Name: Metody in vitro Test kokultury w celu oceny migracji transnabłonkowej neutrofili indukowanej patogenem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Poznaj metodę in vitro oceny migracji neutrofili przez nabłonek w odpowiedzi na zakażenie bakteryjne. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów immunologicznych w tkankach śluzowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana finansowo przez NIH (1 R01 AI095338-01A1).

<ol><li>Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+structural+features+that+influence+neutrophil+emigration+into+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung.</a> Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+defense+systems+protect+against+bacterial+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gastroenterol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats.</a> Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial-induced+hepoxilin+A3+secretion+as+a+pro-inflammatory+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator.</a> FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).</li>
<li>Mumy, K. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophils+in+the+event+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).</li>
<li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration%3A+implications+in+mediating+epithelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li>
<li>Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradox+of+the+neutrophil%27s+role+in+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">The paradox of the neutrophil's role in tissue injury.</a> J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).</li>
<li>Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+destruction+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue destruction by neutrophils.</a> N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).</li>
<li>Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga+toxin+translocation+across+intestinal+epithelial+cells+is+enhanced+by+neutrophil+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration.</a> Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).</li>
<li>Kohler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+regulates+intercellular+junction+proteins+and+facilitates+transepithelial+neutrophil+and+bacterial+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).</li>
<li>Gane, J., Stockley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transmigration+across+the+vascular+endothelium+in+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD.</a> Thorax. 67, 553-561 (2012).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol. Med. 17, 293-307 (2011).</li>
<li>Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophilic+inflammation+in+severe+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Arch.+Allergy+Immunol.%22%5BJournal%5D)">Neutrophilic inflammation in severe asthma.</a> Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).</li>
<li>Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neutrophil+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neutrophil transendothelial migration.</a> Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).</li>
<li>Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+to+investigate+neutrophil+adhesion+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).</li>
<li>Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+to+the+lungs+during+bacterial+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia.</a> Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).</li>
<li>Hurley, B. P., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+tissue+culture+results+into+animal+models%3A+the+case+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium.</a> Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).</li>
<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+cell+transmigration+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+requires+the+eicosanoid+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+attachment+to+human+intestinal+epithelial+monolayers%3A+transcellular+signalling+to+subepithelial+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils.</a> J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).</li>
<li>McCormick, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+attachment+of+Salmonella+typhimurium+to+intestinal+epithelia+imprints+the+subepithelial+matrix+with+gradients+chemotactic+for+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils.</a> J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).</li>
<li>Mrsny, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hepoxilin+A3+in+inflammatory+events%3A+a+required+role+in+neutrophil+migration+across+intestinal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).</li>
<li>Tamang, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepoxilin+A%283%29+facilitates+neutrophilic+breach+of+lipoxygenase-expressing+airway+epithelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers.</a> J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).</li>
<li>McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+secretion+of+a+pathogen-elicited+epithelial+chemoattractant+activity+in+response+to+surface+colonization+of+intestinal+epithelia+by+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium.</a> J. Immunol. 160, 455-466 (1998).</li>
<li>Boll, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroaggregative+Escherichia+coli+promotes+transepithelial+migration+of+neutrophils+through+a+conserved+12-lipoxygenase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway.</a> Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).</li>
<li>Hurley, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-component+sensor+response+regulator+RoxS%2FRoxR+plays+a+role+in+Pseudomonas+aeruginosa+interactions+with+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells.</a> Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).</li>
<li>Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-mediated+PMN+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).</li>
<li>McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+the+Shigella+flexneri+virulence+plasmid+in+the+ability+to+induce+trafficking+of+neutrophils+across+polarized+monolayers+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium.</a> Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).</li>
<li>Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+a+noninvasive+enteric+pathogen%2C+enteropathogenic+Escherichia+coli%2C+to+cultured+human+intestinal+epithelial+monolayers+induces+transmigration+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils.</a> Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).</li>
<li>Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERM+protein%2C+ezrin%2C+regulates+neutrophil+transmigration+by+modulating+the+apical+localization+of+MRP2+in+response+to+the+SipA+effector+protein+during+Salmonella+typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).</li>
<li>Pazos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance-associated+transporter+2+regulates+mucosal+inflammation+by+facilitating+the+synthesis+of+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
<li>Bhowmick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Disease+during+Streptococcus+pneumoniae+Acute+Lung+Infection+Requires+12-Lipoxygenase-Dependent+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation.</a> J. Immunol. , (2013).</li>
<li>Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+eicosanoid-generating+capacity+of+cytoplasmic+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).</li>
<li>Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+involved+in+hepoxilin+A3-mediated+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration.</a> Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).</li>
<li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+Topic+on+Pseudomonas+aeruginosa%2C+Biology%2C+Genetics%2C+and+Host-Pathogen+Interactions.%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.</a> Front. Microbiol. 3, 20 (2012).</li>
<li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+infections+associated+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lung infections associated with cystic fibrosis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).</li>
<li>Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa-mediated+damage+requires+distinct+receptors+at+the+apical+and+basolateral+surfaces+of+the+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium.</a> Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).</li>
<li>Kierbel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exploits+a+PIP3-dependent+pathway+to+transform+apical+into+basolateral+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).</li>
<li>Lee, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Salmonella+protein+induces+a+proinflammatory+response+in+epithelial+cells%2C+which+promotes+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).</li>
<li>Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+flexneri+type+III+secretion+system+effectors+OspB+and+OspF+target+the+nucleus+to+downregulate+the+host+inflammatory+response+via+interactions+with+retinoblastoma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein.</a> Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).</li>
<li>Brazil, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+across+intestinal+epithelium%3A+evidence+for+a+role+of+CD44+in+regulating+detachment+of+migrating+cells+from+the+luminal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface.</a> J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).</li>
<li>Lawrence, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiadhesive+role+of+apical+decay-accelerating+factor+%28CD55%29+in+human+neutrophil+transmigration+across+mucosal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia.</a> J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).</li>
<li>Hodges, K., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+communication+in+the+gut%2C+from+bacterial+delivery+to+host-cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response.</a> J. Physiol. 590, 433-440 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Migracja neutrofili przez powierzchnie nabłonka błony śluzowej jest powszechną cechą patologii choroby po zakażeniu patogenami bakteryjnymi3. Opisana w niniejszym dokumencie metodologia oferuje szybkie, proste podejście do eksperymentalnego wyizolowania tego dyskretnego zdarzenia przy użyciu systemu testów kokultury in vitro pochodzących z komórek ludzkich, który modeluje cechę procesu zapalnego wywołanego przez infekcje bakteryjne. System ten został pierwotnie opracowany przy użyciu spolaryzowanych k...

Powierzchnie błony śluzowej służą jako fizyczne i immunologiczne bariery, zapewniając ochronę przed zewnętrznymi zagrożeniami wszechobecnymi w środowisku1,2. Ta ochronna bariera nabłonkowa może zostać naruszona, gdy organizmy chorobotwórcze zaatakują2. W przypadku patogenu bakteryjnego, to spotkanie często inicjuje proces zapalny poprzez aktywację wrodzonego układu odpornościowego i wyzwalanie szybkiej mobilizacji granulocytów pierwszej pomocy, znanych jako Neutrofile2-4. Czynniki chemotaktyczne ułatwiające rekrutację neutrofili są wytwarzane częściowo przez komórki nabłonka błony śluzowej, które starają się pozbyć gospodarza szkodliwego patogenu2-4. Nadmierny lub nierozwiązany naciek neutrofili na powierzchni nabłonka błony śluzowej może powodować znaczną patologię1,5. Jest to konsekwencja niespecyficznego uszkodzenia tkanek spowodowanego przez przeciwbakteryjny arsenał neutrofili5-7. W takich przypadkach zdolność usuwania neutrofili przez bakterie jest przyćmiona przez zniszczenie tkanki gospodarza podczas zakażenia. Zakłócenie funkcji ochronnej bariery nabłonkowej może prowadzić do zwiększonego narażenia tkanki leżącej poniżej na mikroorganizmy i/lub toksyny, co jeszcze bardziej zaostrza patologię choroby8,9. Konsekwencje te można zaobserwować w wielu układach narządowych, w tym w płucach i przewodzie pokarmowym1,5. Ponadto niezakaźne stany zapalne, takie jak ciężkie napady astmy, przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) i nieswoiste zapalenie jelit (IBD) charakteryzują się patologicznym naruszeniem bariery nabłonkowej błony śluzowej przez nadmierną odpowiedź neutrofilową4,5,10-12.
Złożony proces rekrutacji neutrofili po infekcji błony śluzowej składa się z kilku etapów podzielonych na przedziały1,5,13,14. Po pierwsze, neutrofile muszą opuścić krążenie poprzez szereg interakcji międzykomórkowych, które ułatwiają migrację międzybłonkową1,13. Neutrofile następnie nawigują po istniejącej przestrzeni śródmiąższowej zawierającej macierz zewnątrzkomórkową1,14. Aby dotrzeć do światła zakażonej błony śluzowej, neutrofile muszą następnie migrować przez barierę nabłonkową1,4,5. To skomplikowane, wieloetapowe zjawisko jest często badane zbiorczo przy użyciu zwierzęcych modeli infekcji in vivo 15. Takie modele są przydatne do ustalenia konieczności istnienia określonych czynników, takich jak chemokiny, cząsteczki adhezyjne lub szlaki sygnałowe, które uczestniczą w całym procesie, ale są w dużej mierze nieodpowiednie do rozwiązywania molekularnych Wkłady krytyczne dla każdego odrębnego kroku z podziałem na przedziały16. Szczególnie przydatne w tym zakresie okazały się systemy kohodowlane in vitro modelujące transśródbłonkową, trans-macierzową lub trans-nabłonkową migrację neutrofili1,14,16,17. 
Solidny system testów kokulturowych został opracowany w celu rozszyfrowania mechanizmów odpowiedzialnych za migrację międzynabłonkową neutrofili w odpowiedzi na patogenną infekcję18-22. Model ten polega na zainfekowaniu powierzchni wierzchołkowej spolaryzowanych warstw ludzkich komórek nabłonkowych patogenem bakteryjnym, a następnie zastosowaniu świeżo wyizolowanych ludzkich neutrofili na powierzchni podstawno-bocznej18-22. Neutrofile migrują przez barierę nabłonkową w odpowiedzi na produkty chemotaktyczne pochodzenia nabłonkowego wydzielane po infekcji patogennej18,21-23. Ten system modelowy został zastosowany przy użyciu kultur nabłonka jelit i płuc wystawionych na działanie odpowiednich patogenów bakteryjnych specyficznych dla tkanek i ujawnił nowe mechanizmy molekularne, które mogą być ważne dla procesu rekrutacji neutrofili podczas infekcji błony śluzowej3,8,19,24-28. Siła tego Model kokultury in vitro polega na tym, że podejście redukcjonistyczne umożliwia badaczowi eksperymentalne manipulowanie patogenem, barierą nabłonkową i/lub neutrofilami w dobrze kontrolowanym, wysoce powtarzalnym i dość niedrogim systemie. Wgląd uzyskany dzięki temu podejściu można skutecznie wykorzystać do przeprowadzenia ukierunkowanej analizy zdarzeń przedziałowych podczas rekrutacji neutrofili przy użyciu modeli infekcji in vivo 22,29,30.
Ten artykuł pokazuje wiele kroków niezbędnych do pomyślnego ustanowienia tego powtarzalnego modelu do badania migracji trans-nabłonkowej neutrofili indukowanej przez patogeny. Bariery nabłonkowe płuc zakażone patogenem Pseudomonas aeruginosa są opisane w tym artykule; jednak inne nabłonki tkankowe i patogeny mogą być zastąpione niewielkimi modyfikacjami. Wysiew i hodowla spolaryzowanych warstw komórek nabłonka płuc na odwróconym Pokryte kolagenem przepuszczalne filtry Transwell są szczegółowo opisane w niniejszym dokumencie, podobnie jak wzrost patogennego P. aeruginosa i izolacja neutrofili z krwi pełnej. Przedstawiono sposób łączenia tych składników w celu obserwacji migracji przeznabłonkowej neutrofili indukowanej przez patogen wraz z odpowiednimi kontrolami pozytywnymi i ujemnymi w celu ustalenia powtarzalnego testu. Wszechstronność tego podejścia do badania różnych aspektów migracji przeznabłonkowej neutrofili indukowanej patogenem jest omawiany w odniesieniu do konkretnych badań w literaturze.

<table><tbody><tr><td>Komórki NCl-H292</td><td>ATCC</td><td>CRL-1848</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 podłoże</td><td>ATCC</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa PAO1</td><td>ATCC</td><td>#47085</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MC1000</td><td>ATCC</td><td>#39531</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) płyn</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td>bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>10% dodana do pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100x: 10 000 jednostek penicyliny i 10 000 &mikro; g streptomycyny na ml.</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>50 ml porcji są przechowywane w stanie zamrożonym w temperaturze -20 &ordm;C.&nbsp; Używana porcja może być przechowywana w 4 &ordm; C krótkoterminowe.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka - HBSS(-)</td><td>Invitrogen</td><td>14175-079</td><td>Sterylny, bez wapnia i magnezu</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061.</td><td>Zapas = 0,4%</td></tr><tr><td>Kolagen, ogon szczura</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>Można go również wyizolować w laboratorium bezpośrednio z ogonów szczurów przy użyciu standardowych protokołów</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909-500G</td><td>Składnik 1 M buforu cytrynianowego i roztworu kwaśnej dekstrozy cytrynianu (ACD)</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td>Składnik 1 M buforu cytrynianowego</td></tr><tr><td>Dekstroza bezwodna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8066-250G</td><td>Składnik roztworu kwaśnej dekstrozy cytrynianowej (ACD)</td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213330-500G</td><td>Składnik buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC)</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td>Składnik buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td>Składnik buforu do lizy czerwonych krwinek (RBC)</td></tr><tr><td>HBSS(+) proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387-10L</td><td>Kluczowy składnik HBSS+</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>Składnik HBSS+</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td>Postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy, aby pokryć szklane końcówki do pipet</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2,2'-Azino-bis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowy) Sól diamonowa (ABTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9941-50TAB</td><td>Kluczowy składnik roztworu substratu ABTS</td></tr><tr><td>30% roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>Składnik roztworu substratu ABTS</td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP lub fMLF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-3506</td><td>Należy przygotować roztwór podstawowy 10 mM w DMSO i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 ‰C.</td></tr><tr><td>Żelatyna Typ B</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-12026</td><td></td></tr><tr><td>Agar do izolacji Pseudomonas&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0927-17-1</td><td>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta s instrukcja wykonania płytek PIA</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-749</td><td>Opcjonalnie, może poprawić czystość neutrofili</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka migracyjna</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3524</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka myjąca</td><td>Falcon</td><td>35-1147</td><td>Może być ponownie użyta, jeśli zostanie namoczona w 70% etanolu i dokładnie umyta przed ponownym użyciem</td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12565501</td><td></td></tr><tr><td>Przepuszczalne podpory Transwell&nbsp;</td><td>Corning Incorporated</td><td>#3415</td><td>Poliwęglan; Średnica: 6,5 mm; Obszar wzrostu: 0,33 cm2; Rodzaj dania: talerz 24-dołkowy; Wielkość porów: 3,0 i mikro; m</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Sokół</td><td>35-1013</td><td>Każda szalka Petriego zawiera 24 odwrócone 0,33 cm2 Transwells.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>500 ml 0,2 &mu; m filtr / kolba</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25A</td><td>Do sterylizacji roztworu dekstrozy cytrynianu kwasu (ACD)</td></tr><tr><td>5-3/4 w szklanym Pipeta Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>Pokryj końcówki Sigmacote przed użyciem</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td>Zakrzywiony, ząbkowany</td></tr><tr><td>mikroskop odwrócony z inwertoskopu</td><td>Zeiss</td><td>#342222</td><td></td></tr><tr><td>Versa-Max Czytnik mikropłytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>#432789</td><td></td></tr></tbody></table>

metody in vitro test kokultury w celu oceny migracji transnabłonkowej neutrofili indukowanej patogenem

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Powierzchnie błony śluzowej służą jako bariery ochronne przed organizmami chorobotwórczymi. Wrodzone reakcje immunologiczne są aktywowane po wykryciu patogenu, co prowadzi do infiltracji tkanek migrującymi komórkami zapalnymi, głównie neutrofilami. Proces ten może być destrukcyjny dla tkanek, jeśli jest nadmierny lub utrzymywany w stanie nierozwiązanym. Hodowla in vitro Modele mogą być wykorzystywane do badania unikalnych mechanizmów molekularnych zaangażowanych w indukowaną przez patogeny migrację przebłonkową neutrofili. Ten typ modelu zapewnia wszechstronność w projektowaniu eksperymentalnym z możliwością kontrolowanej manipulacji patogenem, barierą nabłonkową lub neutrofilami. Chorobotwórcze zakażenie powierzchni wierzchołkowej spolaryzowanych monowarstw nabłonka wyhodowanych na przepuszczalnych filtrach transwell wywołuje fizjologicznie istotne transnabłonki podstawno-bocznego do wierzchołkowego migracja neutrofili zastosowana do powierzchni podstawno-bocznej. Opisany tutaj model in vitro demonstruje wiele etapów niezbędnych do wykazania migracji neutrofili przez spolaryzowaną monowarstwę nabłonka płuc, która została zakażona patogennym P. aeruginosa (PAO1). Opisano wysiew i hodowlę przepuszczalnych transwelli z ludzkimi komórkami nabłonka płuc, wraz z izolacją neutrofili z pełnej krwi ludzkiej i hodowlą PAO1 i niepatogenny K12 E. coli (MC1000). Proces emigracji i analiza ilościowa pomyślnie migrowanych neutrofili, które zostały zmobilizowane w odpowiedzi na zakażenie patogenne, przedstawiono za pomocą reprezentatywnych danych, w tym kontroli dodatnich i ujemnych. Ten system modelowy in vitro może być manipulowany i stosowany na innych powierzchniach błony śluzowej. Reakcje zapalne, które obejmują nadmierny naciek neutrofili, mogą być destrukcyjne dla tkanek gospodarza i mogą wystąpić przy braku zakażeń chorobotwórczych. Lepsze zrozumienie mechanizmów molekularnych, które sprzyjają migracji przebłonkowej neutrofili poprzez eksperymentalną manipulację opisanego w niniejszym dokumencie systemu testów kokultury in vitro, ma znaczący potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych dla szeregu chorób zakaźnych i zapalnych błony śluzowej.

Wiele badań wykazało, że warstwy nabłonkowe zainfekowane patogenami ułatwiają transnabłonkową migrację neutrofili3,8,19,24-28,31,32. Dzieje się to poprzez specyficzne dla danego patogenu indukowanie gradientu chemotaktycznego neutrofili pochodzącego z komórek nabłonkowych3,23. Na przykład patogenny P. aeruginosa wchodzący w interakcję z powierzchnią apikalną komórek nabłonka płuc powoduje migrację znacznej liczby neutrofili przez warstwę nabłonkową18,22,25,26,33,34. Ten istotny k...

Migracja trans-nabłonkowa neutrofili w odpowiedzi na infekcję bakteryjną błony śluzowej przyczynia się do uszkodzenia nabłonka i choroby klinicznej. Opracowano model in vitro, który łączy patogen, ludzkie neutrofile i spolaryzowane warstwy ludzkich komórek nabłonkowych hodowanych na filtrach transwell, aby ułatwić badania nad rozwikłaniem mechanizmów molekularnych kierujących tym zjawiskiem.

Metody in vitro Test kokultury w celu oceny migracji transnabłonkowej neutrofili indukowanej patogenem

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest określenie liczby neutrofili, które przekroczyły monowarstwę komórek nabłonka w odpowiedzi na infekcję. Osiąga się to poprzez kodowanie kolagenu transwelli przed staranną hodowlą monowarstw komórek nabłonka za pomocą manewru odwróconego filtra transwellowego. W drugim etapie hoduje się patogen bakteryjny w celu zainfekowania wierzchołkowej powierzchni monowarstwy nabłonka wyhodowanej na filtrach transwell, co powoduje, że komórki nabłonka wytwarzają endogenne atraktanty chemochłonne neutrofili.Następnie neutrofile wyizolowane z krwi pełnej dodaje się do podstawno-bocznej strony zakażonych monowarstw nabłonka wyhodowanych na filtrach transwell w celu oznaczenia migracji neutrofili ze strony podstawno-bocznej na wierzchołkową. Uzyskano wyniki, które wskazują na znaczny wzrost liczby migrujących neutrofili trans nabłonkowych obserwowany w odpowiedzi na zakażone monowarstwy nabłonka w oparciu o ilościowe oznaczanie peroksydazy mielo z migrujących neutrofili. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ manewr odwróconego filtra transwell w celu wzrostu i infekowania barier nabłonkowych jest niekonwencjonalny i dlatego może być mniej dostępny dla nieznanych grup badawczych do ustalenia w swoim laboratorium.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób zapalnych dróg oddechowych obejmujących infekcje, takich jak zapalenie płuc lub mukowiscydoza, ponieważ można opracować i przetestować nowe metody leczenia w celu zmniejszenia ilości migracji nabłonka trans neutrofili, co może złagodzić szkodliwe skutki nadgorliwego neutrofilu, naruszenia bariery śluzowej. Wraz z Markiem, który jest pracownikiem klinicznym w moim laboratorium, procedurę zademonstrują starszy technik Wahi Preza i adiunkt Michael Pesos. Aby rozpocząć, usuń obszar wzrostu o powierzchni 0,33 centymetra kwadratowego, Transwells o wielkości porów trzech mikrometrów z opakowania i umieść 24-dołkową płytkę zawierającą 12 transwelli do góry nogami wewnątrz kaptura.Podnieś dolną płytę i odłóż na bok. Transwelle będą teraz odwrócone do góry nogami. Spoczywając na pokrywie płomienia z 24 dołkami, hemostat dla sterylności i pozostaw do ostygnięcia.Używając sterylnych transwelli do przenoszenia hemostatu na szalkę Petriego o wymiarach 150 na 25 milimetrów, utrzymując je w pozycji odwróconej, odpipetować 70 mikrolitrów przygotowanego roztworu kolagenu w etanolu o stężeniu 30 mikrogramów na mililitr na membranę filtracyjną każdej odwróconej powierzchni transwella Napięcie powinno utrzymywać tę objętość roztworu na miejscu, ponieważ wokół membrany filtracyjnej nie ma ścianek podczas uzyskiwania dostępu do powierzchni spodu. Należy uważać, aby roztwór kolagenu nie spływał po boku transwell i unikać przesuwania transwelli podczas procedury powlekania. Pozostaw pokrywkę szalki Petriego zdjętą na co najmniej cztery godziny, aby etanol mógł odparować, aby zachować sterylność podczas tego procesu.Utrzymuj wentylator okapu i światło ultrafioletowe włączone po zapakowaniu komórek nabłonka, jak opisano w protokole tekstowym. Dodaj 70 mikrolitrów roztworu komórek zawieszonych Resus z 15-mililitrowej probówki do każdego transwella pokrytego odwróconym kolagenem. Wymieszaj zawiesinę komórkową, delikatnie odwracając probówkę od czasu do czasu, aby zapobiec osadzaniu się komórek na dnie 15-mililitrowej probówki podczas wysiewania transwells.Gdy wszystkie odwrócone transwelle zostaną zasiane komórkami nabłonka, załóż pokrywę szalki Petriego i ostrożnie umieść komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych następnego dnia. Dodaj jeden mililitr pożywki do każdej studzienki oryginalnej sterylnej płytki 24-dołkowej i użyj wysterylizowanego hemostatu, aby przewrócić każdą odwróconą studzienkę trans do każdej studzienki zawierającej jeden mililitr pożywki. Dodaj 0,2 mililitra pożywki do górnej komory każdej studzienki trans i wróć do inkubatora do hodowli tkankowych.Usunąć z inkubatora 24-dołkową płytkę podtrzymującą warstwy nabłonka, które były hodowane na spodniej stronie membran filtracyjnych Transwell przez co najmniej osiem dni. Chwyć krawędź każdej studzienki trans hemostatem i wyjmij ją z płytki 24-dołkowej. Odwróć transwell nad wiadrem na odpady, aby wyrzucić pożywkę hodowlaną z wewnętrznej komory Transwell.Zanurz każdy transwell w zlewce do płukania zawierającej zrównoważony roztwór soli Hanka z wapniem i magnezem lub Hank's Plus, aby wypełnić wewnętrzną komorę Transwell. Następnie wylej płyn z komory wewnętrznej do wiadra na odpady. Powtórz ten krok przez sekundę.Umyj w Hank's plus po dwóch praniach. Umieść Transwells w nowej 24-dołkowej płytce zawierającej jeden mililitr Hank's Plus. W każdej studzience obserwuj górną komorę każdej transwell, aby ocenić integralność warstwy komórek nabłonka.Hank's Plus nie powinien przeciekać i wypełniać górnej komory Transwell po umieszczeniu w studzience 24-dołkowej płytki zawierającej jeden mililitr Hank's Plus. Po dokładnym przyjrzeniu się każdemu transwellowi dodaj 0,2 mililitra Hanks Plus do górnej komory. Umieścić płytkę w inkubatorze na 30 do 60 minut, aby zrównoważyć warstwy komórek nabłonka w celu przeprowadzenia testu migracji nabłonka trans neutrofili.Chwyć każdą transwell hemostatem z 24-dołkowej płytki Wash Transwells zrównoważonych w Hank's Plus i wylej płyn z górnej studzienki do wiadra na odpady. Umieść każdą transwell do góry nogami na szalce Petriego o wymiarach 150 na 25 milimetrów do sześciu odwróconych transwelli. Dodaj 25 mikrolitrów Hanksa plus do trzech odwróconych transwelli.Zainfekować komórki 25 mikrolitrami Pseudomonas, arosa lub Pao, jednym rozcieńczonym w Hanks plus przygotowanym zgodnie z opisem w protokole tekstowym do ostatnich trzech Odwróconych transwelli zainfekować komórki 25 mikrolitrami e Coli, K 12 lub mc 1000 rozcieńczonych w Hanks Plus również przygotowanych zgodnie z opisem w protokole tekstowym po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wilgotnej komorze przez 60 minut. Umyj transwelle, chwytając hemostatem i przewracając je z powrotem do 24-dołkowej płytki myjącej, która zawiera jeden mililitr plusa Hanka. W dolnych komorach.Dodaj 0,2 mililitra plusa Hanka do górnych komór. Chwyć Transwell hemostatem i wyjmij go z pierwszej płyty myjącej. Wylej płyn z górnej komory do wiadra na odpady.Przed umieszczeniem Transwells w drugiej 24-dołkowej płycie myjącej zawierającej jeden mililitr Hanksa plus dodaj 0,2 mililitra Hanksa plus do górnej komory. Powtórz ten krok jeszcze raz, w sumie trzy prania. Po trzecim płukaniu wyrzuć płyn z górnych komór basenek trans do wiadra na odpady za pomocą hemostatu umieść trzy niezainfekowane dołki trans do trzech dołków 24-dołkowej płytki migracyjnej zawierającej jeden mililitr Hanks Plus, która reprezentuje pipetę kontroli ujemnej 10 mikrolitrów 10 mikromolowego roztworu FMLP do każdej z trzech studzienek 24-dołkowej płytki migracyjnej zawierającej jeden mililitr Hanksa dodatkowo umieścić trzy z niezakażonych dołków trans w trzech dołkach 24-dołkowej płytki migracyjnej zawierającej 100 nanomolowych FMLP, co stanowi pozytywną kontrolę zdolności izolowanych neutrofili do migracji.Następnie umieść trzy dołki trans zakażone PAO, jedną i trzy studzienki trans zakażone mc 1000 w trzech odpowiednich dołkach 24-dołkowej płytki migracyjnej zawierającej jeden mililitr Hanksa plus dodaj 0,1 mililitra Hanksa plus do górnej komory każdej studni trans na wierzchu 0,1 mililitra Hanksa plus w każdym trans. Dobrze ostrożnie dodać 20 mikrolitrów zawiesiny neutrofili przygotowanej zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Inkubować przez dwie godziny, aby umożliwić trans-nabłonkową migrację neutrofili.Po dwóch godzinach migracji podnieś transwelle, chwytając je hemostatem i delikatnie postukaj w wewnętrzne ścianki 24-dołkowej płyty migracyjnej. Przed odrzuceniem dołków trans należy ocenić migrację neutrofili w studzienkach, oglądając dołki 24-dołkowej płytki migracyjnej pod mikroskopem odwróconym przy użyciu obiektywu 10x. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 10% Triton X 100 do każdej studzienki użytej w 24-dołkowej płytce migracyjnej, każdego wzorca i ślepej próby.Obróć 24-dołkowe wzorce płytek migracyjnych i wypustowuj je z niską prędkością przez 20 minut. W czterech stopniach Celsjusza. Dodaj 50 mikrolitrów buforu cytrynianowego.Po dwa w każdym dołku użyto w 24-dołkowej płytce migracyjnej do każdego wzorca i dokładnie do ślepej próby. Dobrze wymieszać zawartość każdej próbki, pipetując roztwór w górę i w dół co najmniej pięć razy. Następnie przenieś 100 mikrolitrów z każdej studzienki na próbkę w dwóch egzemplarzach do 96-dołkowej płytki, 100 mikrolitrów każdego wzorca i ślepą próbę na 96-dołkową płytkę.Po wymieszaniu dodaj 50 mikrolitrów 30% nadtlenku wodoru do roztworu A BTS i wiruj. Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu substratu BTS do każdej próbki. Na płytce 96-dołkowej pozwól płytki rozwinąć się przez pięć do 10 minut w ciemności.Obserwuj rozwój zielonego koloru w dołkach płytki zawierającej neutrofile lizy przed odczytem na długości fali 405 nanometrów. Za pomocą czytnika mikropłytek do oceny migracji neutrofili trans neutrofilów, które w pełni migrowały przez warstwę nabłonka do komory wierzchołkowej, można obejrzeć w dolnej studzience 24-dołkowej płytki migracyjnej, jak to pokazano tutaj za pomocą mikroskopu światła odwróconego. Zaobserwowano, że bardzo niewiele neutrofili migruje przez niezakażoną warstwę nabłonka bez narzuconego gradientu chemotaktycznego i reprezentuje poziomy tła w teście.W przeciwieństwie do tego, obfitość neutrofili transmi była widoczna, gdy zapewniono gradient FMLP. Zakażenie nabłonka niepatogennym E. coli mc 1000 skutkowało niewielką liczbą widocznych neutrofili migrujących trans, podczas gdy wiele neutrofili migrujących trans można było zaobserwować, gdy warstwy nabłonka były zakażone patogennym dla płuc Pseudomonas aerogen. Neutrofile, które migrowały w eksperymencie, są oznaczane ilościowo, mierząc ich aktywność peroksydazy mielologicznej.Liczba granulocytów obojętnochłonnych dodatnio koreluje z wielkością aktywności peroksydazy mierzoną po lizie neutrofili o wartościach wykazujących liniową zależność w zakresie liczby neutrofili wybranych do krzywej wzorcowej. Znaczna liczba neutrofili migruje przez warstwy nabłonka w odpowiedzi na gradient FMLP dostarczony przez A lub w odpowiedzi na warstwę nabłonkową zakażoną PAO. Liczba neutrofili, które migrują przy braku bodźców lub po zakażeniu nabłonka wierzchołkowego niepatogennym E. coli mc 1000, jest poniżej granicy wykrywalności dla testu.Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu pięciu godzin w celu pokrycia kolagenem i zasiania komórek nabłonka na filtrach transwell, a następnie co najmniej tygodnia, aby umożliwić wzrost komórek nabłonka. Gdy monowarstwy nabłonka są gotowe. Test migracji można przeprowadzić w ciągu pięciu godzin, łącznie z izolacją neutrofili i przygotowaniem bakterii, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przygotowaniu filtrów transwell w sterylnych warunkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Procedurę tę można dostosować, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z tym procesem zapalnym. Można przeprowadzić analizę migrowanych komórek, nabłonka, leżącego na wznak, a nawet patogenu.

in-vitro-coculture-assay-to-assess-pathogen-induced-neutrophil-trans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Przyleganie neutrofili do aktywowanego śródbłonka w miejscach infekcji jest integralnym składnikiem odpowiedzi zapalnej gospodarza. W niniejszym raporcie opisano test wiązania neutrofili, który pozwala na ilościowe określenie in vitro pierwotnego wiązania ludzkich neutrofili z komórkami śródbłonka aktywowanymi przez mediatory stanu zapalnego w warunkach statycznych.

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

Prezentujemy test migracji komórek ex vivo, który pozwala na precyzyjne określenie potencjału migracji komórek grzebienia nerwowego jelit w obecności różnych czynników wzrostu.

Ilościowy test migracji komórek dla mysich jelitowych progenitorów nerwowych

Wykonywanie testów hodowli komórkowych w celu zbadania adhezji i inwazji bakterii w warunkach tlenowych jest zazwyczaj niereprezentatywne dla środowiska in vivo. Model pionowej komory dyfuzyjnej umożliwia badanie interakcji ludzkiego patogenu Campylobacter jejuni z komórkami nabłonka jelitowego w warunkach bardziej zbliżonych do in vivo, co skutkuje zwiększoną inwazją bakterii.

Inwazja bakterii jelitowych na komórki nabłonka jelitowego in vitro jest znacznie zwiększona dzięki pionowemu modelowi komory dyfuzyjnej

Opracowaliśmy model in vitro, który naśladuje ważny składnik ostrej reakcji zapalnej podczas infekcji pęcherza moczowego uropatogennym Escherichia coli.  Test migracji neutrofili przezuroepitelialnych umożliwia ilościową ocenę migracji neutrofili u ludzi przez nabłonek pęcherza moczowego, hodowanych na przepuszczalnych podporach, w odpowiedzi na infekcję bakteryjną lub substancje chemoatraktantowe.

Ilościowa ocena migracji neutrofili człowieka przez nabłonek pęcherza moczowego z hodowlą

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Tutaj prezentujemy protokół do oceny wpływu peptydów na migrację komórek nabłonka oskrzeli. Metoda ta pozwala na szybkie i wysoce powtarzalne uzyskanie danych ilościowych na temat szybkości migracji komórek i zamykania ran.

Nowatorski test gojenia ran in vitro do oceny migracji komórek

Rozregulowana funkcja bariery nabłonkowej jelit i reakcje immunologiczne są cechami charakterystycznymi nieswoistego zapalenia jelit, które pozostają słabo zbadane z powodu braku modeli fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy model pętli jelitowej myszy, który wykorzystuje dobrze unaczyniony i zewnętrzny odcinek jelita do badania przepuszczalności błony śluzowej i rekrutacji leukocytów in vivo.

Funkcjonalna ocena przepuszczalności jelit i migracji przeznabłonkowej neutrofili u myszy przy użyciu standaryzowanego modelu pętli jelitowej

Escherichia coli powoduje sepsę u noworodków, które połykają bakterie w czasie porodu. Proces związany ze zdolnością E. coli do przemieszczania się z przewodu pokarmowego do krwiobiegu jest słabo poznany. Ten model in vitro ocenia zdolność szczepów E. coli do przemieszczania się przez komórki nabłonka jelitowego.

Ocena transcytozy jelitowej izolatów bakteriemii Escherichia coli u noworodków

Ten protokół zapewnia metodę pierwotnej izolacji mysich limfocytów T i mikroskopii poklatkowej migracji limfocytów T w określonych warunkach środowiskowych z analizą ilościową.

Test migracji in vitro w czasie rzeczywistym dla pierwotnych mysich limfocytów T CD8 +

Badanie przedstawia metodę badania in vitro infekcji bakteryjnej z wykorzystaniem organoidów pochodzenia tkankowego z komórek macierzystych. Protokół opisuje, jak hodować i różnicować organoidy w dwóch wymiarach, zakażać je adherentno-inwazyjnymi Escherichia coli oraz oceniać kluczowe odczyty, w tym przełamanie bariery nabłonkowej, obrazowanie infekcji oraz odpowiedź RNA nabłonkowego.

Dwuwymiarowa hodowla organoidów na inwazynie lub wyciągu z błony podstawowej do badania interakcji gospodarz-bakteria

Poznaj metodę in vitro oceny migracji neutrofili przez nabłonek w odpowiedzi na zakażenie bakteryjne. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów immunologicznych w tkankach śluzowych.

Metody in vitro Test kokultury w celu oceny migracji transnabłonkowej neutrofili indukowanej patogenem

Przeglądaj więcej filmów