Izolacja, hodowla i przeszczep satelitarnych komórek mięśniowych

Ogólnym celem tej procedury jest przeszczepienie oczyszczonych, spokojnych komórek satelitarnych mięśni szkieletowych dorosłych neuronów w celu leczenia uszkodzeń mięśni szkieletowych. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie mięśni szkieletowych dorosłych myszy i enzymatyczne trawienie mięśni szkieletowych, a następnie sortowanie spoczynkowych komórek satelitarnych przez separację kulek magnetycznych. Następnie wyizolowane komórki są namnażane na szalkach hodowlanych pokrytych kolagenem, a w ostatnim etapie rozszerzone komórki in vitro są wstrzykiwane do mięśni szkieletowych dorosłych myszy leczonych kardio.

Ostatecznie wszczepienie i udział ekspandowanych komórek satelitarnych in vitro w regeneracji włókien mięśniowych można ocenić za pomocą barwienia xal. Cześć, nazywam się sushi ura. Jestem profesorem nadzwyczajnym w Instytucie Komórek Macierzystych na Uniwersytecie Minnesoty.

Izolacja komórki satelitarnej centa, która jest masową populacją komórek macierzystych, jest niezbędna do zrozumienia biologii komórek macierzystych mięśni oraz regeneracji, a także przeszczepu komórek macierzystych w terapiach dystrofii mięśniowych, takich jak masowe dystrofie mięśniowe Duchenne'a. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak fakty, jest to, że nasza metoda jest szybką, ekonomiczną i niezawodną metodą oczyszczania spoczynkowych komórek satelitarnych z mięśnia rozproszonego dorosłej myszy. Pokazowe procedury będą wykonywane przez dr Rio Moto, doktora habilitowanego Hashi i młodszego naukowca Yoko Asurę w moich laboratoriach.

Aby wyizolować komórki jednojądrzaste z mięśni szkieletowych myszy, zacznij od uszczypnięcia, a następnie rozcięcia skóry brzucha każdej trzy- do ośmiotygodniowej dorosłej myszy poddanej eutanazji. Peeluj skórę w przeciwnych kierunkach, aby całkowicie odsłonić triceps i mięsień tylnej nogi, a następnie przytnij wzdłuż kości nóg, aby usunąć piszczel przedni mięśnie czworogłowe uda i triceps. Przenieś mięśnie do lodowatego, sterylnego PBS na 10-centymetrowej płytce i zmyj krew.

Następnie przenieś mięśnie na nową, sterylną sześciocentymetrową płytkę. Następnie pod mikroskopem stereoskopowym usuń tkankę łączną, naczynia krwionośne, wiązki nerwowe i dodaj tkankę epigenną z mięśni. Następnie za pomocą nożyczek okulistycznych pokrój i zmiel tkankę na gładką miazgę.

Staram się nie zostawiać dużych kawałków. Przenieś zmielone mięśnie do 50-mililitrowej probówki i strawij tkankę w pięciu mililitrach roztworu kolagenazy w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po godzinie użyj strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 18, aby kilkakrotnie spróbować zawiesiny tkanki.

Aby homogenizować mieszaninę, inkubuj homogenat przez kolejne 15 minut, a następnie ponownie tri mieszaniny Aby zdysocjować zawiesinę jednokomórkową, dodaj do 50 mililitrów pożywki i wymieszaj roztwór komórek. Następnie przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 70 mikronów do nowej 50-mililitrowej probówki Falcon. Policz zebrane komórki, a następnie odwiruj zawiesinę komórek po umyciu komórek, ponownie zawieś osad w 200 mikrolitrach pożywki, a następnie przenieś komórki do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej w celu wybarwienia i oddzielenia komórek.

Umieść probówkę z mikrowirówką na lodzie, a następnie inkubuj komórki z jednym mikrolitrem każdego z wymienionych ciał przeciwciał. Po 30 minutach umyj komórki w jednym mililitrze pożywki dwa razy. Następnie ponownie zawieś granulat w 200 mikrolitrach pożywki i inkubuj komórki 10 mikrolitrów kulek magnetycznych anty PE na lodzie.

Po kolejnych 30 minutach umyj komórki w jednym mililitrze maksymalnego buforu dwa razy i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze buforu. Następnie umieść kolumnę LD w magnesie i przepłucz kolumnę 1,5 mililitra maksymalnego buforu. Dozuj zawiesinę komórek na kolumnę, zbierając ujemny przepływ PE przez frakcję w probówce o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie odwiruj frakcję ujemną PE i ponownie zawieś granulkę w 100 mikrolitrach pożywki. Teraz inkubuj komórki w pięciu mikrolitrach kulek magnetycznych anty-US IgG na lodzie, a następnie po 30 minutach umyj komórki w jednym mililitrze maksymalnego buforu dwa razy Resus, zawieszając osad w 500 mikrolitrach buforu. Następnie umieść kolumnę MS na magnesie i przepłucz ją jednym mililitrem maksymalnego buforu.

Następnie dozuj komórki do kolumny, odrzucając ujemny przepływ alfa siedem przez frakcję. Przepłucz kolumnę dwa razy jednym mililitrem maksymalnego buforu, a następnie wyjmij ją z magnesu. Następnie przepłukać jeden mililitr maksymalnego buforu przez kolumnę za pomocą tłoka, aby wymyć magnetycznie znakowaną integrynę siedem dodatnich komórek do świeżej 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.

Następnie, po odwirowaniu zawiesiny komórek, ponownie zawieś oczyszczone komórki w pożywce mioblastowej. Na koniec utrzymuj komórki na pokrytej matrżelem sześciocentymetrowej płytce zawierającej pięć mililitrów pożywki mioblastowej. Aby utrzymać hodowlę komórkową, karm komórki co drugi dzień pożywką mioblastów rosnących mioblastów.

Wykazują mały okrągły kształt i wyrażają myo D w swoich jądrach. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia fuzji komórek, przepłucz je raz PBS, a następnie spróbuj je anżować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po trzech minutach zbierz zdysocjowane komórki w pożywce mioblastowej, odwiruj reus komórek, zawieszając osad w pożywce mioblastowej i ponownie umieść komórki na nowych płytkach pokrytych matryżelem.

Aby zróżnicować kulturę komórkową, należy karmić komórki co drugi dzień pożywką różnicującą. Po jednym dniu mioblasty opuszczą cykl komórkowy i ulegną różnicowaniu w miozyny o ciężkim łańcuchu lub miocytach MHC-dodatnich. Od trzeciego do piątego dnia komórki łączą się ze sobą i generują wielojądrowe rurki mięśniowe.

Na 24 godziny przed przeszczepem mioblastów należy ogolić włosy wokół mięśnia piszczelowego przedniego lub TA u dwumiesięcznej myszy z poślizgiem w pozycji uspokajającej. Następnie użyj strzykawki insulinowej o rozmiarze 31, aby wstrzyknąć 10 mikromolów cardio toiny do mięśnia. Następnego dnia odłącz proliferujące mioblasty od płytek pokrytych matryżelem trypsyną, jak właśnie pokazano, i odwiruj zdysocjowane komórki, ponownie zawieś jedną razy 10 do szóstej komórki w 50 mikrolitrach pożywki.

Następnie załaduj komórki do strzykawki insulinowej o rozmiarze 31 i przeszczep komórki domięśniowo do zwierzęcia biorcy w celu regeneracji mięśni przednich TBI. Jeden do czterech tygodni po wstrzyknięciu należy pobrać mięśnie TA do analizy histologicznej. Świeżo wyizolowane komórki satelitarne w stanie spoczynku mają mały okrągły kształt, a ponad 90% z tych komórek wyraża PAC 7 jako ostateczny marker.

Ekspandowane mioblasty ex vivo mogą być wykorzystywane do eksperymentów z wstrzykiwaniem komórek domięśniowych w celu zbadania udziału mioblastów w regeneracji włókien mięśniowych i samoodnawianiu komórek satelitarnych. Podczas hodowli w pożywce różnicowej mioblasty opuszczają cykl komórkowy, łączą się ze sobą i stają się wielojądrowymi rurkami mięśniowymi, które wyrażają ciężki łańcuch miozyny od kilku dni do kilku miesięcy po przeszczepie. Dodatnie komórki pochodzące od dawcy po stronie beta galakto, które obejmują proliferujące mioblasty, samoodnawiające się komórki satelitarne i nowo powstałe włókna mięśniowe, można wykryć w uszkodzonym mięśniu sercowo-naczyniowym po każdym rozwoju.

Ta technika utorowała drogę naukowcom zajmującym się komórkami macierzystymi mięśni i pochodzeniem mięśni do zbadania przeszczepu komórek macierzystych w dystrofii mięśniowej, jestem Fushi. Jestem Yoko. Jestem Norio.Dzięki.

Dziękuję za oglądanie.