Stosowanie pHluorin do oceny dynamiki receptorów kierowania aksonami w hodowli komórkowej i w zarodku piskląt

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie wrażliwego na pH wariantu GFP do zbadania czasoprzestrzennej dynamiki transportu receptorów naprowadzanych przez aksony na powierzchni komórki. Osiąga się to poprzez uprzednie oznaczenie receptora zainteresowania sekwencją Florina przy użyciu odpowiedniej strategii klonowania. Drugim etapem procedury jest scharakteryzowanie wrażliwości pH receptora znakowanego Florinem transfekowanego in vitro.

Trzecim krokiem jest elektropostacja konstruktu receptora znakowanego Florinem w OVO w celu uzyskania ekspresji w rdzeniu kręgowym. Ostatnim krokiem jest odcięcie elektroporowanych zarodków na pożądanym etapie. Ostatecznie wyniki mogą wykazać zmiany w transporcie receptorów na powierzchni komórki zarówno w domenie przestrzennej, jak i czasowej za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak zastosowanie konstruktów białkowych technologii GFP, jest to, że czułość pH receptorów trójskrzydłych pH pozwala na wykrycie czasoprzestrzennych zmian dynamiki receptora na powierzchni komórki, zarówno in vitro, jak i in vivo. Ta metoda może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytanie w dziedzinie poradnictwa Axon. Rzeczywiście, może to pomóc w scharakteryzowaniu czasoprzestrzennej regulacji rozkładu powierzchni komórki receptora naprowadzającego aksonu, a wiemy, że dysregulacja ma kluczowe znaczenie dla ustawienia czułości dużego stożka na określoną kolejkę.

Metoda ta może dostarczyć informacji na temat prowadzenia aksonów w modelu zarodka policzka, ale może być również zastosowana do innych systemów, takich jak wycinki mózgu myszy. Utrzymanie hodowli w połączeniu z obrazowaniem życia Przygotowano koszt siedmiu komórek w DMEM przy płynności 70 do 80% CO, a gen będący przedmiotem zainteresowania sklonowany do wektora florinowego. Zacznij od dodania trzech mikrogramów DNA do 200 mikrolitrów 150-milimolowego chlorku sodu.

Delikatnie zmieszaj mieszaninę, a następnie krótko ją odwiruj. Następnie dodaj odpowiednią ilość odczynnika do transfekcji w tym przypadku 10 mikrolitrów i wiruj. Natychmiast pozwól mieszance osiąść przez 10 minut.

Dodaj temperaturę pokojową. Następnie dodaj 200 mikrolitrów gotowej mieszaniny do komórek. Delikatnie zamieszaj płytkę i włóż ją z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 48 godzin z wymianą podłoża zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Dwa dni później przygotuj komorę mikroskopu. Teraz przenieś komórki do komory. Podłącz do niego pięciomililitrową strzykawkę, aby składniki można było dodawać bezpośrednio, podczas gdy komora jest utrzymywana w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Przed użyciem mikroskopu upewnij się, że jest on zrównoważony, aby uniknąć mechanicznego dryfu podczas nagrywania. Następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania i wybierz program akwizycji wielowymiarowej i znajdź transfekowany koszt siedmiu komórek z obiektywem 40 x, zaznacz każdą z ich pozycji w oprogramowaniu, w którym skonfiguruj stos Z na głębokość akwizycji 15 mikronów. Należy pamiętać, że ostrość może ulec zmianie podczas dodawania nośnika do komory obrazowania.

Ustaw odpowiednią fazę, ekspozycję na filtr GFP i odpowiedni czas akwizycji dla eksperymentu z pięcioma polami zainteresowania, dzięki czemu akwizycja obrazu co 20 sekund przez 10 minut powinna wystarczyć. Rozpocznij akwizycję i wykonaj pięć obrazów kontrolnych w pożywce DMEM pH 7,4. Następnie wstrzymaj przejęcia.

Wstrzyknąć 1,25 mililitra pH 3,5, kompletny DMEM, aby osiągnąć pH 5,5 w pożywce hodowlanej. Oznacz zdarzenie w oprogramowaniu i wznów pobieranie obrazów dla kolejnych pięciu punktów czasowych. W tym czasie zielona fluorescencja powinna stopniowo zanikać.

Następnie wstrzymaj przejęcia. Wstrzyknąć 1,2 mililitra pH 9,5, wypełnić DMEM, aby osiągnąć pH 7,4 w pożywce hodowlanej. Zaznacz to wydarzenie w oprogramowaniu i zdobądź pięć dodatkowych punktów czasowych.

Teraz zielona fluorescencja powinna pojawić się ponownie na błonie plazmatycznej. Szczegółowe informacje na temat obchodzenia się z jajami przed elektroporacją i innymi przygotowaniami znajdują się w protokole tekstowym. Ta sekcja rozpoczyna się od utworzenia okna w jaju.

Przykryj górną część jajka taśmą w miejscu, w którym zostanie wykonane okno. Następnie za pomocą zakrzywionych nożyczek przebij skorupę po jej dużej, stronie. Usunąć dwa mililitry albuminy za pomocą igły przymocowanej do pięciomililitrowej strzykawki.

Ustaw igłę pionowo, aby uniknąć uszkodzenia worka z ylk na wierzchu jajka. Zrób kolejną dziurę w tym samym procesie. Następnie z drugiego otworu wytnij okno wystarczająco duże, aby uwidocznić zarodek i móc nad nim pracować.

Przy około dwóch mililitrach sterylnego, ciepłego, zmodyfikowanego PBS zapobiega to odwodnieniu i zwiększa dostępność. Teraz wstrzyknij DNA i por zarodek. Najpierw rozcieńczyć plazmid w PBS do ilości od 0,5 do dwóch mikrogramów na mikrolitr, ale nie więcej.

Następnie dodaj szybki zielony barwnik do końcowego stężenia 0,025%Załaduj mieszaninę DNA do naczynia włosowatego, aby wstrzyknąć DNA za pomocą wstrzykiwacza. Jeśli opór naczynia włosowatego jest zbyt duży, wstrzyknięcie zarodków może być trudne. Jeśli opór jest zbyt mały, rozmiar kapilary może uszkodzić zarodek za pomocą obciążonego nakłucia kapilary, worka z żółtkiem i cewy nerwowej po stronie rozpieszcza, włożyć do cewy nerwowej pod płytkim kątem i wypełnić światło od ogona do głowy mieszaniną DNA.

Następnie, szybko, umieść czteromilimetrowe elektrody platynowe po obu stronach rurki neuronowej i naelektryzuj impulsami o napięciu 50 milisekund i napięciu 31 woltów co pół sekundy. Na elektrodach powinny tworzyć się bąbelki. Unikaj serca lub dużych dodatkowych naczyń embrionalnych.

Po zakończeniu elektroporacji użyj igły, aby usunąć dwa mililitry albuminy. Następnie szczelnie uszczelnij okno i stronę hermetycznie taśmą. Przywróć jaja do 38,5 stopnia Celsjusza, aż rozwiną się do pożądanego etapu.

Następnie postępuj zgodnie z procedurami osadzania i kriosekcji podanymi w protokole tekstowym, zastosowanie Florina zapewnia precyzyjną rozdzielczość czasoprzestrzenną sortowania receptorów transbłonowych na błonie plazmatycznej. Na pokaz plex w jednym został oznaczony tagiem Florin. Jest to receptor przewodniczący, który pośredniczy w sygnale se Forin three B. Konstrukt został wyrażony in vitro.

W CO przeprowadzono obrazowanie siedmiu komórek i żywych komórek przy fizjologicznym pH. Receptor znajdował się głównie na błonie komórkowej, co potwierdzało wykrycie tylko puli komórek receptora. Po elektroporacji innovo stwierdzono, że plex w jednym rozprowadza się na powierzchni stożka wzrostu po skrzyżowaniu płyty podłogowej.

Na etapie przed krzyżowaniem pleks w jednym nie został wykryty na powierzchni komórki. Sugeruje to, że sygnalizacja SEMA 4 i 3 B Axon jest ograniczona do etapu po skrzyżowaniu. Podejmując próbę wykonania tej procedury, należy zauważyć, że stosowanie pH grypy nadaje się przede wszystkim do monitorowania przygotowania do życia.

Stosowanie pH grypy w tkance utrwalonej wymaga szczególnej ostrożności w trakcie i po utrwaleniu. Ponieważ potwierdzenie pH grypy może być tylko tymczasowe, dlatego pH wszystkich roztworów musi być utrzymywane powyżej siedmiu, a obserwację należy przeprowadzić wkrótce po utrwaleniu Po jego rozwinięciu. Metoda ta toruje drogę naukowcom zajmującym się naprowadzaniem aksonów i migracją komórek do zbadania regulacji dystrybucji receptora przewodniego na powierzchni komórki w różnych modelach zwierzęcych, takich jak cele przeciwko drosophila i myszom.