Name: Analiza stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Poznaj metodę pomiaru stresu oksydacyjnego w żywych zarodkach Danio rerio z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i analizy cytofluorymetrycznej. Technika umożliwia jakościową i ilościową detekcję ROS na poziomie całych tkanek i pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie w laboratorium Massimo Santoro pochodzi od HFSP, Marie Curie Action, Telethon i AIRC. Dziękujemy Dafne Gays i Emiliano Panieri za krytyczną lekturę manuskryptu.

1. Przygotowanie instrumentów i roztworów roboczych
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór wodny dla ryb. Przygotować roztwór podstawowy, rozpuszczając 2 g soli morskiej "Instant Ocean" w 50 ml wody destylowanej. Dodać 1,5 ml bulionu rybnego do 1 l wody destylowanej, aby przygotować gotową do użycia wodę dla ryb (końcowe stężenie 60 μg/ml soli morskich). Autoklaw gotowej do użycia wody dla ryb przed użyciem. Roztwór ten jest stosowany jako pożywka dla zarodków danio pręgowanego.</li>
	<li>Przygotować metylocelulozę do montażu zarodka. Rozpuścić 1,5 g metylocelulozy w 50 ml sterylnej wody dla ryb. Ułatw rozpuszczanie za pomocą magnesu umieszczonego na płytce mieszającej. Całkowite rozpuszczenie proszku może zająć kilka godzin. Sprawdzić klarowność roztworu i podzielić go na małe probówki. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez wiele miesięcy i rozmrozić porcje po użyciu. Odwirować metylocelulozę przy 950 x g przez 5 minut przed użyciem. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania podwielokrotności.</li>
	<li>Przygotować 50 ml soli metanosulfonianu trikainy/3-aminobenzoesanu etylu (roztwór podstawowy), rozpuszczając 200 mg tricainy w 100 ml wody i dostosować pH do 7,0 za pomocą Tris-HCl 1 M (pH 9). Przechowywać ten bulion w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 30 dni. UWAGA: trikaina jest toksyczna. Stosować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z produktem.</li>
	<li>Wywoływanie stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór utleniacza do ogólnej indukcji stresu oksydacyjnego: Przygotować 50 ml roztworu utleniacza, dodając roztwór podstawowyH2O2(nadtlenek wodoru; 100 mM) do wody dla ryb. UżyćH2O2o końcowym stężeniu od 2 mM do 100 μM. Przygotować ten roztwór na krótko przed użyciem. Roztwór utleniacza może być stosowany zarówno do wykrywania ROS w całej instalacji, jak i do wykrywania ROS w pojedynczych komórkach. Nie przechowuj tego roztworu. UWAGA:H2O2jest niebezpieczny i szkodliwy przez drogi oddechowe i po połknięciu. Kontakt z materiałem palnym może spowodować pożar. Przechowywać pod wyciągiem i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
		<li>Przygotować roztwór utleniacza do indukcji stresu oksydacyjnego pochodzącego z mitochondriów: Przygotować roztwór podstawowy utleniacza (5 mM), rozpuszczając 3,9 mg rotenonu w 2 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Przechowywać ten roztwór w temperaturze pokojowej w ciemności.
		<ol>
			<li>Rozpuścić roztwór podstawowy rotenonu w 10 ml wody dla ryb, aby uzyskać roztwór gotowy do użycia. Stosować rotenon w stężeniu od 5 do 50 μM. Nie należy stosować rotenonu w stężeniach wyższych niż 100 μM. W odpowiednich stężeniach ten roztwór utleniacza może być stosowany zarówno do wykrywania ROM w całej instalacji, jak i do wykrywania ROM w pojedynczych komórkach. UWAGA: Rotenon jest toksyczny i niebezpieczny. Postępuj zgodnie z odpowiednimi zwrotami środków ostrożności.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Indukuj stres oksydacyjny przez knock-down: Knock-down ekspresja genu nrf2a w zarodkach danio pręgowanego przez mikroiniekcję morfolino, jak wcześniej zgłoszono przez Timme-Laragy A. i in., 201238.</li>
		<li>Indukuj stres oksydacyjny po uszkodzeniu tkanki: wygeneruj brzeg rany na płetwie ogonowej zarodków danio pręgowanego przy 72 hpf, jak wcześniej opisali Niethammer i wsp., 200939.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 5 ml roztworu do wykrywania ROM do metody wykrywania ROM w pojedynczych komórkach:
	<ol>
		<li>Rozwiązanie do ogólnego wykrywania ROS: Rozpuść generyczną sondę molekularną wrażliwą na ROS w HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanksa) w celu przygotowania roztworu roboczego (zakres stężeń: 2,5-10 μM). Roztwór ten należy przygotować na krótko przed użyciem.</li>
		<li>Rozwiązanie do specyficznego wykrywania ROS indukowanego przez mitochondria: Na krótko przed użyciem rozpuść mitochondrialną sondę wrażliwą na ROM za pomocą DMSO, tworząc roztwór podstawowy o stężeniu 5 mM. Rozpuścić roztwór podstawowy w HBSS w celu przygotowania roztworu roboczego (zakres stężeń: 2,5-10 μM). 
		UWAGA: Unikaj ekspozycji na światło i tlen roztworów roboczych do wykrywania ROS i ich odpowiednich roztworów podstawowych. Chroń rurkę przed światłem za pomocą folii aluminiowej. Nie przechowywać ani nie używać ponownie sond rozpuszczonych w HBSS. Roztwory podstawowe przechowywać w temperaturze -20 °C przez miesiąc. 
		UWAGA: Z sondami molekularnymi i DMSO należy obchodzić się pod wyciągiem zgodnie z odpowiednimi wytycznymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 5 ml roztworu do wykrywania ROS dla całej metody wykrywania ROS podczas montażu: Rozpuścić ogólny roztwór podstawowy sondy wrażliwej na ROS (ustabilizowany w DMSO) w HBSS w celu przygotowania roztworu roboczego (zakres stężeń: 2,5-5 μM). Unikaj ekspozycji na światło i tlen. Chroń rurkę przed światłem. Przygotuj ten roztwór przed użyciem. Nie przechowuj ani nie używaj ponownie tego roztworu. UWAGA: Z sondami molekularnymi należy obchodzić się pod wyciągiem zgodnie z odpowiednimi wytycznymi.</li>
	<li>Przygotować 25 ml roztworu zatrzymującego, dodając 10 ml płodowej surowicy bydlęcej do 15 ml PBS 1x. Utrzymuj roztwór w sterylnej formie. Przechowywać ten roztwór w temperaturze 4 °C. To rozwiązanie jest wymagane tylko dla pojedynczej komórki - metoda detekcji ROS.</li>
	<li>Ustawić inkubator powietrza danio pręgowanego na temperaturę 28 °C.</li>
	<li>Ustawić wirówkę na 4 °C dla metody wykrywania ROM w jednej komórce.</li>
</ol>
2. Krycie dorosłych ryb i selekcja zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Ustaw krzyżówki par dorosłych danio pręgowanego zgodnie ze standardowymi protokołami40. Wybierz odpowiednią linię transgeniczną zgodnie z konkretnymi potrzebami eksperymentalnymi.</li>
	<li>Zbierz jaja i umieść je w naczyniu o średnicy 90 mm z wodą rybną/pożywką z zarodków. Jaja należy przechowywać w temperaturze 28 °C, aż zarodki rozwiną się i osiągną pożądany etap rozwoju (np. 48 hpf, 72 hpf; hpf: godziny po zapłodnieniu).</li>
	<li>Badanie przesiewowe w kierunku rozwijających się zarodków. Wyklucz wszystkie niezapłodnione jaja lub słabo rozwinięte zarodki.</li>
	<li>Znieczulenie zarodków należy dodać 1 ml trikainy (roztwór podstawowy) do 50 ml wody dla ryb.</li>
	<li>Wybierz fluorescencyjne zarodki Tg pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
</ol>
3. Leczenie zarodków utleniaczem
<ol>
	<li>Użyj co najmniej 30 zarodków o stężeniu od 48 hpf do 72 hpf na różne warunki. Umyj zarodki dwukrotnie świeżą wodą rybną w celu usunięcia tricainy.</li>
	<li>Podziel fluorescencyjne zarodki na trzy naczynia. Umieść nie więcej niż 30 zarodków na naczynie.</li>
	<li>Usunąć roztwór myjący i dodać 10 ml roztworu utleniacza lub 10 ml wody dla ryb jako roztwór kontrolny.</li>
	<li>Inkubować zarodki przez 10 minut do 1 godziny w temperaturze 28 °C. Okres inkubacji zależy od poziomu stresu oksydacyjnego, który ma być wywołany w określonych tkankach. Krótkie okresy są najlepsze, ponieważ komórki dotknięte stresem oksydacyjnym stopniowo ulegają śmierci komórkowej.</li>
	<li>Przenieś zarodki do nowego naczynia zawierającego HBSS i umyj zarodki przez wirowanie. Wstępnie podgrzany HBSS w temperaturze 28 °C.</li>
</ol>
4. Metoda wykrywania ROS całego montażu
<ol>
	<li>Zbierz zarodki po leczeniu utleniaczem i umieść nie więcej niż 10 zarodków w małej probówce. Spłucz HBSS tak bardzo, jak to możliwe. Chroń rurkę przed światłem za pomocą folii aluminiowej.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu do wykrywania ROS do każdej probówki.</li>
	<li>Inkubować zarodki w ciemności przez 15 minut w temperaturze 28 °C, aby uniknąć ekspozycji na światło.</li>
	<li>W czasie inkubacji należy przygotować szkiełko podstawowe do analizy całego zarodka. Umieść 300 μl metylocelulozy na szkiełku szkiełkowym "wgłębnym" i rozprowadź na powierzchni szkła za pomocą końcówki pipety. Unikaj pęcherzyków podczas uwalniania metylocelulozy.</li>
	<li>Pod koniec czasu inkubacji natychmiast usunąć roztwór wykrywający ROS i przemyć dwukrotnie 2 ml HBSS. Umyj zarodki, kilkakrotnie odwracając rurkę. Nie pipetować ani nie wirować.</li>
	<li>Odessać zarodki do szklanej pipety Pasteura. Umieść zarodki w pobliżu otworu pipety i delikatnie wyrzuć je do metylocelulozy. Odpowiednio ułóż zarodki za pomocą cienkiej nylonowej linii.</li>
	<li>Porównaj fluorescencję zarodków kontrolnych z zarodkami poddanymi działaniu środka. Alternatywnie, należy ustalić parametry stereomikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego tak, aby wszystkie zarodki były obrazowane przy użyciu tych samych ustawień obrazowania.</li>
</ol>
5. Metoda wykrywania ROM w pojedynczej komórce
<ol>
	<li>Zacznij od kroku: 3.5. Upewnij się, że masz co najmniej 35 zarodków na każdy stan.</li>
	<li>Przenieś zarodki do nowego naczynia. Usuń wodę z ryb tak bardzo, jak to możliwe. Dodaj 10 ml lodowatego PBS 1x i 400 μl koktajlu inhibitorów proteazy. Ręcznie odcięć zarodki za pomocą kleszczy i usunąć worek z żółtkiem za pomocą cienkiej igły. Uwaga: Wyjęcie worka z żółtkiem zapewnia czyste próbki do następnej analizy FACS. Tego kroku można uniknąć zgodnie z instrumentem FACS.</li>
	<li>Przenieść pozbawione żółtek zarodki do 24-dołkowej płytki wielodołkowej (15 zarodków/dołek) i usunąć całą wodę z ryb.</li>
	<li>Dodać 300 μl HBSS, 30 μl kolagenazy P, 50 μl trypsyny-EDTA do każdej studzienki.</li>
	<li>Homogenizować zarodki, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą ciasnej końcówki pipety (1 000 μl).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 28 °C przez 20 minut i homogenizować próbki, pipetując co 5 minut.</li>
	<li>Sprawdzić rozerwanie tkanki, obserwując podwielokrotność homogenatu pod mikroskopem złożonym. Ułatwić zawiesinę pojedynczych komórek poprzez pipetowanie. Nie wysiadywać zarodków dłużej niż 30 minut.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję, dodając 200 μl roztworu zatrzymującego. Wymieszać delikatnie pipetując.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórek do wstępnie schłodzonej rurki ze szczelnym dnem. Trzymaj rurkę na lodzie i unikaj ekspozycji na światło.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 250 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć górną fazę i ponownie zawiesić komórki za pomocą lodowatego HBSS, delikatnie pipetując.</li>
	<li>Policz komórki i upewnij się, że we wszystkich próbkach jest taka sama liczba komórek. Nie używaj mniej niż 2 x 106 komórek.</li>
	<li>Odwirowywać komórki przez 5 minut w temperaturze 250 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i zawiesić osad w 1 ml lodowato schłodzonego HBSS zawierającego sondę czułą na ROS.</li>
	<li>Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 3 minuty w ciemności. Zmieniaj czas inkubacji w zależności od poziomu stresu oksydacyjnego i czułości sondy.</li>
	<li>Przenieś komórki do probówki FACS. Utrzymuj probówki na lodzie i unikaj ekspozycji na światło przed analizą FACS.</li>
	<li>Sortuj komórki za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Ustaw długości fal zgodnie z fluorescencją tkanek Tg (np. GFP) i widmami wzbudzenia/emisji sondy molekularnej używanej do wykrywania ROS (np. specyficzne mitochondrialne sondy wrażliwe na ROS, ogólne sondy wrażliwe na ROS).</li>
	<li>Dla każdego warunku zmierz wszystkie próbki w tej samej sesji eksperymentalnej, stosując te same ustawienia FACS. Obliczyć procent komórek fluorescencyjnych jako średnią różnych kontrprób biologicznych. Przeanalizuj co najmniej dwie repliki dla każdego warunku.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kroki krytyczne
Opisana tu procedura wykrywania stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego obejmuje dwie różne metody. Cała metoda wykrywania ROS jest głównie testem jakościowym do wykrywania ROS, podczas gdy metoda wykrywania ROS w pojedynczej komórce pozwala na bardziej szczegółowe pomiary ilościowe (rysunek 1). Obie metody oferują szybki i łatwy sposób oceny wykrywania ROS in vivo na zarodkach danio pręgowanego. Jednak oba przedstawiają pewne krytyczne kroki....

Stres oksydacyjny jest konkretnie zdefiniowany jako stan, który wynika z niezrównoważonego komórkowego stanu redoks. Złożone reakcje redoks, które rutynowo zachodzą wewnątrz komórek, określają komórkowy stan redoks. Reakcje redoks obejmują wszystkie reakcje chemiczne, które polegają na przenoszeniu elektronów między atomami cząsteczek biologicznych, powodując redukcję i utlenianie cząsteczek (tj. reakcje redoks). Reakcje te są katalizowane przez formy aktywowane elektronicznie (tj. formy prooksydacyjne), które charakteryzują się skrajną niestabilnością strukturalną i spontaniczną aktywacją niezrównoważonych elektronów, które wymieniają się z sąsiednimi biomolekułami. Te nieregularne reakcje prowadzą do uszkodzenia DNA, karboksylacji białek i utleniania lipidów, a ostatecznie prowadzą do śmierci komórki1. Zwiększony poziom stresu oksydacyjnego jest związany ze starzeniem się i postępem różnych stanów patologicznych2. Doniesiono, że stres oksydacyjny jest odpowiedzialny za zmiany naczyniowe w cukrzycy i chorobach sercowo-naczyniowych3,4. Odgrywa również kluczową rolę w zwyrodnieniu neuronów w chorobie Alzheimera i chorobie Parkinsona5. Ponadto wykazano, że stres oksydacyjny jest kluczowym czynnikiem regulującym progresję raka i przerzuty6,7. Ponadto stan zapalny i reakcje immunologiczne mogą wywoływać i dodatkowo wspierać stres oksydacyjny8.
W żywych komórkach prooksydacyjne formy pochodzą z tlenu (ROS; reaktywne formy tlenu) lub azotu (RNS; reaktywne formy azotu). ROS obejmują rodnik hydroksylowy (.OH), anion ponadtlenkowy (O2-) i nadtlenek wodoru (H2O2). Podstawowym RNS jest podtlenek azotu (NO). Szereg wtórnych form reaktywnych może być generowany przez spontaniczne interakcje między ROS i RNS lub jonami wolnych metali9. Na przykład anion ponadtlenkowy reaguje z podtlenkiem azotu, tworząc nadtlenoazotan (ONOO-), podczas gdyH2O2 reagując z Fe2+ generuje rodniki hydroksylowe. ROS i RNS, ze względu na swoją zdolność do reagowania z kilkoma biomolekułami, są uważane za niebezpieczne zagrożenie dla utrzymania fizjologicznego stanu redoks10. Aby utrzymać stan redoks, komórki są wyposażone w szereg detoksykujących cząsteczek przeciwutleniających i enzymów. Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), katalaza, peroksydaza glutationowa i peroksyredoksyny zasadniczo stanowią przeciwutleniacz enzymatyczny, który zapewnia ochronę komórkową przed formami prooksydacyjnymi, w tymH2O2, . OH i OONO- 11. Również cząsteczki przeciwutleniające, takie jak witamina C i E, polifenole i koenzym Q10 (CoQ10) mają kluczowe znaczenie dla wygaszania ROS i ich niebezpiecznych pochodnych12,13. Jednak nadmierna produkcja ROS i RNS lub dysfunkcja systemu przeciwutleniającego przesuwa komórkowy stan redoks w kierunku stresu oksydacyjnego14.
Oprócz negatywnych konotacji, ROS mogą odgrywać różne fizjologiczne role w komórkach różnego pochodzenia. Komórki normalnie wytwarzają ROS jako cząsteczki sygnałowe, które pośredniczą w normalnych zdarzeniach biologicznych, takich jak obrona gospodarza i gojenie ran15-17. Formy reaktywne są zwykle wytwarzane w komórkach przez enzymy wewnątrzkomórkowe, takie jak NOX (oksydaza NADPH) i XO (oksydaza ksantynowa) w odpowiedzi na czynniki sygnałowe, czynniki wzrostu i wewnątrzkomórkowe wahania poziomu wapnia18,19. Doniesiono, że ROS może w różny sposób modulować aktywność ważnych czynników jądrowych, takich jak p53 lub składników komórkowych, takich jak kinaza ATM, główny regulator odpowiedzi na uszkodzenie DNA20. Analogicznie ROS silnie wpływają na sygnalizację komórkową, pośrednicząc w utlenianiu i inaktywacji białkowych fosfataz tyrozynowych (PTP), które są ustalane jako krytyczne regulatory transdukcji sygnału21. Co więcej, metodologie oparte na proteomice pokazują, że RNS są również odpowiedzialne za specyficzne modyfikacje białek i zmiany sygnalizacji molekularnej. RNS reagują z grupami cysteinowo-tiolowymi, modyfikując je w S-nitrotiole (SNO) i uruchamiając szlaki molekularne współistniejące ze stanami patologicznymi, takimi jak choroby zapalne i autoimmunologiczne22,23.
Ponieważ eksperymenty z hodowlą komórkową tylko częściowo odtwarzają mnogość czynników działających in vivo, bardzo interesujące jest przeprowadzenie badań redoks na modelach zwierzęcych24,25. Aby to osiągnąć, danio pręgowany został uznany za odpowiedni model zwierzęcy kręgowców do badania dynamiki stresu oksydacyjnego26. Danio pręgowany to nowy system modelowy, który daje kilka korzyści w badaniu zdarzeń komórkowych i genetycznych podczas rozwoju i choroby kręgowców. Duże skupiska zarodków mogą być generowane i dostępne co tydzień do celów eksperymentalnych. Co więcej, niezwykła przejrzystość optyczna zarodków danio pręgowanego, a także ich niewielkie rozmiary, umożliwiają obrazowanie pojedynczych komórek i dynamiczne śledzenie w całych organizmach27. W ciągu ostatniej dekady wygenerowano znaczną liczbę mutantów danio pręgowanego w celu modelowania stanów patologicznych człowieka, takich jak rak i choroby genetyczne28-31. Co najważniejsze, wyprodukowano wiele linii transgenicznych, które dają szerokie możliwości manipulacji genetycznych i biologicznych32. Na przykład transgeniczne linie danio pręgowanego specyficzne dla tkanek są regularnie wykorzystywane do badań in vivo. Linie te wyrażają białko fluorescencyjne pod kontrolą wybranego promotora, oferując możliwość identyfikacji pojedynczych komórek in vivo, a także budowy anatomicznej, z której się składają.
Kilka badań toksykologicznych już wykorzystało danio pręgowanego do oceny wpływu in vivo substancji chemicznych na homeostazę redoks, sugerując przydatność tego kręgowca jako modelu zwierzęcego dla dziedziny odkrywania leków i stresu oksydacyjnego33-35. Mimo że niektóre sondy fluorescencyjne zostały przetestowane w celu monitorowania stresu oksydacyjnego u larw danio pręgowanego36,37, nie ma ustalonych testów do wykrywania i mierzenia poziomu stresu oksydacyjnego w tkankach danio pręgowanego i żywych komórkach. W tym artykule opisano procedurę ilościowego oznaczania in vivo stresu oksydacyjnego w żywych komórkach zarodków danio pręgowanego. Narzędzia do obrazowania, sortowanie FACS, sondy fluorescencyjne i warunki prooksydacyjne zostały połączone w celu stworzenia prostego testu do wykrywania i ilościowego oznaczania gatunków utleniających w zarodkach i tkankach danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru</td><td>SIGMA</td><td>516813</td><td>NIE PRZECHOWYWAĆ ROZCIEŃCZEŃ</td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka 1x</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>SIGMA</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Błyskawiczna mieszanina soli morskiej do akwarium oceanicznego</td><td>INSTANT OCEAN</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina</td><td>SIGMA</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Ogólna sonda wrażliwa na ROS: Odczynnik CellROX Deep Red</td><td>INVITROGEN</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>Sonda wrażliwa na ROS specyficzna dla mitochondriów: MitoSOX&nbsp;</td><td>INVITROGEN</td><td>M36008</td><td>rozpuścić jedną fiolkę z 13 &mu; l DMSO</td></tr><tr><td>Hydroethidine</td><td>INVITROGEN</td><td>D23107</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>Przygotować 5 mM roztwór podstawowy w DMSO.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sulfotlenek dimetylu</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VAS2870; 3-benzylo-7-(2-benzoksazolylo)tio-1,2,3-triazolo(4,5-d)pirymidyna</td><td>EnzoLifeScience</td><td>BML-EI395</td><td>rozpuścić proszek w DMSO; rozcieńczyć w wodzie dla ryb</td></tr><tr><td>Jodek propidyny&nbsp;</td><td>Sondy molekularne (Life Technologies)</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>7-aminoaktynomycyna D (7-AAD)&nbsp;</td><td>Sondy molekularne (Life Technologies)</td><td>A1310</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2a Morpholino</td><td>GeneTools</td><td>5'-CATTTCAATCTCCAT CATGTCTCAG-3'Ref</td><td>: Timme-LaLaragy et al.; 2012 (PMID: 22174413); Kobayashi et al.; 2002 (PMID:12167159)</td></tr><tr><td>Kolagenaza P</td><td>ROCHE</td><td>11213857001</td><td>Rozpuścić proszek w stężeniu 100 mg/ml w sterylnym HBSS. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Kompletne tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy</td><td>ROCHE</td><td></td><td>Rozpuść jedną tabletkę w 1 ml wody</td></tr><tr><td>0,5% Trypsyna-EDTA (10x), bez czerwieni fenolowej</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>Przygotuj 1x roztwór roboczy przed użyciem</td></tr><tr><td>Mikroskop złożony&nbsp;</td>Mikroskop stereoskopowy <td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>z oświetleniem fluorescencyjnym</td><td>Aparat fotograficzny Nikon</td><td>AZ100</td><td></td></tr> Oprogramowanie <tr><td></td><td>ZEISS</td><td>AxioCamMRm</td><td></td></tr><tr><td>do akwizycji obrazów fluorescencyjnych</td><td>ZEISS</td><td>ZEN 2011</td><td></td></tr><tr><td>Aktywowany fluorescencją sortownik komórek</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka&nbsp;</td><td>Rury Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>FACS&nbsp;</td><td>Płytka</td> wielodołkowa BD <td>342065</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizowane, nieobrobione szalki Petriego 90 mm</td><td>VWR</td><td>391-1915</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>Leica SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Wysoki poziom reaktywnych form tlenu (ROS) może spowodować zmianę komórkowego stanu redoks w kierunku stresu oksydacyjnego. Taka sytuacja powoduje utlenianie cząsteczek (lipidów, DNA, białek) i prowadzi do śmierci komórki. Stres oksydacyjny wpływa również na postęp kilku stanów patologicznych, takich jak cukrzyca, retinopatie, neurodegeneracja i rak. Dlatego tak ważne jest zdefiniowanie narzędzi do badania warunków stresu oksydacyjnego nie tylko na poziomie pojedynczych komórek, ale także w kontekście całych organizmów. W tym przypadku uważamy zarodek danio pręgowanego za przydatny system do przeprowadzania takich badań i przedstawiania protokołu pomiaru stresu oksydacyjnego in vivo. Korzystając z fluorescencyjnych sond ROS i transgenicznych linii fluorescencyjnych zebry danio pręgowanego, opracowujemy dwie różne metody pomiaru stresu oksydacyjnego in vivo: i) "metodę wykrywania ROS całego zarodka" do jakościowego pomiaru stresu oksydacyjnego oraz ii) "metodę wykrywania ROS w pojedynczej komórce" do ilościowych pomiarów stresu oksydacyjnego. W niniejszym artykule wykazujemy skuteczność tych procedur poprzez zwiększenie stresu oksydacyjnego w tkankach za pomocą środków utleniających oraz metod fizjologicznych lub genetycznych. Protokół ten jest podatny na badania genetyczne i pomoże rozwiązać związki przyczynowo-skutkowe ROS w modelach zwierzęcych patologii związanych ze stresem oksydacyjnym, takich jak zaburzenia neurologiczne i nowotwory.

Stosując opisaną tutaj metodę, możemy łatwo zmierzyć i wykryć stres oksydacyjny (oraz poziom ROS) w tkankach embrionalnych danio pręgowanego. Po skrzyżowaniu dorosłych osobników danio pręgowanego, zbiera się ikrę i pozwala jej rozwijać się w temperaturze 28 °C do 72 hr hpf (godzin po zapłodnieniu). W celu indukcji stresu oksydacyjnego proponujemy dwa różne podejścia: 1) traktowanie embrionów silnymi odczynnikami prooksydacyjnymi lub 2) stymulowanie powstawania ROS po uszkodzeniu tkanek.
W pier...

Tutaj przedstawiamy protokół pomiaru stresu oksydacyjnego u żywych zarodków danio pręgowanego. Procedura ta umożliwia wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS) zarówno w całych tkankach zarodka, jak i w populacjach pojedynczych komórek. W ramach tego protokołu zostaną przeprowadzone zarówno analizy jakościowe, jak i ilościowe.

Analiza stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest jakościowy i ilościowy pomiar stresu oksydacyjnego w żywych embrionach danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez dodanie roztworu utleniającego do przygotowanych embrionów w celu indukcji stresu oksydacyjnego lub poprzez stworzenie brzegu rany w płetwie ogonowej embrionu. Następnie embriony poddaje się procesowi detekcji stresu oksydacyjnego za pomocą metody pojedynczej komórki lub metody całego preparatu.Następnie preparaty inkubuje się z sondą detekcyjną ROS. Wyniki mogą wskazywać poziom stresu oksydacyjnego oraz poziom ROS na podstawie mikroskopii konfokalnej całych preparatów lub analizy cytofluorometrycznej pojedynczych komórek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak immunofluorescencja dla markerów stresu oksydacyjnego, jest to, że umożliwia ona detekcję w kontekście żywego organizmu oraz kwantyfikację na poziomie pojedynczych tkanek.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w obszarze badań podstawowych, takich jak badanie warunków stresu oksydacyjnego w kontekście stanu patologicznego. Osoby początkujące mogą napotkać trudności ze względu na przypadkowe uszkodzenia tkanek, ponieważ surowe, czułe sondy molekularne mogą stanowić nieplanowane źródło kwasowości. Ponieważ wysoki poziom stresu oksydacyjnego musi prowadzić do śmierci komórek, natomiast zbyt niski może być trudny do wykrycia w praktyce i podczas eksperymentów, problemy te ujawnią się dopiero w trakcie pracy. Przygotowując roztwór do indukcji stresu oksydacyjnego w mitochondriach z użyciem rot znanych w DMSO, należy go sporządzić z roztworu stokowego rot znanych w stężeniu od 5 do 50 µM i nigdy powyżej 100 µM, ponieważ rot znane są toksyczne i niebezpieczne.Należy przestrzegać wskazanych środków ostrożności. Roztwór sondy do detekcji otworów Mount Ross nie powinien być wystawiony na działanie światła ani tlenu podczas przygotowania i musi zostać przygotowany bezpośrednio przed zastosowaniem w metodzie detekcji pojedynczych komórek Ross. Należy przygotować roztwór zatrzymujący z FBS w PBS i przechowywać go w temperaturze 4 °C.Pozostałe przygotowania obejmują ustawienie inkubatora powietrznego dla danio prążkowanego na 28 °C, a w przypadku metody pojedynczych komórek – schłodzenie wirówki do 4 °C. Przeprowadzono krzyżowanie danio prążkowanego, zbiór embrionów oraz znieczulenie. Stosując standardową metodologię, należy zebrać odpowiednie embriony od 48 do 72 godzin po zapłodnieniu.Po znieczuleniu embrionów dwukrotnie wypłucz środek znieczulający, a następnie przenieś embriony do trzech szalek, mieszcząc nie więcej niż 30 sztuk w każdej szalce, w celu detekcji surowych danych z pojedynczych komórek. Zbierz co najmniej 35 embrionów na każdą próbę w kilku szalkach. Następnie aplikuj 10 ml roztworu utleniającego lub kontroli negatywnej.Należy dodać 10 ml wody, a następnie odczekać od 10 do 60 minut, podczas gdy embriony inkubują się w temperaturze 28 °C. Należy również uprzednio ogrzać HBSS do 28 °C w celu wykonania przemycia. Po zakończeniu inkubacji embriony należy przenieść do nowej szalki z ciepłym HBSS i delikatnie zamieszać.Następnie należy przystąpić do detekcji Ross w całym preparacie lub w pojedynczych komórkach. Bardziej fizjologiczną opcją jest wywołanie stresu po uszkodzeniu tkanek poprzez zastosowanie techniki ranienia płetwy ogonowej opisanej przez NI Tomer i współpracowników. Po zastosowaniu utleniaczy należy przenieść grupy do 10 embrionów do małych probówek.Przepłucz je obficie roztworem HBSS i zabezpiecz przed światłem za pomocą folii. Następnie do każdej probówki dodaj jeden mililitr surowego roztworu detekcyjnego i inkubuj probówki przez 15 minut w temperaturze 28°C. Przygotuj szkiełko przedmiotowe, na którym umieścisz próbkę kontrolną oraz eksperymentalną.Przykryj szkiełko z wgłębieniem 300 µL metylocelulozy. Podczas dozowania metylocelulozy unikaj powstawania pęcherzyków powietrza. Po inkubacji embrionów szybko wymień roztwór w probówkach na 2 mL HBSS i kilkakrotnie odwróć probówki, aby przemyć embriony.Następnie wciągnij zarodki do końcówki mikropipety i delikatnie przenieś je na potraktowany szkiełko. Ustaw zarodki za pomocą cienkiej nylonowej nitki, a następnie przeprowadź analizę przy użyciu fluorescencyjnego lub konfokalnego mikroskopu skanującego. Upewnij się, że wszystkie zarodki są analizowane przy tych samych ustawieniach.Przenieś embriony z płynu piorącego HBSS do nowej szalki, usuwając jak największą ilość roztworu. Następnie ręcznie usuń otoczkę z embrionów. Jest to niezbędne do dysocjacji embrionów do pojedynczych komórek.Następnie przenieś embriony do płytki 24-dołkowej, umieszczając po 15 embrionów w każdym dołku. Optymalnie należy wypełnić trzy dołki dla każdego wariantu badawczego. Następnie usuń cały roztwór i zastąp go 300 µL HBSS, 30 µL kolagenazy P oraz 50 µL trypsyny EDTA.Używając końcówki do pipety o pojemności jednego mililitra, homogenizuj zarodki poprzez pipetowanie. Po przygotowaniu wszystkich studzienek przenieś płytkę do temperatury 28 °C na co najmniej 20 minut, tritując próbki co pięć minut, aby zapewnić dobrą homogenizację. Umieść również kilka probówek do wirowania na lodzie, aby zebrać tkanki po ich przygotowaniu.Po 20 minutach pobierz próbkę i sprawdź pod mikroskopem, czy tkanka została rozdrobniona do postaci zawiesiny pojedynczych komórek. Jeśli nie, kontynuuj inkubację do maksymalnie 30 minut łącznie. Gdy tkanka będzie gotowa, zatrzymaj reakcję, dodając dodatkowe 200 µl roztworu stopującego.Wymieszaj to z TRI, używając końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Następnie przenieś zawartość każdej studni do schłodzonej wcześniej probówki do mikrowirówki i przechowuj te probówki w lodzie, osłaniając je przed światłem. Następnie odwiruj próbki z prędkością 250 g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Następnie usuń supernatant za pomocą aspiracji. Resuspenduj pellet komórkowy w lodowatym HBSS, delikatnie pipetując, i sprawdź, czy zawiesina zawiera co najmniej 2 miliony komórek. Następnie resuspenduj komórki w 1 ml roztworu surowej sondy wrażliwej.Inkubuj je w temperaturze pokojowej i w ciemności przez około trzy minuty. Czas inkubacji dostosuj empirycznie. Następnie przenieś komórki do probówek typu fax, chroniąc je przed światłem.Przeprowadź analizy FACS w celu wykrycia markera transgenicznego. Podczas analizy monitoruj fluorescencję i fluorescencję sondy Ross. Poziomy utraty zawsze obliczaj jako krotność wzrostu w porównaniu z próbkami kontrolnymi, aby znormalizować fluorescencję tła.Do badania akumulacji nadtlenku wodoru w miejscu rany wykorzystano detekcję metodą Mount Ross. Porównano nienaruszone i zranione ogony po 20 minutach działania utleniacza. W obu warunkach wykryto sygnał niespecyficzny.Ten sam eksperyment przeprowadzono z wstępną obróbką embrionów w celu obniżenia poziomu nadtlenku wodoru. Zastosowanie inhibitora OX VAs 28 70 wykazało, że wykryte sygnały były rzeczywiście zależne od akumulacji Ross rot. Embriony poddane znanej obróbce zostały również zbadane metodą whole mount.Pod dużym powiększeniem zidentyfikowano regiony anatomiczne. Wykryto obecność Ross, co potwierdzono poprzez zliczanie fluorescencyjne komórek Ross-dodatnich za pomocą fax w celu detekcji pojedynczych komórek Ross. Analizę przeprowadzono z wyłączeniem martwych komórek. Kontrola.Analizowano również komórki niepoddane działaniu czynników. Porównanie tych wyników znacznie ułatwiło kwantyfikację akumulacji Ross. Test ten okazuje się doskonałym narzędziem do badania dowolnej liczby manipulacji eksperymentalnych.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w 90 minut. Należy pamiętać, że praca z sondami molekularnymi może być niezwykle niebezpieczna i wymaga ostrożności. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować rękawice ochronne.

analysis-of-oxidative-stress-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza stresu oksydacyjnego w zarodkach rybki kiełbka

Danio pręgowany stanowi potężny model kręgowców, który był niewystarczająco wykorzystywany w badaniach metabolicznych. W niniejszej pracy opisujemy szybką metodę pomiaru profilu metabolicznego in vivo rozwijających się rybek danio, która umożliwia porównanie różnych parametrów funkcji mitochondriów między zarodkami manipulowanymi genetycznie lub farmakologicznie, zwiększając tym samym możliwości zastosowania tego organizmu.

Analiza profilu metabolicznego embrionów rybki danio-ostrogona

Ten film demonstruje bardzo czuły test oparty na immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń oksydacyjnych wywołanych PM2.5 w sercach zarodków danio pręgowanego poprzez pomiar poziomów 8-OHdG i γH2AX, które wskazują odpowiednio na uszkodzenie DNA i pęknięcia dwuniciowego DNA.

Test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA za pośrednictwem PM2,5 w zarodkach ryb

Pewne zaburzenia genetyczne lub narażenie na toksyny mogą zakłócić normalne procesy rozwojowe, prowadząc do śmierci określonych typów komórek. Analiza aktywowanej kaspazy 3 metodą immunofluorescencji całej góry w zarodkach danio pręgowanego ujawnia specyficzną dla etapu i tkanki lokalizację komórek specyficznie ulegających apoptozie.

Analiza apoptozy w zarodkach danio pręgowanego za pomocą immunofluorescencji całego wierzchowca w celu wykrycia aktywowanej kaspazy 3

Danio pręgowany jest ważnym organizmem modelowym do badania homeostazy energetycznej.  Wykorzystując czuły na NADH2 wskaźnik redoks, alamar Blue, opracowaliśmy test, który mierzy tempo metabolizmu larw danio pręgowanego w formacie 96-dołkowej płytki i może być stosowany do odkrywania leków lub genów.

Wysokoprzepustowy test wydatku energetycznego Danio Rerio

Narażenie na teratogeny może powodować wady wrodzone. Danio pręgowany jest przydatny do określania potencjału teratogennego chemikaliów. Wykazujemy użyteczność danio pręgowanego, wystawiając zarodki na działanie różnych poziomów azotynów, a także w różnych momentach ekspozycji. Pokazujemy, że azotyny mogą być toksyczne i powodować poważne wady rozwojowe.

Danio pręgowany jako model do oceny potencjału teratogennego azotynów

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

Ten protokół wykorzystuje test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych PM2.5 w wypreparowanych sercach zarodków danio pręgowanego.

Wykorzystanie immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych przez PM2,5 w sercach zarodków danio pręgowanego

Danio pręgowany został ostatnio wykorzystany jako model do walidacji potencjalnych modyfikatorów promieniowania. Niniejszy protokół opisuje szczegółowe kroki w celu wykorzystania zarodków danio pręgowanego do eksperymentów przesiewowych opartych na promieniowaniu oraz niektóre podejścia obserwacyjne do oceny wpływu różnych metod leczenia i promieniowania.

Larwy danio pręgowanego jako model do oceny potencjalnych radiosensybilizatorów lub obrońców

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Protokół ten opisuje tanią metodę mikroskopii świetlnej do oceny morfologii i funkcji serca w embrionach danio pręgowanych, umożliwiającą powtarzalną ocenę rozwojowej kardiotoksyczności bez potrzeby stosowania zaawansowanych systemów obrazowania.

Funkcjonalne obrazowanie serca w zarodkach danio dano za pomocą standardowej mikroskopii i analizy wideo: zastosowania w badaniach środowiskowych i biomedycznych

Poznaj metodę pomiaru stresu oksydacyjnego w żywych zarodkach Danio rerio z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i analizy cytofluorymetrycznej. Technika umożliwia jakościową i ilościową detekcję ROS na poziomie całych tkanek i pojedynczych komórek.

Analiza stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów