Analiza stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest jakościowy i ilościowy pomiar stresu oksydacyjnego w żywych zarodkach danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez dodanie roztworu utleniającego do przygotowanych zarodków w celu indukcji stresu oksydacyjnego lub poprzez utworzenie brzegu rany na płetwie ogonowej zarodka. Zarodki są następnie przetwarzane w celu wykrycia stresu oksydacyjnego metodą jednokomórkową lub metodą całego montowania.

Następnie preparaty są inkubowane za pomocą sondy wykrywającej Rossa. Wyniki mogą pokazać wielkość stresu oksydacyjnego i poziom Rossa na podstawie mikroskopii konfokalnej otworów lub analizy metrycznej cytofluoro pojedynczych komórek. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak immuno Fluor dla markerów stresu tlenowego, jest to, że umożliwia ona surowe wykrywanie w kontekście żywego organizmu i kwantyfikację na poziomie pojedynczych tkanek.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań podstawowych, takich jak badanie warunków stresu oksydacyjnego w kontekście stanu patologicznego. Osoby, które dopiero zaczynają być przyjmowane, mogą zmagać się z przypadkowym uszkodzeniem tkanek, ponieważ surowe, wrażliwe sondy molekularne mogą być nieplanowanym źródłem kwasowości. A ponieważ wysoki poziom stresu oksydacyjnego musi prowadzić do śmierci komórki, podczas gdy zbyt mały może być trudny do wykrycia w praktyce i eksperymentach, problemy te wynikną same Podczas przygotowywania roztworu do wywoływania stresu oksydacyjnego w mitochondriach składających się z zgnilizny znanej w DMSO, należy go przygotować ze znanym zapasem zgnilizny w stężeniu od pięciu do 50 mikromolów i nigdy powyżej 100 mikromolowych zgnilizny, o której wiadomo, że jest toksyczny i niebezpieczny.

Zwróć uwagę na oznaczone środki ostrożności. Roztwór sondy do wykrywania otworów Rossa nie powinien być narażony na działanie światła ani tlenu podczas jego przygotowania i musi być przygotowany na świeżo do metody wykrywania Rossa z pojedynczą komórką. Roztwór zatrzymujący FBS w PBS musi być przygotowany i przechowywany w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Inne przygotowania obejmują ustawienie inkubatora powietrza danio pręgowanego na 28 stopni Celsjusza, a w przypadku metody jednokomórkowej schłodzenie wirówki do czterech stopni Celsjusza. Wykonuje się krzyżówki danio pręgowanego, pobieranie zarodków i znieczulenie. Stosując standardową metodologię, należy pobrać interesujące nas zarodki między 48 a 72 godzinami po zapłodnieniu.

Po znieczuleniu zarodki dwukrotnie wypłucz środek znieczulający, a następnie załaduj zarodki do trzech naczyń po nie więcej niż 30 na miskę w celu wykrycia surowej komórki pojedynczej. Zbierz co najmniej 35 zarodków na stan w wielu naczyniach. Następnie zastosuj 10 mililitrów roztworu utleniacza lub jako kontrolę ujemną.

Zastosuj 10 mililitrów wody, a następnie odczekaj od 10 do 60 minut, aż zarodki będą inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Podgrzej również HBSS do 28 stopni Celsjusza do prania. Po inkubacji przenieś zarodki do nowego naczynia z ciepłym HBSS i zawiruj.

Następnie kontynuuj wykrywanie całego montażu lub pojedynczej komórki Rossa. Bardziej fizjologiczną opcją jest generowanie stresu po uszkodzeniu tkanek za pomocą techniki zraniania płetwy ogonowej opisanej przez NI Tomer i spółkę. Po poddaniu działaniu utleniaczy przenieś grupy do 10 zarodków do małych probówek.

Opłucz je mocno HBSS i zabezpiecz przed światłem folią. Następnie dodaj mililitr surowego roztworu detekcyjnego do każdej probówki i inkubuj probówki przez 15 minut w temperaturze 28 stopni Celsjusza podczas inkubacji. Przygotować szkiełko podstawowe tak, aby zawierało zarówno warunki kontrolne, jak i doświadczalne.

Przykryj szkiełko depresyjne 300 mikrolitrami metylocelulozy. Nie wytwarzaj pęcherzyków podczas wyrzucania metylocelulozy. Po inkubacji zarodków szybko zastąp roztwór w probówkach dwoma mililitrami HBSS i kilkakrotnie odwróć probówki, aby umyć zarodki.

Następnie zassać zarodki do końcówki mikropipety i delikatnie wysunąć je do leczonego szkiełka. Zorientuj zarodki za pomocą cienkiej nylonowej żyłki i kontynuuj analizę za pomocą fluorescencyjnego lub konfokalnego mikroskopu skaningowego. Pamiętaj, aby przeanalizować wszystkie zarodki w tych samych ustawieniach.

Przenieś zarodki z mycia HBSS do nowego naczynia, usuwając jak najwięcej roztworu. Teraz ręcznie usuń powłokę z zarodków. Jest to naprawdę konieczne, aby rozdzielić zarodki na pojedyncze komórki.

Następnie przenieś zarodki do 24-dołkowej płytki, załaduj 15 zarodków do każdej. Dobrze optymalnie wypełnij trzy studzienki dla każdego stanu. Następnie usuń cały roztwór i zastąp go 300 mikrolitrami HBSS, 30 mikrolitrami kolagenazy p i 50 mikrolitrami trypsyny EDTA.

Za pomocą jednomililitrowej końcówki do pipety homogenizować zarodki za pomocą trieru. Po przygotowaniu wszystkich studzienek przenieś płytkę do 28 stopni Celsjusza na co najmniej 20 minut co pięć minut, trytować próbki, aby zapewnić dobrą homogenizację. Połóż również kilka mikro probówek fuge na lodzie, aby zebrać chusteczki, gdy będą gotowe.

Po 20 minutach należy pobrać próbkę i sprawdzić, czy tkanka została rozłożona na zawiesinę pojedynczej komórki pod mikroskopem. Jeśli nie, kontynuuj inkubację łącznie do 30 minut. Gdy tkanka jest gotowa, zatrzymaj reakcję dodatkowymi 200 mikrolitrami roztworu zatrzymującego.

Wymieszaj to z TRI za pomocą jednomililitrowej końcówki do pipety. Następnie przenieś zawartość każdej studzienki do wstępnie schłodzonej mikrorurki fuge i trzymaj te probówki na lodzie z dala od światła. Następnie odwirować próbki w temperaturze 250 GS przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

A następnie usuń supernatant przez aspirację. Ponownie zawiesić osad komórek w lodowatym HBSS z delikatnym tri i sprawdzić, czy zawiesina ma co najmniej 2 miliony komórek. Następnie ponownie zawieś ogniwa w mililitrze surowego, wrażliwego roztworu sondy.

Inkubuj je w temperaturze pokojowej i w ciemności przez około trzy minuty. Dostosuj ten czas inkubacji empirycznie. Następnie przenieś komórki do lamp faksowych osłoniętych przed światłem.

Kontynuuj analizy faksem w celu wykrycia markera transgenicznego. Fluorescencja i fluorescencja sondy Rossa Podczas analizy. Zawsze obliczaj poziomy strat wraz ze wzrostem krotności w porównaniu z próbkami kontrolnymi, aby znormalizować fluorescencję tła.

Wszystkie detekcje z Mount Ross wykorzystano do zbadania akumulacji nadtlenku wodoru w miejscu rany. Nienaruszone i uszkodzone ogony porównano po 20 minutach leczenia utleniaczem. W obu warunkach wykryto sygnał niespecyficzny.

Ten sam eksperyment z wstępnym traktowaniem zarodków w celu obniżenia poziomu nadtlenku wodoru. Użycie inhibitora OX VAs 28, 70 ujawniło, że wykryte sygnały były rzeczywiście zależne od akumulacji zgnilizny Rossa. Znane leczone zarodki były również badane na całym wierzchowcu.

W dużym powiększeniu można było zidentyfikować obszary anatomiczne. To wytworzyło Rossa, jak wskazano na podstawie fluorescencji zliczania dodatnich komórek Rossa za pomocą faksu, przeprowadzono w celu wykrycia pojedynczej komórki Rossa. Analiza ta została przeprowadzona bez uwzględnienia martwych komórek. Kontrola.

Przeanalizowano również komórki bez leczenia. Porównanie tych wyników sprawiło, że kwantyfikacja akumulacji Rossa była bardzo łatwa. Test doskonale nadaje się do testowania dowolnej liczby manipulacji eksperymentalnych.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 90 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Nie zapominaj, że praca z sondami molekularnymi może być niezwykle niebezpieczna i prekurencja. Takie użycie rękawiczek powinno być zawsze przestrzegane podczas wykonywania tego zabiegu.