Ortotopowy mysi model przerzutów ludzkiego raka prostaty

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie wielkości guza pierwotnego, powstawania przerzutów do płuc oraz liczby krążących komórek nowotworowych w mysim modelu ludzkiego raka prostaty. Osiąga się to poprzez bezpośrednie zagnieżdżenie się ludzkich komórek raka prostaty do brzusznego płata prostaty myszy babsi atymmicznej. Po rozwinięciu się guzów kości udowe i krew sercowa są usuwane ze zwierzęcia, co pozwala na identyfikację krążących komórek nowotworowych.

Na koniec usuwa się pierwotne guzy i płuca do analizy. Ostatecznie można zmierzyć zmiany w rozmiarze, masie i charakterystyce molekularnej guza pierwotnego, a także tworzenie przerzutów do płuc. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi technikami, takimi jak życik ogonowy lub wstrzyknięcie międzysercowe, jest to, że dzięki tej technice można zmierzyć pełny zakres przerzutów od powstania pierwotnego wynaczynienia guza i przeżycia w krwiobiegu oraz przybycia i powstania wtórnych przerzutów w nowym miejscu.

Implikacje tej techniki odnoszą się do leczenia przerzutów do raka prostaty u ludzi. Wykorzystaliśmy ten model do przetestowania wpływu kilku małocząsteczkowych środków terapeutycznych na hamowanie przerzutów ludzkiego raka prostaty. Ponadto model może być wykorzystany do walidacji potencjalnych celów terapeutycznych w hamowaniu przerzutów ludzkiego raka prostaty Zacznij od użycia sterylnych wacików i Betadine do szorowania dolnej części brzucha znieczulonej myszy atymicznej bopsy w wieku od sześciu do ośmiu tygodni

Następnie przetrzyj obszar chusteczką nasączoną alkoholem, a następnie przetrzyj zwierzę roztworem Betadyny. Po pozostawieniu obszaru do wyschnięcia użyj pary zaostrzonych sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby wykonać trzy- do czteromilimetrowego nacięcia brzucha w linii środkowej. Następnie za pomocą kleszczy delikatnie unieś pęcherz, nie poruszając żadnymi innymi narządami ani mięśniami, i zidentyfikuj płat brzuszny prostaty znajdujący się bezpośrednio pod pęcherzem.

Teraz wstrzyknij badaną populację komórek nowotworowych za pomocą strzykawki o pojemności 0,5 cm3 wyposażonej w igłę o rozmiarze 28 i pół do brzusznego gruczołu krokowego, minimalizując wyciek i upewniając się, że w tkance obserwuje się mały pęcherzyk. Następnie wymień pęcherz moczowy i użyj wchłanialnych szwów monofilamentowych Vicryl 4.0, aby zamknąć warstwę mięśniową w prosty, przerywany wzór. Zamknij warstwę skóry sterylnymi dziewięciomilimetrowymi zszywkami.

Po czterech do sześciu tygodniach guzy są widoczne wizualnie lub można je wyczuć palpacyjnie po eutanazji. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć poziomo bezpośrednio pod klatką piersiową, a następnie pionowo do pachy, aby odsłonić serce, usuń krew ze zwierzęcia za pomocą terminalnego nakłucia serca za pomocą nożyczek chirurgicznych, przetnij tchawicę, a następnie usuń płuca i natychmiast umieść płuca w kasecie na tkanki, a następnie w pojemniku zawierającym 10% formaliny. Następnie, indywidualnie, przetnij wszelkie naczynia krwionośne przyczepione do pierwotnego guza prostaty, uważając, aby upewnić się, że nie są przyczepione żadne dodatkowe narządy, zapisz wagę i rozmiar guza.

Następnie natychmiast zatrzaśnięcie, zamrożenie tkanki w ciekłym azocie lub umieszczenie tkanki w kasecie na chusteczki, a następnie w pojemniku zawierającym 10% forminy. Na koniec użyj nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić stawy biodrowe i kolanowe. Następnie odłącz nogi, uważając, aby kość udowa pozostała nienaruszona przed umieszczeniem ich w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.

Na pierwszym rysunku pokazano zmiany w masie ciała i spożyciu pokarmu przez myszy sześć tygodni po inokulacji guza. Należy pamiętać, że w okolicach daty operacji występuje niewielki spadek masy ciała i spożycia pokarmu z powodu znieczulenia. W trakcie trwania eksperymentu masa ciała i spożycie pokarmu powoli rosną po operacji, a następnie zaczynają spadać pod koniec eksperymentu.

Gdy obciążenie guzem osiąga poziom krytyczny na tych wykresach, pokazane są reprezentatywne rozmiary guza. Poszczególne rozmiary guzów różnią się, ale średnio guzy o wadze około jednego grama i wielkości jednego centymetra sześciennego uzyskuje się, jak pokazano na ilustracji. W tym miejscu ważne jest, aby wziąć pod uwagę zmiany masy guza i wielkości guza, które występują między czterema a sześcioma tygodniami.

Planując punkt końcowy eksperymentu w tym reprezentatywnym eksperymencie w ciągu ostatnich dwóch tygodni, średnia masa guza wzrosła 2,7-krotnie, a rozmiar guza dramatycznie wzrósł 1,9-krotnie. Wpływ na wyniki eksperymentu mają zmiany w całkowitej liczbie komórek przerzutowych na płuco, a sekcja zwłok myszy po czterech i sześciu tygodniach może być obserwowana, a także zilustrowana na tym wykresie. Myszy uśmiercone po czterech tygodniach nie wykazały rozwoju przerzutów, podczas gdy myszy po sześciu tygodniach od inokulacji guza wykazały komórki przerzutowe u wszystkich myszy.

Oceniono dalej, podkreślając znaczenie przeprowadzania sekcji zwłok myszy na późnym etapie końcowym, aby upewnić się, że wystąpiły przerzuty. Czasy te mogą się różnić w zależności od linii komórkowej lub modyfikacji genów. Liczbę przerzutów można określić ilościowo na trzy różne sposoby.

Na przykład całkowitą liczbę komórek ludzkiego raka prostaty z dodatnim GFP można po prostu policzyć za pomocą barwienia immunohistochemicznego dla GFP lub barwienia h i e, jak na tych obrazach, gdzie pojedyncza komórka o wielkości 40 x jest podświetlona strzałką. Zwróć uwagę na brązowe zabarwienie w wycinku płuc zabarwionym GFP i duże, wyraźne jądra. Innym sposobem ilościowego określenia liczby przerzutów jest rozważenie liczby miejsc, w których obecne są złogi przerzutowe.

Na przykład na tym obrazie o jasności 10 razy większa jasność można zaobserwować kilka loci o różnych numerach komórek, z których każdy jest podświetlony strzałką, jeden loci z trzema odrębnymi komórkami jest również podświetlony. Wreszcie, liczba wyraźnych przerzutów zdefiniowana przez wyraźnie związaną grupę komórek wykazujących pięć lub więcej komórek ludzkiego raka prostaty GFP dodatnich również może być określona ilościowo, jak na tym obrazie, gdzie jeden przerzutowy depozyt 10 komórek jest pokazany na tych trzech ostatnich wykresach, reprezentatywne eksperymenty QR TPCR R mierzące ekspresję trzech genów będących przedmiotem zainteresowania w metaloproteinazie macierzy progresji przerzutów typu drugiego, Pokazano metaloproteinazę macierzy typu dziewiątego i białko szoku cieplnego 27 w indywidualnych próbkach guza pobranych od myszy po sześciu tygodniach. Początkowo opracowując tę technikę, ważne jest, aby współpracować z obiektem dla zwierząt i personelem weterynaryjnym w celu prawidłowego podania znieczulenia, leków przeciwbólowych i zminimalizowania przymusu chirurgicznego.