Dostrajanie rozmiaru i minimalizowanie szumów nanoporów w stanie stałym

Ogólnym celem tej metodologii jest przygotowanie ciała stałego do eksperymentów z detekcją biomolekularną poprzez precyzyjne kontrolowanie jego wielkości i zmniejszenie charakterystyki szumu prądu jonowego. Osiąga się to poprzez najpierw zamontowanie półprzewodnikowego chipa nanoporowego w ogniwie płynnym w celu ustanowienia kanału o wielkości nanometra między dwoma zbiornikami elektrolitu W drugim etapie w poprzek nanopora przykładane jest umiarkowane pole elektryczne o napięciu około 0,01 V na nanometr, aby scharakteryzować jego początkowy rozmiar i właściwości szumu elektrycznego. Następnie w poprzek membrany w krótkich impulsach przykładane są silne pola elektryczne o napięciu około 0,3 wolta na nanometr.

Aby całkowicie zwilżyć, Nanopore zredukuj szum elektryczny i powiększ go do pożądanego rozmiaru i dyskretnych kroków poniżej nanometrów. Uzyskano wyniki, które pokazują, że w pełni mokry, funkcjonalny, niskoszumowy nanopor jest wytwarzany w oparciu o analizę sygnału prądu jonowego i udaną translokację biomolekuł. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami kontrolowania wielkości nanoporów, takimi jak użycie transmisyjnego lub skaningowego mikroskopu elektronowego, jest to, że w roztworze soli przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego w tej samej konfiguracji, która jest używana do wykrywania biomolekularnego.

Zapewnia to precyzyjną kontrolę rzeczywistej wielkości nanoporów podczas eksperymentów z detekcją biomolekularną. Procedura redukuje również szumy elektryczne o niskiej częstotliwości i pozwala na odmłodzenie zatkanych nanoporów do dalszych eksperymentów. Ten film zakłada, że chip nanoporowy został już zamontowany w ogniwie nanoporowym.

Kolejnym krokiem jest przygotowanie komórki do eksperymentów. Aby to zrobić, umieść srebrne elektrody chlorkowe srebra w każdym zbiorniku. Następnie podłącz wzmacniacz prądu o niskim poziomie szumów między zbiornikami ogniwa.

Umieść cały zespół ogniw nanoporowych w elektrycznie ekranowanej obudowie. Przełącz wzmacniacz prądu o niskim poziomie szumów w tryb poleceń zewnętrznych. Aby umożliwić zautomatyzowane sterowanie komputerowe, komputer powinien przemiatać przyłożony potencjał w zakresie od minus 200 miliwoltów do 200 miliwoltów i rejestrować Charakterystyka IV pasuje do krzywej IV, aby uzyskać przewodność nanoporową o średnicy do użycia w celu sprawdzenia spójności niższej niż oczekiwana przewodność widziana w tym przykładzie lub asymetria w krzywej IV pokazanej tutaj.

Wskaż niecałkowicie mokry lub zatkany nanopor wymagający kondycjonowania. Aby kontynuować charakterystykę, należy zastosować potencjał 200 miliwoltów w poprzek nanoporów i rejestrować prąd jonowy przez 30 sekund. Ta część śladu z nieuwarunkowanego Nanopore wykazuje wysoki stopień szumu elektrycznego, który sprawia, że próbka nie nadaje się do eksperymentów z czujnikami biomolekularnymi dla wszystkich pomiarów prądu jonowego.

Określ ilościowo charakterystykę szumów o niskiej częstotliwości za pomocą analizy gęstości widmowej mocy. Obserwowany tutaj wysoki szum o niskiej częstotliwości jest charakterystyczny dla niecałkowicie mokrych lub zatkanych nanoporów. Dane z charakterystyki mogą wskazywać, że nanopory wymagają kondycjonowania.

Aby to zrobić, odłącz elektrody od wzmacniacza prądu o niskim poziomie szumów. Podłącz jeden z przewodów do sterowanego komputerowo zasilacza o napięciu wyjściowym większym niż sześć woltów. Podłącz elektrodę uziemiającą do zewnętrznego wzmacniacza prądu, aby przetestować konfigurację.

Zastosuj różnicę potencjałów 400 miliwoltów w poprzek nanoporów przez co najmniej pięć sekund i zmierz prąd, użyj ostatniej jednej sekundy danych, aby sprawdzić spójność z pomiarami krzywej dożylnej. Następnie zastosuj 200-milisekundowy impuls o napięciu sześciu woltów w poprzek nanoporów. Następnie wykonaj pięciosekundowy okres pomiaru przy 400 miliwoltach i użyj ostatniej sekundy danych, aby znaleźć średnicę.

W razie potrzeby powtarzaj tę sekwencję, aż średnica nanoporów będzie zgodna z uzyskanymi obrazami TEM. Przed zamontowaniem nanoporów lub pomiarów przewodności przed zatkaniem nanoporów nanopory można powiększyć do pożądanego rozmiaru, stosując impulsy o dłuższym czasie trwania i/lub wyższe potencjały w konfiguracji kondycjonowania dla membrany o grubości 30 nanometrów. Zacznij od przyłożenia 400 miliwoltów napięcia polaryzacji w poprzek nanoporów przez co najmniej pięć sekund.

Dostarczenie danych do oszacowania wielkości nanoporów. Następnie zastosuj dwusekundowy impuls o napięciu ośmiu woltów. Następnie należy przeprowadzić pomiar przez okres co najmniej pięciu sekund przy napięciu 400 miliwoltów.

Aby cyklicznie określić zwiększoną średnicę, powtarzaj dwusekundowy ośmiowoltowy impuls powiększający i pięć sekundowych kroków pomiaru 400 miliwoltów, aż do osiągnięcia pożądanej wielkości porów. Po osiągnięciu średnicy docelowej odłącz zasilanie i prąd amplifier. Podłącz ponownie wzmacniacz prądu o niskim poziomie szumów do elektrod.

Pozyskaj nowe dane dożylne i bieżące ślady, aby potwierdzić średnicę nanoporów i zweryfikować charakterystykę prądu jonowego o niskim poziomie szumów, jak pokazano tutaj, w porównaniu z niespełnionymi i asymetrycznymi nanoporami. Charakterystyka IV powiększonych nanoporów wykazuje znaczny wzrost przewodnictwa i idealnego zachowania omicznego. Tutaj nasze typowe ślady przewodności nanoporów o grubości 10 nanometrów i membrany o grubości 30 nanometrów przed i po leczeniu silnymi polami elektrycznymi.

Zwróć uwagę na przerwę w skali przewodności. Przewodność PO pokazana na niebiesko jest znacznie mniejsza niż oczekiwano dla nalewania 10 nanometrów, najprawdopodobniej jest to spowodowane niepełnym zwilżeniem. Po 92 sekundowych impulsach o napięciu ośmiu woltów, nanopory są całkowicie mokre i zostały powiększone do średnicy 21 nanometrów.

Ponadto przewodność jest stabilna z niewielkim szumem o niskiej częstotliwości. Wykres gęstości widmowej mocy pokazuje, że amplituda szumu o niskiej częstotliwości niekondycjonowanego nalewania na niebiesko jest bardzo wysoka, co czyni go bezużytecznym w eksperymentach z pojedynczymi cząsteczkami. Po kondycjonowaniu silnymi polami elektrycznymi.

Moc szumów przy częstotliwościach od 10 do czterech herców jest zmniejszona nawet o trzy ody wielkości, dzięki czemu jest gotowa do czułego biomolekularnego. Eksperymenty detekcyjne do badań nad translokacją DNA. Upewnij się, że prąd o niskim poziomie szumów amplifier jest podłączony do elektrod.

Przed dodaniem próbki biomolekularnej do zbiornika. Zastosuj potencjał od dodatniego 150 do dodatniego 300 miliwoltów przez co najmniej dwie minuty. Wyświetl aktualną ścieżkę i sprawdź, czy nie ma blokad prądu jonowego, które są dowodem zanieczyszczenia.

Nie powinno być żadnych blokad, jak w tym śladzie. Uzyskaj dostęp do chipa i delikatnie dodaj 48,5 KILOBASE dwuniciowego DNA lambda po jednej stronie nanoporów, tak aby jego końcowe stężenie wynosiło od 0,5 do dwóch nanogramów na mikrolitr refluksu, delikatnie pipetując przez co najmniej 10 sekund, aby zapewnić jednorodne rozprowadzenie próbki w całym zbiorniku. Po dodaniu DNA umieść chip z powrotem w ekranowanej obudowie.

W przypadku nanoporów o grubości 30 nanometrów zastosuj potencjalne odchylenie od 150 do 300 miliwoltów do elektroforetycznego napędu ujemnie naładowanego DNA przez nanopory. Użyj oprogramowania do monitorowania prądu jonowego przez nanopory i wykrywania przejściowych blokad prądowych. Ze względu na translokację DNA, ślady prądu jonowego mogą być analizowane, aby wywnioskować więcej informacji o próbce DNA.

Nanopory poddane działaniu silnych pól elektrycznych są w pełni funkcjonalne, jak pokazano na tych śladach przewodnictwa pokazujących wykrywanie pojedynczych cząsteczek DNA lambda w górnej ścieżce. Dwuniciowe DNA jest przepuszczane przez nanopory, które zostały powiększone do 32 nanometrów. Dolny ślad dotyczy DNA przeprowadzonego przez nanopory powiększone do 11 nanometrów.

Zwróć uwagę na przerwę w skali przewodności. W każdym przypadku przewodność linii podstawowej jest wyjątkowo stabilna i nieskazitelna. Blokady przewodnictwa obserwuje się, gdy pojedyncze cząsteczki przemieszczają się przez nanopory.

Owady wykazują wiele dyskretnych poziomów blokady jako pojedyncze pofałdowane cząsteczki. Translokacja właściwości szumów o niskiej częstotliwości nanoporów zapewnia łatwe do rozdzielenia piki w tych histogramach przewodnictwa nanoporowego zarówno dla 32 nanometrów wylania powyżej, jak i 11 wylania poniżej trzech pików. Pierwszy odpowiada linii podstawowej bez DNA, drugi pojedynczej nici liniowej, a trzeci pofałdowanemu DNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować nanopory w stanie stałym do eksperymentów z wykrywaniem pojedynczych cząsteczek. Technika ta może znacznie zwiększyć wydajność eksperymentalną, ostatecznie sprawiając, że badania nanoporów w stanie stałym będą bardziej dostępne i wiarygodne w szerokim zakresie badań pojedynczych cząsteczek.