Monitorowanie i lokalizacja pojedynczych neuronów w podkorowych strukturach mózgu czujnych, skrępowanych głową szczurów

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie i lokalizacja aktywności pojedynczych neuronów w podkorowych strukturach mózgu szczurów z unieruchomioną głową. Osiąga się to poprzez uprzednie przyzwyczajenie szczura do unieruchomienia ciała w skarpetce z tkaniny. Drugim krokiem jest chirurgiczne wszczepienie zagłówka i komory nagrywającej, tak aby szczur mógł być utrzymywany w płaszczyźnie stereotaktycznej podczas wielu kolejnych sesji nagraniowych.

Następnie szczur umieszcza się w odpowiednim przyrządzie w celu przeprowadzenia eksperymentów behawioralnych i elektrofizjologicznych oraz wykonuje się juxta komórkowe nagrania neuronalne. Proces ten umożliwia jednoznaczne odizolowanie pojedynczych jednostek. Ostatnim krokiem jest oznaczenie anatomicznego położenia miejsca nagrania za pomocą niebieskiego barwnika Chicago Sky w celu jego wizualizacji w totologii post hoc.

Główną przewagą tej techniki nad powszechnie stosowanymi metodami, takimi jak zapis zewnątrzkomórkowy za pomocą metalowych mikroelektrod, jest to, że skoki z pojedynczych jednostek można jednoznacznie wyizolować i że miejsce zapisu można ujawnić w histologii post hoc. Aby rozpocząć tę procedurę, znieczul zwierzę wstrzyknięciem ketaminy ksylazyny. Sprawdź odruch wycofania palca u nogi, aby określić płaszczyznę znieczulenia i utrzymać znieczulenie poprzez dalsze podawanie środka znieczulającego.

W razie potrzeby ogolić głowę i zdezynfekować miejsce operacyjne jodonem powidonu. Następnie umieść szczura w stereotaktycznej ramie trzymającej i zabezpiecz jego głowę nausznikami. Wykonaj nacięcie skalpelem wzdłuż linii środkowej czaszki od punktu środkowego między oczami do tylnej części uszu.

Następnie usuń dwu- lub trzymilimetrowy pasek skóry po obu stronach nacięcia. Zeskrob okostną, aby odsłonić czaszkę rozciągającą się do bocznych grzbietów. Następnie przykryj odsłoniętą czaszkę cienką warstwą super kleju.

Następnie wywierć mały otwór bezpośrednio za miejscem, w którym szew bgma styka się z bocznym grzbietem pod kątem 30 do 45 stopni w głąb czaszki. Następnie wkręć maszynę z płaskim dnem zero 80. Przykręć do otworu pod kątem od 30 do 45 stopni i uważaj, aby nie wkręcić zbyt głęboko, aby uniknąć uszkodzenia leżącej pod spodem tkanki mózgowej.

Powtórz tę procedurę dla sześciu dodatkowych w tej konfiguracji. Następnie nałóż super klej na podstawę wszystkich. Teraz umieszcza igłę strzykawki w stereofonicznym manipulatorze podatkowym.

Wykonaj wgniecenie w czaszce za pomocą igły, aby zaznaczyć odpowiednie miejsce odniesienia. Następnie zaznacz wgniecenie markerem permanentnym. Następnie wykonaj kraniotomię wyśrodkowaną na pożądanej współrzędnej i pozostaw oponę twardą nienaruszoną.

Przykryj kraniotomię zmodyfikowanym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Następnie pokrój probówkę wirówkową o pojemności 0,2 mililitra na długość od czterech do pięciu milimetrów i odetnij nakrętkę. Umieść rurkę na czaszce i wyśrodkuj ją nad kraniotomią.

Następnie nałóż cement dentystyczny wokół dna tubki, aby uszczelnić podstawę rurki do czaszki. I należy uważać, aby nie przeciekać cementu do odsłoniętej kraniotomii. Teraz wywierć kolejny mały otwór w przeciwległej płytce czaszki.

Ostrożnie włóż przewód odniesienia, który został przylutowany do złącza stykowego. Następnie nałóż super klej na otwór, w który został włożony drut, aby utrzymać kołek i drut na miejscu. Następnie wymieszaj dwie części zestawu żelu silikonowego w równych porcjach.

Odczekaj dwie minuty i napełnij probówkę wirówkową żelem. Przy napełnieniu w około jednej trzeciej przymocuj płytę zagłówka do pałąka zagłówka. W tym przypadku pręt został przymocowany do zacisku słupka pod kątem prostym pod kątem 45 stopni.

Następnie przymocuj pręt mocujący do ramienia manipulatora podatkowego stereo za pomocą zacisku słupka tak, aby pręt był równoległy do nauszników, opuść pręt i płytkę tak, aby płytka znajdowała się za szwem lambda i przed śrubą coddle mos. Następnie chwyć z przednim pod kątem około 45 stopni za pomocą zacisku tak, aby był skierowany w dół i w kierunku ogona zwierzęcia. Następnie opuść, aby dotknąć czaszki.

Następnie zabezpiecz i płytkę na miejscu za pomocą akrylu dentystycznego. Nałóż warstwę cementu dentystycznego wokół krawędzi akrylu dentystycznego, aby przymocować skórę do implantu. Po wyschnięciu cementu zrób kilka otworów w nasadce probówki wirówkowej i umieść nasadkę na probówce.

Teraz zdejmij zacisk. Ostrożnie zdejmij drążek przytrzymujący głowicę z taca stereo. Następnie zdejmij płytę głowicy z pręta.

Na koniec usuń zwierzę z ataków stereo i przeprowadź opiekę pooperacyjną i monitorowanie. W tej procedurze pipeta polo z kwarcową rurką kapilarną na mikropipecie laserowej z dwutlenkiem węgla polarnym. Następnie zamocuj pipetę na miejscu pod mikroskopem kontrastowym z różnicowym interferencją wyposażonym w obiektyw o dużej odległości roboczej.

Powoli przesuń szklany blok w pole widzenia za pomocą końcówki do pipet. Za pomocą mikromanipulatora stolika odłam końcówkę pipety, delikatnie dotykając nią szkła. Powtarzaj procedurę, aż końcówka pipety.

Średnica zewnętrzna wynosi od jednego do trzech mikrometrów. Następnie przygotuj zewnątrzkomórkową sól fizjologiczną i dodaj 2% Chicago sky blue. Za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 30 napełnić tylny koniec pipety roztworem.

Następnie umieść szczura w skarpetce z tkaniny i przenieś skarpetę z tkaniny do sztywnej rurki na odpowiednim przyrządzie doświadczalnym. Przymocuj płytkę przytrzymującą głowę szczura do odpowiedniego elementu przyrządu. Następnie umieść nakrętkę 8 32 na ograniczającej głowę, która jest wszczepiona szczurowi.

Następnie przykręć gwintowany pręt ze stali nierdzewnej do z. Następnie otwórz komorę nagrywania i usuń żel silikonowy. Oczyść kraniotomię za pomocą cienkich kleszczy.

Jeśli tkanka odrosła podczas kraniotomii, w razie potrzeby użyj znieczulenia izofluorowego podczas tego procesu. Następnie przymocuj pipetę do zmotoryzowanego mikromanipulatora. Przesuń pipetę do żądanego miejsca zapisu w przedniej, tylnej i przyśrodkowej osi bocznej.

Następnie przesunąć pipetę brzusznie przez oponę twardą, aż znajdzie się w odległości około 500 mikrometrów grzbietowo do zamierzonego miejsca zapisu. Powoli przesuwaj pipetę, nasłuchując impulsów na monitorze audio o nagranym wzmocnionym napięciu. Po zidentyfikowaniu impulsów należy kontynuować przesuwanie pipety o około zero do 100 mikrometrów, aż odchylenia dodatniego napięcia będą większe niż około 500 mikrowoltów.

Aby oznaczyć miejsce nagrywania, ustaw źródło prądu na ujemne cztery mikroampery z dwoma sekundowymi impulsami przy 50% cyklu pracy i przepuszczaj prąd przez cztery minuty do jonoforu, wstrzyknij Chicago sky blue przez pipetę. Po eksperymencie należy przeprowadzić perfuzję zwierzęcia zgodnie ze standardową praktyką. Następnie należy przeciąć mózg i w razie potrzeby przeprowadzić przebarwienia, aby zidentyfikować anatomiczną lokalizację pokazanego miejsca nagrania.

Oto próbka aktywności pobudzającej jednostkę wzgórza VPM, gdy szczur aktywnie ubija. Oto histogram czasów skoków dopasowany do chwilowej fazy ruchu wibracji. Podczas fazy wycofywania ubijania występuje więcej skoków.

Po nagraniu, lokalizacja tego urządzenia została oznaczona za pomocą aforezy barwnika Chicago sky blue. Jak pokazano tutaj, tkanka jest barwiona pod kątem aktywności oksydazy cytochromowej, aby odsłonić neuroanatomiczne granice wzgórza VPM. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać techniki chirurgiczne i elektrofizjologiczne, które utrzymują głowę zwierzęcia w płaszczyźnie stereotaktycznej i które jednoznacznie izolują aktywność impulsową pojedynczych neuronów.