Przystępna cenowo metoda monitorowania oporności na leki HIV-1 w warunkach ograniczonych zasobów

Lekooporność wirusa HIV może zniweczyć postęp w wysiłkach na rzecz opanowania epidemii HIV. Dlatego ważne jest, aby w sposób ciągły badać i monitorować oporność na leki u pacjentów wcześniej nieleczonych i u pacjentów, u których leczenie zakończyło się niepowodzeniem. Niestety, większość obecnie stosowanych metod jest kosztowna we wdrożeniu, zwłaszcza w kontekście skali epidemii HIV w Afryce Subsaharyjskiej.

W tym miejscu demonstrujemy tanią i ogólnodostępną metodę genotypowania oporności na leki HIV. Protokół ten podzielony jest na cztery etapy. Ekstrakcja RNA, najlepsza transkrypcja i sekwencjonowanie PCR oraz bioinformatyka.

H-I-V-R-N-A jest ekstrahowany przy użyciu zestawu wirusowego RNA KaiGen. Metoda wykorzystuje kolumny do wychwytywania i oczyszczania wytrąconych osadów. RNA na tym etapie zawsze obejmuje kontrole pozytywne i negatywne.

Przed rozpoczęciem oblicz objętości każdego z wymaganych regionów. W przypadku liczby przetwarzanych próbek zaleca się, aby zawsze dodawać kontrolkę regionu. Oprócz wyekstrahowanych kontroli dodatnich i ujemnych, przygotuj mieszankę starterów DNTP, dodając 0,5 mikrolitra startera RT 21 i 0,5 mikrolitra mieszanki DNTP do czystej sterylnej probówki PCR o pojemności 200 mikrolitrów, a następnie krótko.

Do opodatkowania przygotuj mieszankę enzymów t, dodając jeden mikrolitr 10-krotnego buforu, jeden mikrolitr 3,1-molowego DTT i dwa mikrolitry 25 milimolowego. Chlorek magnezu do sterylnej probówki dodać 0,5 mikrolitra każdego z enzymów, RNA na zewnątrz i s skrypt. Trzy, odwrotne transkrypty do probówki z mieszanką enzymów, a następnie delikatne mieszanie.

Trzymaj probówki z mieszankami starterów typu dent p i mieszanką enzymów na bloku kodu i przenieś do torów stacji RNA RNA do probówki DNTP prima mix. Po dodaniu RNA przenieś się do pomieszczenia PCR ze wszystkimi probówkami na bloku karty i ukryj pierwotną mieszankę RNA DNTP i umieść je w cieple termocyklera. Wyklucz pięć stopni Celsjusza na pięć minut i szybko schłodzić do czterech stopni Celsjusza.

Przytrzymaj przez dwie minuty. Zatrzymaj termocykler podczas dwóch w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyjmij probówki i dodaj pięć mikrolitrów mieszanki enzymatycznej, delikatnie trzymając probówki na bloku kodu, wymieszaj, a następnie krótko odwiruj i wróć do termocyklera.

Trzymaj probówki w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 60 minut, a następnie osiem w temperaturze pięciu stopni Celsjusza przez pięć minut. Schłodzić do 37 stopni Celsjusza. I zatrzymaj się, gdy tylko osiągnie tę temperaturę.

Szybko wyjmij probówki z termocyklera. Dodaj otwarte pięć mikrolitrów RNA krawędzi do probówek i przywróć cykl termiczny. Przytrzymaj 37 stopni Celsjusza przez 20 minut, a następnie zakoduj cztery stopnie Celsjusza przed rozpoczęciem.

Obliczyć objętość każdego z wymaganych regionów wraz z liczbą przetwarzanych próbek i kontrolami oprócz trzech kontroli, dodatniej, ujemnej i odczynnika. Możesz również dodać kontrolę PCR w pierwszej i drugiej rundzie. Mieszanki PCR mogą być przygotowywane jednocześnie i druga mieszanka główna.

Po trzecie, przy ujemnych źródłach stopni kredytowych, dopóki nie będzie to potrzebne. Mieszanki można przechowywać do ośmiu godzin. Dodaj wodę 10 razy bufor, chlorek magnezu, DTP i startery do ust pokazanych w tabeli.

I wir. Dodaj 0,1 mikrolitra polimerazy z platynową etykietą i delikatnie wymieszaj wczesne 23 mikrolitry mieszanki głównej z 200 mikrolitrowymi probówkami PCR z probówkami do mieszania głównego na bloku sznurka. Przenieś się do sali PCR.

Dodaj dwa mikrolitry CDNA do 23 mikrolitrów pierwszej rundy mieszanki głównej PCR. Zamknij probówki, umieść próbki w termocyklerze i uruchom program PCR kontynuowany. Druga runda PCR lub przechowuj produkty pierwszej rundy PCR w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub niższej, aż będzie to wymagane.

W przypadku drugiej rundy PCR dodaj dwa mikrolitry produktu pierwszej rundy PCR do 23 mikrolitrów głównej mieszanki PCR drugiej rundy i użyj tego samego programu PCR do oceny amplifikacji PCR. Wykonaj elektroforezę 1%a 800 woltów i 400 słów przez 40 minut. Wzmocnienie dodatnie można zwizualizować jako 1,315 podstawy na fragment.

W ramach przygotowań do reakcji sekwencjonowania nie powinno być amplifikacji w próbie ujemnej i odczynnikowej. Dodatnie produkty drugiej rundy PCR są oczyszczane. Korzystając z zestawu do oczyszczania pure link PCR, dodaj 80 mikrolitrów buforu wiążącego do 20 mikrolitrów produktu PCR i wymieszaj pipety.

Dodaj próbkę zmieszaną z buforem do gięcia do czystej kolumny wirowej w probówce zbiorczej. Odwirować kolumnę przy 10 000 RCF przez jedną minutę. Przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej.

Przemyć kolumnę 650 mikrolitrami wirówki buforowej do mycia. Kolumna o prędkości 10 000 r oszczędza na jedną minutę. Przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej.

F kolumny, jej maksymalną prędkość przez dwie do trzech minut. Umieść kolumnę wirującą w czystej 1.7 mililitrowej rurce elucjańskiej. Dodać 40 mikrolitrów buforu elucjańskiego do środka kolumny i inkubować kolumnę w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.

Odwirować kolumnę z maksymalną prędkością przez dwie do trzech minut. Probówka wyjaśniająca zawiera oczyszczony produkt PCR gotowy do sekwencjonowania. Odrzuć kolumnę.

Produkty PCR są sekwencjonowane przy użyciu dużego zestawu terminatora D w wersji 3.1 i czterech starterów dla każdej próbki dla każdego ze starterów. Ustaw reakcje sekwencjonowania zgodnie ze wskazaniami w tabeli. Delikatnie wymieszaj mieszankę główną, wcześnie atakując rurki.

Złapano dziewięć mikrolitrów mieszanki głównej na 96-cylindryczną płytę koła. Na jednej płytce zostaną pobrane 24 próbki. Możesz użyć poniższego układu, w którym każda kolumna mieści dwie próbki i jeden mikrolitr próbki DNA.

Przykryj płytkę i delikatnie mieszaj wirówkę w 3000 RCF przez jedną minutę. Umieść płytkę na termocyklerze i uruchom program cykliczny po zakończeniu PCR. Natychmiast wyczyść produkt do sekwencjonowania.

Produkty uboczne reakcji sekwencjonowania, a także nadmiar zanieczyszczeń mogą zakłócać elektroforezę sekwencjonowania. Dlatego ważne jest, aby oczyścić produkty sekwencjonowania w celu usunięcia nadmiaru przesłanek i zawartych w nich soli terminatorów d i enzymów przed załadowaniem próbek do automatycznej elektroforezy sekwencjonowania fluorescencyjnego DNA. Zastosowana tutaj metoda to prosty protokół ASCE etanolu sodu dla każdej reakcji sekwencjonowania wytwarza 50 mikrolitrów absolutnego etanolu i pięć mikrolitrów trzymolowego kwasu sodowego.

Korzystając z przygotowanego wielokanałowo, dodaj do każdego z nich pięć mikrolitrów roztworu etanolu kwasu sodowego. Dobrze uszczelnij studzienki folią samoprzylepną, upewniając się, że każda studzienka jest prawidłowo zszyta i wiruj, aby wymieszać wirówkę przy 3000 RCF przez 20 minut. Po 20 minutach zdejmij pokrywę i jednym płynnym ruchem nanieś płytkę na chusteczkę do przodu.

Fugetuj odwróconą płytkę przy 150 RC przez dwie minuty, natychmiast dodaj 150 mikrolitrów etanolu kodowego, aby nie opóźniać dodawania etanolu na tym etapie, uszczelnij tą samą samoprzylepną osłoną foliową i wiruj przy 3000 RCF przez pięć minut. Odwrócić złożoną chemoterapię naprawczą i odwirować odwróconą płytkę o temperaturze 150 RCF przez jedną minutę po ifikacji, umieścić odkryte w termocyklerze i wysuszyć w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Po wyschnięciu uszczelnij miejsce samoprzylepnymi foliowymi osłonami, zawiń w folię i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i do momentu, gdy będzie gotowe do przystąpienia do sekwencjonowania elektroforezy.

Gdy będziesz gotowy do sekwencjonowania, rozpuść infor amid, denaturuj i załaduj do analizatora genetycznego 31 30 w celu elektroforezy. Uruchom program genius. Utwórz folder roboczy w dokumentach lokalnych do przechowywania sekwencji.

Zaimportuj pliki A BF wygenerowane przez maszynę sekwencjonującą do genialnego folderu roboczego. Korzystanie z narzędzia do importu genius przydzieli procentowe oceny jakości dla każdej sekwencji Zaimportowane otwarte sekwencje z wynikami jakości większymi niż 70%Klikając je dwukrotnie, każdy plik powinien otworzyć się w nowym oknie. Genius wskaże jakość każdej pozycji nukleotydu w sekwencji za pomocą jasnoniebieskiego brzęczenia.

Im wyższa poprzeczka, tym lepsza jakość najlepszego wyniku. Za pomocą er wybierz środkową część sekwencji, pomijając końce. Kliknij przycisk wyodrębniania, aby wyodrębnić region z sekwencją wysokiej jakości.

Wybierz wszystkie cztery wyodrębnione sekwencje dla każdej próbki i zbierz je z sekwencją referencyjną z adnotacjami. Sprawdź zmontowaną sekwencję, aby upewnić się, że znajdujesz się we właściwej ramce odczytu. Jeśli znajdujesz się we właściwej ramce odczytu, początek proteazy podtypu c powinien zaczynać się od poniższych. Amen.

Kwasy P-Q-I-L-W-T. Początek RT rozpocznie się od wyodrębnienia P-I-S-P-I-A obszaru CONT obejmującego początek do 300. przewodu RT. Podczas tego procesu sprawdź również, czy nie ma wstawień lub usunięć.

Zapoznaj się z sekwencją konsensusu wyodrębnionych conti, identyfikując wszelkie niejasności i weryfikując pozycje z mieszanymi podstawami, sprawdzając jakość symetrii, wysokości, tła i ramion obszarów flankujących podstawę. Wybierz sekwencję konsensusu i kliknij przycisk wyodrębniania, aby utworzyć oddzielny plik sekwencji konsensusu wygenerowanej na podstawie czterech przesłanek i odpowiednio go oznaczyć. Uwidocznij sekwencję w folderze przechowywania kopii zapasowej na komputerze lub w sieci.

Przeanalizuj sekwencje za pomocą program@hivdb.stanford.edu H HIV V DB. Sprawdź usunięcia i w sesjach na danych ARI w tym. Sekwencja obejmuje wszystkie 99 kodów protestu w fazie 300 kodów RT.

Sprawdź, czy w obu protestach w regionach RT nie ma wyróżnionych problemów z kontrolą jakości, takich jak kody główne, przesunięcia klatek, niejednoznaczne pozycje i nietypowe pozostałości, a także nowa sekwencja względem lokalnej bazy danych sekwencji z poprzednich przebiegów. Jeśli nowa sekwencja jest większa niż 97%podobna do dowolnej sekwencji w bazie danych, należy przejrzeć wszystkie etapy protokołu. Zaczynając od analizy sekwencji, wracając do ekstrakcji RNA, aby upewnić się, że nie doszło do pomieszania lub zanieczyszczenia.

Jeśli nie zostaną zidentyfikowane żadne problemy, należy ponownie zsekwencjonować zarówno stare, jak i nowe próbki, jeśli sekwencje są nadal podobne w ponad 97%. Przejrzyj historię pacjenta, aby ocenić wszelkie powiązania epidemiologiczne między pacjentami. Jest to również kolejne narzędzie wysokiej jakości, które służy do identyfikacji zanieczyszczeń.

Proste pomieszanie lub próbki od pacjentów powiązanych epidemiologicznie. Wyrównaj wszystkie sekwencje z bazy danych za pomocą programu Cluster W. Pomysłowe ręczne sprawdzanie wyrównania pod kątem niewyrównanych sekwencji, usunięć oraz w sesjach i odpowiednio edytuje.

Zbuduj drzewo filogenetyczne za pomocą Genius three builder lub innych pomysłowych budowniczych drzew. Zbadaj drzewo pod kątem próbek o krótkiej długości gałęzi. Przejrzyj próbki z krótkimi odgałęzieniami pod kątem możliwego zanieczyszczenia.

Zaloguj się do REGAR DB przy użyciu unikalnej nazwy użytkownika i hasła z menu rozwijanego. W obszarze identyfikator pacjenta wybierz pozycję rozpoczynającą się od identyfikatora pacjenta i wybierz w menu pacjenta, którego sekwencja ma być oklaskiwana. Po prawej stronie wybierz izolat wirusa z opcji w obszarze wirus wybierz dodaj.

Wprowadź daty próbki, identyfikator próbki, identyfikator sekwencji i datę sekwencjonowania. Wybierz wybierz plik, a następnie przejdź do szybszego pliku, aby otrzymać oklaski. Po wybraniu szybszego pliku, który ma być oklaskiwany, kliknij na oklaski.

Gdy oklaskiwana sekwencja pojawi się w polu CLE, kliknij przycisk OK w prawym dolnym rogu okna. Sprawdź, czy w rt. nie ma produktów Wyrównanie doniczki, klikając białko i wybierając PR lub rt.

Sprawdzić, czy nie ma mutacji oporności na leki, korzystając ze wzorca oporności. W ten sposób uzyskano profile oporności z trzech algorytmów: A NRS, Stanford, HIV DB i rega db. Kliknij zakładkę raporty o izolacie wirusa.

Wybierz algorytmy interpretacji genotypu i szablony raportów, które mają być używane. Po wybraniu algorytmu i szablonu kliknij typy generyczne. Pobierz wygenerowany dokument RTF.

Otwórz dokument RTF jako dokument Word. Wyrecytuj tabelę historii leczenia po wykresie, A, sekcja Karta kliniczna i interpretacja oporności. Dodaj opis historii leczenia pacjenta i profilu oporności wirusa.

Dodaj również opis wiremii pacjenta i profile CD four. Wyślij raport, aby dodać specjalistę do wglądu i zaleceń dotyczących przyszłego postępowania z pacjentem. Zmniejszenie całkowitego kosztu tego protokołu osiągnięto dzięki czterem różnym strategiom.

Pierwszym z nich było zmniejszenie objętości reakcji na prawie każdym etapie, co pozwoliło na bardziej efektywne wykorzystanie odczynników, ale jednocześnie utrzymanie jakości sekwencji. Po drugie, redukcja starterów sekwencjonowania. Większość protokołów wykorzystuje od sześciu do ośmiu starterów do sekwencjonowania słabego regionu pokrywającego gen białka w pierwszej trzeciej części genu odwrotnego transkryptu, zestawu czterech starterów lub wybranych do sekwencjonowania tego samego regionu bez uszczerbku dla jakości końcowej sekwencji, zmniejszając w ten sposób etap sekwencjonowania spowodowany o co najmniej jedną trzecią.

Po trzecie, wykorzystanie w większości bezpłatnego oprogramowania i programów o otwartym dostępie do analizy umiejętności i generowania raportów pozwoliło na dalszą redukcję kosztów. I wreszcie rokowania zbiorowe i partnerstwa publiczno-prywatne. Wynegocjowano obniżoną cenę, która pozwala członkom Południowoafrykańskiej Sieci Leczenia i Oporności na uzyskanie zniżek na wszystkie elementy tego protokołu.

Dotyczyły one również zestawu do jego dostępu.