, że znajdują się one w obiektywnej odległości roboczej. W razie potrzeby zmień cel.</li>
	<li>Przełącz się na konfokalny tryb obrazowania na żywo. Używając lasera 561 nm do wizualizacji kolagenu znakowanego TAMRA, zaczynając od szklanego dna, określ wartość z, przy której zaczynają pojawiać się włókna kolagenowe. To jest dno podłoża i z = 0.</li>
	<li>Za pomocą pokrętła ostrości zwiększ o 100 μm od z = 0. Tylko komórki o wartości z = 100 μm lub wyższej powinny być obrazowane, aby uniknąć efektów naprężeń ze sztywnego szklanego dna.</li>
	<li>Zaznacz komórki do zobrazowania. Zoptymalizuj czas naświetlania kamery i moc lasera dla każdej długości fali. Typowe czasy ekspozycji dla DAPI i Alexa-488 Phalloidin wynoszą od 100 do 200 ms. Czas ekspozycji na barwienie przeciwciałami może się różnić.</li>
	<li>W konfokalnym trybie na żywo przy użyciu odpowiedniego lasera do wizualizacji barwienia falloidyną i za pomocą pokrętła ostrości zdefiniuj interwał serii z, ustawiając górne i dolne wartości z na bieżące.</li>
	<li>Określ rozmiar kroku Z. W przypadku obiektywów 40X użyj 1 μm. W przypadku 60X użyj 0,5 μm. Rozpocznij akwizycję.</li>
</ol>

<ol><li>Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha+2+beta+1+%28VLA-2%29+mediates+reorganization+and+contraction+of+collagen+matrices+by+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells.</a> Cell. 67 (2), 403-410 (1991).</li>
<li>Klein, C. E., Dressel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha+2+beta+1+is+upregulated+in+fibroblasts+and+highly+aggressive+melanoma+cells+in+three-dimensional+collagen+lattices+and+mediates+the+reorganization+of+collagen+I+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils.</a> J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).</li>
<li>Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Zänker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+highly+aggressive+MV3+melanoma+cells+in+3-dimensional+collagen+lattices+results+in+local+matrix+reorganization+and+shedding+of+alpha2+and+beta1+integrins+and+CD44%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44.</a> Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).</li>
<li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+cancer%3A+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li>
<li>Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).</li>
<li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).</li>
<li>Fraley, S. I., Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li>
<li>Harunaga, J. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-matrix+adhesions+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-matrix adhesions in 3D.</a> Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).</li>
<li>Raub, C. B., Suresh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+assessment+of+collagen+gel+microstructure+and+mechanics+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy.</a> Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).</li>
<li>Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+cancer+cells+have+distinct+adhesions+in+3D+collagen+matrices+and+in+vivo%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?</a> Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).</li>
<li>Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+in+growth-cone+steering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering.</a> J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), (2011).</li>
<li>Haji-Karim, M., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+viability+in+cellular+spheroids+of+human+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin.</a> Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).</li>
<li>Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+in+collagen+and+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Cross-linking in collagen and elastin.</a> Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).</li>
<li>Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., Böni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+handy+assay+for+collagenase+using+reconstituted+fluorescein-labeled+collagen+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils.</a> Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).</li>
<li>Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+algorithm+for+extracting+the+network+geometry+of+three-dimensional+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels.</a> J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).</li>
<li>Sabeh, F., Ota, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+traffic+through+the+extracellular+matrix+is+controlled+by+the+membrane-anchored+collagenase+MT1-MMP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP.</a> J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).</li>
<li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+in+three-dimensional+collagen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cells in three-dimensional collagen matrix.</a> Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).</li>
<li>Jawerth, L. M., Münster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blind+spot+in+confocal+reflection+microscopy%3A+the+dependence+of+fiber+brightness+on+fiber+orientation+in+imaging+biopolymer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks.</a> Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).</li>
<li>Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+molecular+structure+to+tissue+architecture%3A+collagen+organization+probed+by+SHG+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy.</a> J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany tutaj protokół fluorescencyjnego znakowania kolagenu I za pomocą TAMRA stanowi doskonałą metodę umożliwiającą łatwą wizualizację organizacji sieci kolagenowej przy użyciu standardowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser o długości fali 561 nm. Zaletą tej techniki w porównaniu z refleksyjną mikroskopią konfokalną jest możliwość obrazowania włókien kolagenowych głębiej w matrycy 3D. Intensywność i kontrast odbicia włókien znacznie zmniejsza się wraz z głębokością ze względu na absorpcję i rozpraszanie świ...

Dziedzina migracji komórek odważnie wkracza w zupełnie nowy świat trzeciego wymiaru. Intuicyjne jest badanie migracji komórek w środowisku, które najbardziej przypomina środowisko fizjologiczne, a zatem trójwymiarowe (3D). Jednak ze względu na ograniczenia techniczne, większość badań migracji komórek przeprowadzono analizując ruch komórek przez sztywne dwuwymiarowe (2D) podłoża, nieleczone lub pokryte odpowiednimi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM).
Pierwsze badania poświęcone migracji komórek w trójwymiarowych sieciach kolagenowych sięgają ponad 20 lat1-3. Jednak dopiero w ciągu ostatnich 5 lat stało się jasne, że komórki migrujące mogą znacznie różnić się morfologią i sposobem migracji w zależności od wymiarowości substratu. W 2D komórki stykają się z podłożem tylko swoją powierzchnią brzuszną za pomocą zrostów ogniskowych, co powoduje powstawanie szerokich płaskich wypukłości (lamellipodia) z osadzonymi wypukłościami przypominającymi palce (filopodia) na ich krawędzi czołowej. Uważa się, że struktury te, wraz z włóknami naprężeniowymi, które łączą przód komórki z krawędzią spływu, mają kluczowe znaczenie dla ruchu komórki w 2D. W matrycach 3D komórki są na ogół bardziej wydłużone, a cała powierzchnia komórki styka się z ECM, co powoduje znaczne zmiany w tworzeniu i funkcjonalnym znaczeniu wielu z tych struktur. I odwrotnie, inne cechy komórkowe zyskują na znaczeniu w migracji 3D, takie jak deformacja jądrowa i struktury zaangażowane w przebudowę ECM4.
Pomimo tych znanych zmian morfologicznych, jak również różnic w trybach migracji5-7, które mogą się różnić w zależności od ECM i typów komórek, analiza strukturalna i funkcjonalna komórek osadzonych w matrycach 3D nadal pozostaje niezwykła. Praca z grubymi i gęstymi matrycami 3D wiąże się z trudnościami technicznymi, takimi jak obrazowanie mikroskopowe w wysokiej rozdzielczości oraz niezgodności z większością standardowych protokołów zoptymalizowanych pod kątem hodowli 2D, takich jak znakowanie immunofluorescencyjne białek endogennych. Ponadto, ponieważ zastosowanie matryc 3D jest stosunkowo nowym podejściem, naukowcy wciąż badają najlepsze warunki, aby jak najbardziej przypominać określone sytuacje in vivo, takie jak normalna architektura zrębu różnych narządów tkankowych lub organizacja ECM wokół guza. Rozbieżności w wynikach różnych grup, dotyczące na przykład sposobów migracji komórek nowotworowych lub istnienia zrostów ogniskowych, wzbudziły pewne kontrowersje8. Ostatnio włożono wiele wysiłku w osiągnięcie konsensusu w zakresie charakteru chemicznego ECM, wielkości porów, grubości włókien i sztywności matrycy. Obecnie stosuje się wiele różnych typów ECM 3D, od matryc pochodzących z komórek po dostępny na rynku matrigel, pepsynizowany kolagen bydlęcy I lub niepepsynizowany kolagen z ogona szczura I. Każda z tych matryc ma określone właściwości fizyczne i chemiczne i należy odnieść wybraną matrycę do badanego procesu fizjologicznego. Ponadto wielkość porów i grubość włókien mogą zależeć od warunków polimeryzacji, takich jak pH i temperatura9,10. Wiązanie i odległość od sztywnych podłoży, takich jak szkło, może również zmienić właściwości sprężyste matrycy10,11.
Ten artykuł opisuje metody przygotowania i obrazowania 3D hodowli komórek nowotworowych, zarówno jako pojedynczych komórek, jak i sferoidów. Metody wytwarzania sferoid komórek nowotworowych zostały już wcześniej opisane, z których najpopularniejsze to metoda wiszącejkropli 12,13 i metoda płytki pokrytej agarozą14. Jako odpowiedni substrat ECM do migracji komórek rakowych, stosuje się niepepsynizowany kolagen z ogona szczura I polimeryzowany w temperaturze pokojowej w dawce 2 mg / ml. Niepepsynizowany kolagen I ekstrahowany kwasem I z ogona szczura zachowuje zarówno N-, jak i C-końcowe telopeptydy, niespiralne części cząsteczki kolagenu odpowiedzialne za natywne sieciowanie międzycząsteczkowe kolagenu i stabilność włókien15. Razem warunki te pozwalają na tworzenie sieci kolagenowych, które najbardziej przypominają te obserwowane in vivo10. Aby umożliwić wizualizację włókien kolagenowych, zarówno w kulturach stałych, jak i żywych, przedstawiono szczegółowy protokół fluorescencyjnego znakowania kolagenu in vitro10 przy użyciu estru sukcynimidylu 5-(i-6)-karboksytetrametylorodaminy (TAMRA). Protokół ten został zaadaptowany z Baici i wsp.16,17, gdzie izotiocyjanian fluoresceiny jest używany do znakowania rozpuszczalnych cząsteczek kolagenu. Jako fluoresceina, TAMRA jest amino-reaktywnym barwnikiem fluorescencyjnym, który reaguje z nieprotonowanymi alifatycznymi grupami aminowymi białek, takimi jak wolna grupa aminowa na N-końcu i, co ważniejsze, boczna grupa aminowa lizyn. Ta reakcja zachodzi tylko przy zasadowym pH, gdy grupa aminowa lizyny jest w postaci nieprotonowanej. Oprócz tego, że TAMRA jest z czasem bardziej stabilna niż fluoresceina, jej widma emisyjne mieszczą się w zakresie pomarańczowym/czerwonym (ex/em = 555/518 nm), które można z pożytkiem łączyć do obrazowania żywych komórek białek znakowanych GFP. Stosowanie rozpuszczalnych cząsteczek znakowanych kolagenem z barwnikami aminoreaktywnymi nie wpływa na proces polimeryzacji ani na gęstość, wielkość porów i stopień usieciowania macierzy kolagenowej10,16,18,19.
Ten protokół zawiera również metodę immunofluorescencyjnego znakowania 3D białek endogennych, która została dodatkowo zoptymalizowana do znakowania cytoszkieletu lub białek związanych z cytoszkieletem. Ostatnim celem tego protokołu są metody pozyskiwania obrazów 3D o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii konfokalnej ze zmniejszonym udziałem szkiełek nakrywkowych ze szkiełka nakrywkowego na napięcie matrycy kolagenowej.

<table><tbody><tr><td>TAMRA, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C-1171</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolagen o wysokim stężeniu</td><td>szczurzego ogona BD Biosciences</td><td>354249</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolagen z ogona szczura</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>P2141</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Taxol (Paxitel)</td><td>Sigma</td><td>T7402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-alfa tubuliny</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa 633 Goat Przeciwciało anty-mysie</td><td>Invitrogen</td><td>A21052</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nośnik montażowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>106 226 89</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaseta dializacyjna</td><td>Pierce</td><td>66380</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Automatyzacja mikroskopii MetaMorph i Oprogramowanie do analizy obrazu</td> Urządzenia <td></td><td>molekularne</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Imaris 7.2.3</td><td>Bitplane</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3d

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Migracja komórek była tradycyjnie badana na podłożach 2D. Jednak staje się coraz bardziej oczywiste, że istnieje potrzeba badania migracji komórek w bardziej odpowiednich środowiskach 3D, które lepiej przypominają wymiarowość omawianych procesów fizjologicznych. Komórki migrujące mogą znacznie różnić się morfologią i sposobem migracji w zależności od tego, czy poruszają się na podłożach 2D, czy 3D. Ze względu na trudności techniczne i niezgodności z większością standardowych protokołów, analiza strukturalna i funkcjonalna komórek osadzonych w matrycach 3D nadal pozostaje rzadkością. W artykule opisano metody przygotowania i obrazowania 3D hodowli komórek nowotworowych, zarówno jako pojedynczych komórek, jak i sferoid. Jako odpowiedni substrat ECM do migracji komórek nowotworowych używamy niepepsynizowanego kolagenu z ogona szczura I polimeryzowanego w temperaturze pokojowej i znakowanego fluorescencyjnie, aby ułatwić wizualizację przy użyciu standardowych mikroskopów konfokalnych. Praca ta obejmuje również protokół znakowania immunofluorescencyjnego 3D cytoszkieletu komórek endogennych. Korzystając z tych protokołów, mamy nadzieję przyczynić się do lepszego opisu składu molekularnego, lokalizacji i funkcji struktur komórkowych w 3D.

Znakowanie kolagenu typu I z ogona szczura za pomocą TAMRA umożliwia łatwe przygotowanie i wizualizację trójwymiarowych sieci kolagenowych. Powolna polimeryzacja w temperaturze pokojowej prowadzi do powstania sieci kolagenowych o organizacji porównywalnej do tych występujących in vivo10.
W niniejszej pracy przedstawiamy protokół barwienia immunofluorescencyjnego cytoszkieletu komórek nowotworowych CT26, zarówno w formie sferoidów, jak i pojedynczych komórek. Aby le...

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest obserwacja morfologii komórek nowotworowych oraz ich oddziaływania z macierzą zewnątrzkomórkową w hodowlach 3D. Jest to realizowane najpierw poprzez znakowanie kolagenu z ogona szczura czerwonym fluorescencyjnym barwnikiem DTRA, co umożliwia wizualizację trójwymiarowych sieci kolagenowych. W drugim kroku komórki nowotworowe hodowane jako pojedyncze komórki lub wielokomórkowe sferoidy są osadzane w 3D macierzach kolagenowych znakowanych Tamra. Następnie komórkom pozwala się na rozprzestrzenienie w kolagenie przez okres od jednego do trzech dni, co naśladuje inwazję i migrację komórek nowotworowych do otaczającego trójwymiarowego zrębu in vivo.Następnie komórki są utrwalane i poddawane immunobarwieniu z użyciem odpowiednich przeciwciał oraz Phin w celu wizualizacji morfologii komórek i lokalizacji badanych białek. Ostatecznie, charakterystyczna morfologia komórek nowotworowych hodowanych w 3D oraz ich interakcja z trójwymiarową macierzą zewnątrzkomórkową mogą zostać przeanalizowane poprzez wykonanie głębokich stosów obrazów (z-stacks) próbek za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu migracji komórek, przyczyniając się do lepszego opisu składu molekularnego, funkcji i lokalizacji komponentów komórkowych w środowiskach 3D, które przez wiele lat analizowano w 2D.Procedurę tę zaprezentuje Anton Smo, technik w naszym laboratorium. Aby znakować kolagen typu I. Zacznij od powolnego napełnienia jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml za pomocą 1 ml silnie skoncentrowanego roztworu kolagenu z ogona szczura typu I, unikając pęcherzyków powietrza. Przymocuj igłę hipodermiczną o rozmiarze 21 G, a następnie wstrzyknij kolagen do uprzednio namoczonej kasety dializacyjnej o pojemności 3 ml z odcięciem masy cząsteczkowej białek 10 000 Da, uważając, aby nie uszkodzić membrany igłą.Odciągnij tłok, aby usunąć całe powietrze z kasety, a następnie dializuj kolagen przez noc przeciwko jednemu litrowi buforu do znakowania. Następnego ranka ostrożnie wyjmij kolagen z kasety do dializy, a następnie zmieszaj jeden mililitr zdializowanego roztworu kolagenu z jednym mililitrem zimnego, świeżo rozcieńczonego roztworu Tamra w probówce do mikrowirówki o pojemności dwóch mililitrów. Owiń probówkę folią i inkubuj przez noc w warunkach rotacji.Następnego ranka przenieść kolagen znakowany TAMRA do uprzednio namoczonej kasety dializacyjnej i dializować kolagen przez noc przeciwko jednemu litrowi buforu do znakowania w celu usunięcia nadmiaru barwnika. Następnie, aby zakonserwować kolagen znakowany TAMRA, umieścić kasetę dializacyjną w jednym litrze 0,2% (obj./obj.) roztworu kwasu octowego o pH 4 i dializować kasetę przez noc. Ponownie, następnego ranka przenieść kolagen znakowany TAMRA z kasety dializacyjnej do probówki do mikrowirówki, zmierzyć za pomocą mikropipety końcową objętość kolagenu, a następnie obliczyć końcowe stężenie kolagenu znakowanego TAMRA.Biorąc pod uwagę początkową objętość i stężenie zastosowanego roztworu kolagenu, należy przechowywać kolagen DY w temperaturze 4 °C, w ciemności, w celu zatopienia pojedynczych komórek. Należy określić objętość mieszaniny kolagenu Tamara o stężeniu 2 mg/mL niezbędną do przeprowadzenia eksperymentu, a następnie zmieszać odpowiednie objętości 10x PBS i 1N wodorotlenku sodu.Następnie zmieszać odpowiednie objętości kolagenu znakowanego Tamara oraz kolagenu nieznakowanego w stosunku 1:6, aby uzyskać końcowe całkowite stężenie kolagenu 2 mg/mL. Teraz zawiesić badane komórki w odpowiedniej objętości schłodzonego medium komórkowego bez FBS, a następnie dodać komórki do mieszaniny kolagenu Tamara, aby uzyskać końcową gęstość komórek 1 × 10⁵ komórek/mL. Potwierdzić pH, testując 10 µL mieszaniny na pasku testowym pH, a następnie nanieść pipetą krople po 100 µL zawiesiny komórek w kolagenie Tamara na szalki z szklanym dnem, pozwalając mieszaninie polimeryzować w temperaturze pokojowej do momentu, aż kolagen przekształci się w białawy żel, co zajmuje około 30–45 minut.Następnie ostrożnie dodaj odpowiednią ilość pożywki hodowlanej, aby zakryć krople z zatopionymi w kolagenie komórkami, i inkubuj krople w temperaturze 37°C w 10% carbon dioxide przez czas wystarczający do migracji komórek w całej macierzy. W przypadku zatapiania steroidów komórkowych jest to zazwyczaj od jednego do trzech dni. Pipetuj krople o objętości 100 µL świeżo rozcieńczonego kolagenu terycznego.Wymieszać na szalkach z szklanym dnem i pozostawić kolagen na dwie do pięciu minut w celu zainicjowania polimeryzacji, aby nieznacznie zwiększyć lepkość żelu. Następnie zebrać steroid komórkowy i umieścić go na świeżej szalce Petriego. Usunąć nadmiar cieczy i resuspendować steroid w 10 µL mieszaniny kolagenu Tamara, aby zapobiec rozcieńczeniu kolagenu w pożywce komórkowej.Następnie za pomocą pipety P 20 pobierz zawiesinę steroidu w kolagenie i umieść ją w centrum górnej części kropli mieszaniny kolagenowej TEMA o objętości 100 microliter. Krótka polimeryzacja kolagenu przez dwie do pięciu minut jest zazwyczaj wystarczająca, aby zapewnić, że OID znajduje się w odległości ponad sto mikronów zarówno od górnej, jak i dolnej krawędzi kropli kolagenu. Jeśli jednak steroid nadal opada, spróbuj odwrócić naczynie do góry dnem na około dwie minuty, a następnie ustaw je w pozycji pionowej.Pozostaw kolagen do spolimeryzowania, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, a następnie ostrożnie dodaj wystarczającą ilość pożywki hodowlanej, aby zakryć krople kolagenu ze steroidami. Następnie inkubuj krople, aby umożliwić migrację komórek w całej macierzy przed barwieniem immunofluorescencyjnym. Rozpocznij od ostrożnego usunięcia pożywki komórkowej i wypłukania macierzy kolagenowych z osadzonymi steroidami za pomocą PBS.Następnie inkubuj komórki z buforem do ekstrakcji i fiksacji. Po kolejnych pięciu minutach utrwal komórki za pomocą PFA i sacharozy w PBS przez 30 minut. Następnie wypłucz komórki.Następnie inkubuj komórki z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w PBS. Potem wypłucz matryce trzykrotnie, przez 30 minut podczas każdego płukania. Po trzecim płukaniu inkubuj matryce z przeciwciałami wtórnymi, koniugatem Alexa Phin oraz DPI rozcieńczonymi w PBS.Następnie, po ponownym przemyciu matryc, usunąć nadmiar cieczy i dodać około 500 µL medium montażowego, wypełniając dno szalek. Teraz każdą kroplę należy przykryć szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 24 mm, uważając, aby nie naciskać kropli i nie uszkodzić struktury matryc. Próbki są gotowe do obrazowania.Ustaw obiektyw 40x na środku kropli kolagenu. Następnie, korzystając z lampy fluorescencyjnej, uzyskaj ogólny obraz próbki w osiach XY oraz XZ. Następnie przełącz urządzenie w tryb konfokalnego obrazowania na żywo.Używając lasera o długości fali 561 nanometrów, rozpocznij ustawianie ostrości od dna szkiełka, aż zaczną pojawiać się włókna kolagenowe. Przyjmij tę głębokość jako Z równe zero mikrometrów. Następnie podnieś obiektyw, aż osiągnie wysokość 100 mikrometrów powyżej Z równego zero, a następnie obrazuj komórki znajdujące się na poziomie z równym 100 mikrometrów lub powyżej, aby uniknąć efektów napięcia wynikających ze sztywnego szklanego dna. Oznaczenie kolagenu typu I z ogona szczura za pomocą Tamary umożliwia łatwe przygotowanie i wizualizację trójwymiarowych sieci kolagenowych.Powolna polimeryzacja w temperaturze pokojowej pozwala na utworzenie sieci widocznych tutaj na czerwono, których organizacja jest porównywalna do organizacji białek cytoszkieletu występujących in vivo, takich jak tubulina, widoczna tutaj na niebiesko, lub aktyna, pokazana tutaj na zielono; można je uwizualizować za pomocą immunobarwienia, co zaprezentowano na tych obrazach w macierzach 3D. Komórki gruczolaka jelita grubego CT 26 wykazują typową morfologię mezenchymalną, charakteryzującą się wydłużonym ciałem komórki z zakończeniami w postaci wypustek komórkowych bogatych w f-aktynę, które przypominają filopodia i lamellipodia. Ta wydłużona morfologia jest jeszcze bardziej widoczna w komórkach próbujących uciec ze sferoidu komórkowego poprzez naciekanie macierzy kolagenowej. Po dwóch dniach hodowli komórki zaczynają naciekać trójwymiarową macierz kolagenową, oddalając się od sferoidu komórkowego.Kluczowe jest przeanalizowanie zgromadzonych stosów Z ze wszystkich płaszczyzn widoku, aby upewnić się, że rozkład komórek w obrazach 3D jest jednorodny. Na przykład, przy wizualizacji w postaci maksymalnej projekcji XY, komórki CT 26 hodowane w sferoidach sprawiają wrażenie rozległego naciekania trójwymiarowej macierzy kolagenowej. Jednakże widok XZ ujawnia, że komórki w rzeczywistości naciekają ograniczony przedział Z w stosunku do objętości sferoidu, co sugeruje preferencyjny obszar naciekania.Ten reprezentatywny steroid został w rzeczywistości umieszczony zbyt blisko szklanego dna naczynia, co spowodowało migrację komórek w kierunku przeciwnym do steroidu – nie poprzez naciekanie trójwymiarowej macierzy kolagenowej, lecz poprzez przemieszczanie się po dwuwymiarowym, sztywnym szkle po wykonaniu tej procedury. Inne metody, takie jak obrazowanie na żywo komórek wykazujących ekspresję GFP osadzonych w macierzach kolagenowych z TAMRA, mogą być wykorzystane do dokładnego śledzenia dynamicznych interakcji między komórką a macierzą lub deformacji macierzy indukowanej przez komórki.

revealing-the-cytoskeletal-organization-of-invasive-cancer-cells-in-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ujawnienie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek rakowych w 3D

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Ten film przedstawia szczegółową metodologię hodowli komórek raka piersi w matrycy białkowej błony podstawnej 3D, ilustrując potencjał hodowli 3D w ocenie inwazji komórek do otaczającego środowiska.

Test błony podstawnej hodowli 3D: hodowla komórek rakowych na matrycy białkowej błony podstawnej 3D w celu zbadania inwazji komórek

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Profilowanie molekularne laserowo mikrowypreparowanych komórek i zrębu z syntetycznych, tkankowo modyfikowanych modeli raka jelita grubego stanowi nowatorskie i podatne na manipulację podejście do charakterystyki i analizy charakterystycznej biologii na styku komórek nowotworowych na froncie inwazyjnym i komórek zrębu związanych z rakiem.

Profilowanie molekularne inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów ex vivo

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Komórki rakowe są umieszczane w żelu kolagenowym, a następnie umieszczane w bezkomórkowym żelu fibrynowym w celu wygenerowania systemu hodowli 3D, w którym można monitorować inwazyjność i powstawanie nowotworów satelitarnych.

Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

Ten protokół skutecznie bada podział komórek ssaków w matrycach kolagenowych 3D poprzez integrację synchronizacji podziału komórek, monitorowanie zdarzeń podziału w matrycach 3D za pomocą techniki obrazowania żywych komórek, czasowo-rozdzielczą konfokalną mikroskopię refleksyjną i ilościową analizę obrazowania.

Podział komórek ssaków w matrycach 3D za pomocą ilościowej konfokalnej mikroskopii refleksyjnej

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji urządzenia do obrazowania sferoidowego. Urządzenie to umożliwia dynamiczne lub podłużne obrazowanie fluorescencyjne sferoid komórek nowotworowych. Protokół oferuje również prostą procedurę przetwarzania obrazu do analizy inwazji komórek rakowych.

Czasowo-rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne i analiza inwazji komórek nowotworowych w modelu sferoidalnym 3D

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Odkryj metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu do obrazowania komórek nowotworowych w 3D. Technika ta umożliwia wizualizację cytoszkieletu i migracji komórek w inwazyjnym środowisku macierzy zewnątrzkomórkowej.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Przeglądaj więcej filmów