Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne generowanie nerwowych kultur komórek prekursorowych jako przylegających monowarstw lub neurosfer ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy. Osiąga się to poprzez usunięcie mózgu poszczególnych dorosłych myszy. Drugim krokiem jest mikrodysekcja strefy podkomorowej i obszarów zakrętu zębatego.

Następnie tkanka ulega dysocjacji na zawiesinę pojedynczej komórki. Ostatnim krokiem jest hodowla komórek prekursorowych jako przylegających monowarstw lub neurosfer. Ostatecznie test sfery nerwicowej i przylegający system hodowli jednowarstwowej są cennymi narzędziami do określania potencjału proliferacji lub różnicowania w dorosłych nerwowych komórkach macierzystych.

In vitro, Ta metoda pozwala nam odpowiedzieć na kilka bardzo interesujących pytań w dziedzinie neurogenezy dorosłych. Dzięki niemu możemy przyjrzeć się komórkom poszczególnych zwierząt i porównać je, co jest interesujące w kontekście patrzenia na indywidualne różnice, lub na przykład na różnice między indywidualnymi maskami transgenicznymi lub nokautującymi w porównaniu z ich kontrolami. Tara Walker, starszy naukowiec w mojej grupie, przedstawiłaby tę metodę przed sekcją mózgu.

Przygotuj wypolerowane ogniowo pipety ze średnimi i małymi knurami, obracając szklane pipety pastwiskowe w płomieniu, aż krawędzie staną się zaokrąglone. Następnie wysterylizuj je w autoklawie. Najpierw przenieś mózg na 10-centymetrową plastikową szalkę Petriego zawierającą PBS.

Umieść szalkę Petriego z mózgiem pod mikroskopem preparacyjnym w małym powiększeniu, z mózgiem umieszczonym na jego brzusznej powierzchni. Następnie użyj cienkich zakrzywionych kleszczyków, aby usunąć opuszki węchowe, trzymając móżdżek. Następnie obróć mózg w stronę grzbietową.

Wykonaj przecięcie koronalne przez mózg na poziomie skrzyżowania wzrokowego za pomocą skalpela, aby zmikrodysekcjonować SVZ. Przyłóż rostralną część mózgu do naczynia tak, aby przecięta powierzchnia koronowa była skierowana do góry. Pod większym powiększeniem usuń i wyrzuć przegrodę.

Następnie wypreparuj SVZ, który jest cienką warstwą tkanki otaczającą komorę, umieszczając końcówkę jednego ostrza drobno zakrzywionych kleszczy w bocznym rogu komory bocznej. Bezpośrednio pod ciałem modzelowatym i drugim ostrzem, około jednego milimetra w głąb tkanki bezpośrednio przylegającej do komory. Dociśnij kleszcze w kierunku podstawy naczynia i w kierunku brzusznej części komory, aby usunąć mały trójkątny kawałek tkanki.

Następnie umieść wypreparowany SVZ na szalce Petriego na lodzie, aby dokonać mikrodyssekcji miejsca DEG, rozpieszczonej części mózgu na szalce Petriego i przeciąć wzdłuż podłużnej szczeliny za pomocą skalpela pod mikroskopem preparacyjnym. Usuń móżdżek i barwnik cefalon. Ponownie ustawić ostrość mikroskopu tak, aby granice wokół DG były teraz widoczne.

Aby usunąć dg, włóż końcówkę igły o rozmiarze 27 i przesuń wzdłuż granicy między DG a klaksonem amen. Następnie uwolnij DG z otaczającej tkanki za pomocą cienkich kleszczy do dysocjacji tkanek SVZ. Miel tkankę za pomocą ostrza skalpela przez minutę, aż nie pozostaną żadne duże kawałki.

Następnie resus. Zawiesić tkankę mieloną za pomocą jednego mililitra Prewarm 0,05% tripów w EDTA. Następnie przenieś go do 15-mililitrowej probówki i inkubuj przez siedem minut w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza.

Aby zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodaj jeden mililitr inhibitora trypsyny zawierającego łabędzia DNA i wymieszaj zawartość, przesuwając probówkę. Następnie osadzać zawiesinę przez odwirowanie w temperaturze 300 g przez pięć minut i pozostawić bliznę. Sennett następnie ponownie zamieszaj granulki w jednym mililitrze pożywki wzrostowej i połącz ją z gli.

Pipetowanie w górę i w dół około 7 do 10 razy za pomocą pipety P 1000. Następnie dodaj pożywkę wzrostową do całkowitej objętości pięciu mililitrów i przepuść zawiesinę komórek przez sito o długości 40 mikrometrów, aby usunąć zanieczyszczenia i niepowiązane grudki tkanek. Następnie odwiruj go w temperaturze 300 g przez pięć minut.

Odrzuć supinat i reus. Zawiesić powstały osad w 200 mikrolitrach pożywki wzrostowej w celu dysocjacji tkanek DG. Miel tkankę za pomocą ostrza skalpela przez około minutę, aż nie pozostaną żadne duże kawałki.

Następnie przenieś tkankę mieloną do wstępnie podgrzanej mieszanki enzymów PDD. Inkubuj go przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i mieszaj, odwracając probówkę co trzy do pięciu minut. Następnie należy mechanicznie rozdzielić tkankę, delikatnie pipetując ją w górę i w dół 10 razy za pomocą polerowanej pipety pastwiskowej o średnim otworze, a następnie inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i mieszać, przesuwając probówkę co trzy do pięciu minut. Dalej.

Oddziel tkankę mechanicznie, delikatnie pipetując ją w górę iw dół 10 razy za pomocą małej, wypolerowanej pipety do pastwiska. Następnie odwiruj go w temperaturze 130 g przez pięć minut. Następnie usunąć supinat i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze roztworu buforowego.

Uzupełnić do 10 mililitrów roztworem buforowym. Po odwirowaniu w temperaturze 130 GS przez pięć minut. Usunąć supernatant S i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach po 20% na wywołanie.

Następnie odwirować go w temperaturze 450 GS przez 15 minut. Usunąć snat i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach buforu. Na koniec odwirować w 130 GS przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach pożywki wzrostowej dla przylegających kultur, umieścić 200 mikrolitrów komórek w każdym dołku A PDL Lamin ENC coated 96 Well plate do kultur sphe rozcieńczyć go wzrostem, podłożem do 20 mililitrów i płytką 200 mikrolitrów na studzienkę na niepowlekanej płytce 96-dołkowej, a następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 po sześciu do 12 dni liczą i mierzą średnicę neurosfer za pomocą gradi IP zamontowanego w pionowym mikroskopie świetlnym.

Rysunek ten pokazuje, że dorosłe mysie komórki prekursorowe mogą być hodowane jako przylegające kultury jednowarstwowe lub jako neurosfery w SVZ i dg. Obserwuje się, że SVZ generuje znacznie więcej neurosfer w porównaniu z DG pojedynczych myszy, a komórki prekursorowe SVZ i DG również reagują inaczej na depolaryzację in vitro, aby potwierdzić długoterminowe wzmocnienie. Wykazano, że neurosfery rozszerzyły się przez 10 przejść.

Neurosfery można różnicować na beta trzy neurony tubulinowo-dodatnie, jak pokazano na czerwono, astrocyty GFAP dodatnie na zielono, O cztery dodatnie oligodendrocyty na czerwono i mapować dwa neurony AB-dodatnie na czerwono. Można przeprowadzić inne metody, takie jak pakowanie komórek lub neurosfer przez kilka pokoleń lub różnicowanie neurosfer, a następnie analiza histologiczna. Pomoże to odpowiedzieć na dalsze pytania, takie jak wielopotencjał i potencjał długoterminowy.