Metody in vitro Test kokultury w celu oceny migracji transnabłonkowej neutrofili indukowanej patogenem

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie liczby neutrofili, które przekroczyły monowarstwę komórek nabłonka w odpowiedzi na infekcję. Osiąga się to poprzez kodowanie kolagenu transwelli przed staranną hodowlą monowarstw komórek nabłonka za pomocą manewru odwróconego filtra transwellowego. W drugim etapie hoduje się patogen bakteryjny w celu zainfekowania wierzchołkowej powierzchni monowarstwy nabłonka wyhodowanej na filtrach transwell, co powoduje, że komórki nabłonka wytwarzają endogenne atraktanty chemochłonne neutrofili.

Następnie neutrofile wyizolowane z krwi pełnej dodaje się do podstawno-bocznej strony zakażonych monowarstw nabłonka wyhodowanych na filtrach transwell w celu oznaczenia migracji neutrofili ze strony podstawno-bocznej na wierzchołkową. Uzyskano wyniki, które wskazują na znaczny wzrost liczby migrujących neutrofili trans nabłonkowych obserwowany w odpowiedzi na zakażone monowarstwy nabłonka w oparciu o ilościowe oznaczanie peroksydazy mielo z migrujących neutrofili. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ manewr odwróconego filtra transwell w celu wzrostu i infekowania barier nabłonkowych jest niekonwencjonalny i dlatego może być mniej dostępny dla nieznanych grup badawczych do ustalenia w swoim laboratorium.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób zapalnych dróg oddechowych obejmujących infekcje, takich jak zapalenie płuc lub mukowiscydoza, ponieważ można opracować i przetestować nowe metody leczenia w celu zmniejszenia ilości migracji nabłonka trans neutrofili, co może złagodzić szkodliwe skutki nadgorliwego neutrofilu, naruszenia bariery śluzowej. Wraz z Markiem, który jest pracownikiem klinicznym w moim laboratorium, procedurę zademonstrują starszy technik Wahi Preza i adiunkt Michael Pesos. Aby rozpocząć, usuń obszar wzrostu o powierzchni 0,33 centymetra kwadratowego, Transwells o wielkości porów trzech mikrometrów z opakowania i umieść 24-dołkową płytkę zawierającą 12 transwelli do góry nogami wewnątrz kaptura.

Podnieś dolną płytę i odłóż na bok. Transwelle będą teraz odwrócone do góry nogami. Spoczywając na pokrywie płomienia z 24 dołkami, hemostat dla sterylności i pozostaw do ostygnięcia.

Używając sterylnych transwelli do przenoszenia hemostatu na szalkę Petriego o wymiarach 150 na 25 milimetrów, utrzymując je w pozycji odwróconej, odpipetować 70 mikrolitrów przygotowanego roztworu kolagenu w etanolu o stężeniu 30 mikrogramów na mililitr na membranę filtracyjną każdej odwróconej powierzchni transwella Napięcie powinno utrzymywać tę objętość roztworu na miejscu, ponieważ wokół membrany filtracyjnej nie ma ścianek podczas uzyskiwania dostępu do powierzchni spodu. Należy uważać, aby roztwór kolagenu nie spływał po boku transwell i unikać przesuwania transwelli podczas procedury powlekania. Pozostaw pokrywkę szalki Petriego zdjętą na co najmniej cztery godziny, aby etanol mógł odparować, aby zachować sterylność podczas tego procesu.

Utrzymuj wentylator okapu i światło ultrafioletowe włączone po zapakowaniu komórek nabłonka, jak opisano w protokole tekstowym. Dodaj 70 mikrolitrów roztworu komórek zawieszonych Resus z 15-mililitrowej probówki do każdego transwella pokrytego odwróconym kolagenem. Wymieszaj zawiesinę komórkową, delikatnie odwracając probówkę od czasu do czasu, aby zapobiec osadzaniu się komórek na dnie 15-mililitrowej probówki podczas wysiewania transwells.

Gdy wszystkie odwrócone transwelle zostaną zasiane komórkami nabłonka, załóż pokrywę szalki Petriego i ostrożnie umieść komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych następnego dnia. Dodaj jeden mililitr pożywki do każdej studzienki oryginalnej sterylnej płytki 24-dołkowej i użyj wysterylizowanego hemostatu, aby przewrócić każdą odwróconą studzienkę trans do każdej studzienki zawierającej jeden mililitr pożywki. Dodaj 0,2 mililitra pożywki do górnej komory każdej studzienki trans i wróć do inkubatora do hodowli tkankowych.

Usunąć z inkubatora 24-dołkową płytkę podtrzymującą warstwy nabłonka, które były hodowane na spodniej stronie membran filtracyjnych Transwell przez co najmniej osiem dni. Chwyć krawędź każdej studzienki trans hemostatem i wyjmij ją z płytki 24-dołkowej. Odwróć transwell nad wiadrem na odpady, aby wyrzucić pożywkę hodowlaną z wewnętrznej komory Transwell.

Zanurz każdy transwell w zlewce do płukania zawierającej zrównoważony roztwór soli Hanka z wapniem i magnezem lub Hank's Plus, aby wypełnić wewnętrzną komorę Transwell. Następnie wylej płyn z komory wewnętrznej do wiadra na odpady. Powtórz ten krok przez sekundę.

Umyj w Hank's plus po dwóch praniach. Umieść Transwells w nowej 24-dołkowej płytce zawierającej jeden mililitr Hank's Plus. W każdej studzience obserwuj górną komorę każdej transwell, aby ocenić integralność warstwy komórek nabłonka.

Hank's Plus nie powinien przeciekać i wypełniać górnej komory Transwell po umieszczeniu w studzience 24-dołkowej płytki zawierającej jeden mililitr Hank's Plus. Po dokładnym przyjrzeniu się każdemu transwellowi dodaj 0,2 mililitra Hanks Plus do górnej komory. Umieścić płytkę w inkubatorze na 30 do 60 minut, aby zrównoważyć warstwy komórek nabłonka w celu przeprowadzenia testu migracji nabłonka trans neutrofili

Chwyć każdą transwell hemostatem z 24-dołkowej płytki Wash Transwells zrównoważonych w Hank's Plus i wylej płyn z górnej studzienki do wiadra na odpady. Umieść każdą transwell do góry nogami na szalce Petriego o wymiarach 150 na 25 milimetrów do sześciu odwróconych transwelli. Dodaj 25 mikrolitrów Hanksa plus do trzech odwróconych transwelli.

Zainfekować komórki 25 mikrolitrami Pseudomonas, arosa lub Pao, jednym rozcieńczonym w Hanks plus przygotowanym zgodnie z opisem w protokole tekstowym do ostatnich trzech Odwróconych transwelli zainfekować komórki 25 mikrolitrami e Coli, K 12 lub mc 1000 rozcieńczonych w Hanks Plus również przygotowanych zgodnie z opisem w protokole tekstowym po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnej komorze przez 60 minut. Umyj transwelle, chwytając hemostatem i przewracając je z powrotem do 24-dołkowej płytki myjącej, która zawiera jeden mililitr plusa Hanka. W dolnych komorach.

Dodaj 0,2 mililitra plusa Hanka do górnych komór. Chwyć Transwell hemostatem i wyjmij go z pierwszej płyty myjącej. Wylej płyn z górnej komory do wiadra na odpady.

Przed umieszczeniem Transwells w drugiej 24-dołkowej płycie myjącej zawierającej jeden mililitr Hanksa plus dodaj 0,2 mililitra Hanksa plus do górnej komory. Powtórz ten krok jeszcze raz, w sumie trzy prania. Po trzecim płukaniu wyrzuć płyn z górnych komór basenek trans do wiadra na odpady za pomocą hemostatu umieść trzy niezainfekowane dołki trans do trzech dołków 24-dołkowej płytki migracyjnej zawierającej jeden mililitr Hanks Plus, która reprezentuje pipetę kontroli ujemnej 10 mikrolitrów 10 mikromolowego roztworu FMLP do każdej z trzech studzienek 24-dołkowej płytki migracyjnej zawierającej jeden mililitr Hanksa dodatkowo umieścić trzy z niezakażonych dołków trans w trzech dołkach 24-dołkowej płytki migracyjnej zawierającej 100 nanomolowych FMLP, co stanowi pozytywną kontrolę zdolności izolowanych neutrofili do migracji.

Następnie umieść trzy dołki trans zakażone PAO, jedną i trzy studzienki trans zakażone mc 1000 w trzech odpowiednich dołkach 24-dołkowej płytki migracyjnej zawierającej jeden mililitr Hanksa plus dodaj 0,1 mililitra Hanksa plus do górnej komory każdej studni trans na wierzchu 0,1 mililitra Hanksa plus w każdym trans. Dobrze ostrożnie dodać 20 mikrolitrów zawiesiny neutrofili przygotowanej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Inkubować przez dwie godziny, aby umożliwić trans-nabłonkową migrację neutrofili.

Po dwóch godzinach migracji podnieś transwelle, chwytając je hemostatem i delikatnie postukaj w wewnętrzne ścianki 24-dołkowej płyty migracyjnej. Przed odrzuceniem dołków trans należy ocenić migrację neutrofili w studzienkach, oglądając dołki 24-dołkowej płytki migracyjnej pod mikroskopem odwróconym przy użyciu obiektywu 10x. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 10% Triton X 100 do każdej studzienki użytej w 24-dołkowej płytce migracyjnej, każdego wzorca i ślepej próby.

Obróć 24-dołkowe wzorce płytek migracyjnych i wypustowuj je z niską prędkością przez 20 minut. W czterech stopniach Celsjusza. Dodaj 50 mikrolitrów buforu cytrynianowego.

Po dwa w każdym dołku użyto w 24-dołkowej płytce migracyjnej do każdego wzorca i dokładnie do ślepej próby. Dobrze wymieszać zawartość każdej próbki, pipetując roztwór w górę i w dół co najmniej pięć razy. Następnie przenieś 100 mikrolitrów z każdej studzienki na próbkę w dwóch egzemplarzach do 96-dołkowej płytki, 100 mikrolitrów każdego wzorca i ślepą próbę na 96-dołkową płytkę.

Po wymieszaniu dodaj 50 mikrolitrów 30% nadtlenku wodoru do roztworu A BTS i wiruj. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu substratu BTS do każdej próbki. Na płytce 96-dołkowej pozwól płytki rozwinąć się przez pięć do 10 minut w ciemności.

Obserwuj rozwój zielonego koloru w dołkach płytki zawierającej neutrofile lizy przed odczytem na długości fali 405 nanometrów. Za pomocą czytnika mikropłytek do oceny migracji neutrofili trans neutrofilów, które w pełni migrowały przez warstwę nabłonka do komory wierzchołkowej, można obejrzeć w dolnej studzience 24-dołkowej płytki migracyjnej, jak to pokazano tutaj za pomocą mikroskopu światła odwróconego. Zaobserwowano, że bardzo niewiele neutrofili migruje przez niezakażoną warstwę nabłonka bez narzuconego gradientu chemotaktycznego i reprezentuje poziomy tła w teście.

W przeciwieństwie do tego, obfitość neutrofili transmi była widoczna, gdy zapewniono gradient FMLP. Zakażenie nabłonka niepatogennym E. coli mc 1000 skutkowało niewielką liczbą widocznych neutrofili migrujących trans, podczas gdy wiele neutrofili migrujących trans można było zaobserwować, gdy warstwy nabłonka były zakażone patogennym dla płuc Pseudomonas aerogen. Neutrofile, które migrowały w eksperymencie, są oznaczane ilościowo, mierząc ich aktywność peroksydazy mielologicznej.

Liczba granulocytów obojętnochłonnych dodatnio koreluje z wielkością aktywności peroksydazy mierzoną po lizie neutrofili o wartościach wykazujących liniową zależność w zakresie liczby neutrofili wybranych do krzywej wzorcowej. Znaczna liczba neutrofili migruje przez warstwy nabłonka w odpowiedzi na gradient FMLP dostarczony przez A lub w odpowiedzi na warstwę nabłonkową zakażoną PAO. Liczba neutrofili, które migrują przy braku bodźców lub po zakażeniu nabłonka wierzchołkowego niepatogennym E. coli mc 1000, jest poniżej granicy wykrywalności dla testu.

Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu pięciu godzin w celu pokrycia kolagenem i zasiania komórek nabłonka na filtrach transwell, a następnie co najmniej tygodnia, aby umożliwić wzrost komórek nabłonka. Gdy monowarstwy nabłonka są gotowe. Test migracji można przeprowadzić w ciągu pięciu godzin, łącznie z izolacją neutrofili i przygotowaniem bakterii, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przygotowaniu filtrów transwell w sterylnych warunkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Procedurę tę można dostosować, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z tym procesem zapalnym. Można przeprowadzić analizę migrowanych komórek, nabłonka, leżącego na wznak, a nawet patogenu.