Name: Monitorowanie i lokalizacja pojedynczych neuronów w podkorowych strukturach mózgu czujnych, skrępowanych głową szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj metodę juxtacelularnych rejestracji neuronów w strukturach podkorowych czujnych szczurów z utrzymaniem głowy. Technika umożliwia niejednoznaczną izolację pojedynczych jednostek i precyzyjną lokalizację anatomiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Kanadyjskim Instytutom Badań nad Zdrowiem (grant MT-5877), Narodowym Instytutom Zdrowia (granty NS058668 i NS066664) oraz Amerykańsko-Izraelskiej Fundacji Dwunarodowej (grant 2003222) za finansowanie tych badań.

Eksperymentalne protokoły zostały przeprowadzone na samicach szczurów rasy Long Evans (250 - 350 g) zgodnie z federalnie zalecanymi wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Diego.
1. Aklimatyzacja szczura do unieruchomienia ciała
UWAGA: Umieść szczura na ograniczonej diecie. Karmić szczura raz dziennie bezpośrednio po każdej codziennej sesji obchodzenia się z nim, aby przyzwyczaić szczura do unieruchomienia (opisanego poniżej). Zapewnij wystarczającą ilość paszy, aby utrzymać zwierzę na poziomie 80% jego początkowej wagi. Ilość ta wynosi około 6 gramów paszy dziennie dla 250 g samicy szczura Long Evans.
<ol>
	<li>Przyzwyczaj szczura do bycia dotykanym przez ludzi. Delikatnie przytrzymuj szczura ręcznie przez około 5 sekund co 30 sekund. Rób to przez 15 minut dziennie przez 2 kolejne dni. Codziennie monitoruj szczury pod kątem oznak stresu w okresie treningu. Objawy obejmują walkę w odpowiedzi na powściągliwość, wokalizację i szczękanie zębami.</li>
	<li>Trzeciego dnia umieść szczura w skarpetce z tkaniny krępującej ciało (ryc. 1) na 15 minut dziennie przez dwa kolejne dni.</li>
	<li>Piątego dnia umieść szczura w skarpetce i umieść skarpetę w sztywnej rurce na eksperymentalnym przyrządzie (ryc. 4). Pozostaw szczura w tubie na 15 minut dziennie przez 2 kolejne dni.</li>
	<li>Karm szczura natychmiast po każdej sesji treningowej. Na koniec ostatniej sesji (6dzień) daj nieograniczony dostęp do jedzenia. Do implantacji wybieraj tylko te szczury, które nie wykazują oznak nadmiernego stresu w ostatnim dniu treningu. 
	UWAGA: Chociaż wybór szczurów do implantacji jest subiektywny, w naszych rękach stwierdzono, że ponad 90% szczurów reaguje na habituację i jest w stanie poddać się implantacji.</li>
</ol>
2. Implantowanie komory zapisu i mechanizmu zagłówka
<ol>
	<li>Wykonaj przewód odniesienia, przylutowując goły drut ze stali nierdzewnej do złącza pinowego. Przetnij drut tak, aby 3-5 mm pozostało odsłonięte przez kołek. Przewód referencyjny należy sterylizować w autoklawie wraz ze wszystkimi narzędziami chirurgicznymi.</li>
	<li>Podawać znieczulenie ketaminą/ksylazyną. Podawać dootrzewnowo 95 mg/kg ketaminy zmieszanej z 5 mg/kg ksylazyny. Dawka początkowa trwa od 11/2 do 2 godzin. Następnie należy uzupełniać znieczulenie co 30-45 minut, w zależności od potrzeb. Nasmaruj oczy zwierzęcia maścią okulistyczną.</li>
	<li>Sprawdź odruch wycofania palca u nogi, aby określić płaszczyznę znieczulenia i w razie potrzeby utrzymuj znieczulenie.</li>
	<li>Umieść szczura w stereotaktycznej ramie trzymającej z nausznikami (Rysunek 3A). Ogolić włosy na głowie i zdezynfekować miejsce rany powidonem (10% roztwór). Uważaj, aby odpowiednio włożyć nauszniki, aby nie uszkodziły błony bębenkowej. Preferowane są nauszniki z końcówkami.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie skalpelem mniej więcej wzdłuż linii środkowej czaszki od poziomu rostro-ogonowego oczu do tylnej części uszu. Użyj nożyczek, aby przeciąć i usunąć 2-3 mm pasek skóry po obu stronach nacięcia.</li>
	<li>Zeskrob okostną, aby odsłonić powierzchnię czaszki na boczne grzbiety. Przykryj odsłoniętą czaszkę cienką warstwą superglue.</li>
	<li>Wywierć mały otwór o nieco mniejszej średnicy niż 0-80, używając zadziorów wiertarskich o średnicy 1/2 mm (patrz rozdział Materiały). Wywierć otwór bezpośrednio z tyłu od miejsca, w którym szew bregma styka się z bocznym grzbietem i pod kątem 30-45° w głąb czaszki, tak aby śruba mogła wejść z górą bardziej bocznie niż z dołem.</li>
	<li>Wkręć maszynową z płaskim dnem 0-80 do otworu (około 3 obroty), pod kątem 30-45°. Uważaj, aby nie wkręcić zbyt głęboko, aby uniknąć uszkodzenia leżącej pod spodem tkanki mózgowej.</li>
	<li>Powtórz tę procedurę dla 6 dodatkowych w pokazanej konfiguracji (Rysunek 3B). Nałóż superglue na podstawę wszystkich.</li>
	<li>Umieść igłę strzykawki w manipulatorze stereotax. Zmierz od szwu bregma i wykonaj wgniecenie w czaszce za pomocą igły w pobliżu, ale poza pożądanym miejscem kraniotomii, jako znak odniesienia. 
	UWAGA: W tej demonstracji współrzędne stereotaktyczne znaku wynoszą 3 mm z tyłu i 1 mm z boku do szwu bregma.</li>
	<li>Zaznacz wgniecenie markerem permanentnym. Zwróć uwagę na stereotaktyczne współrzędne znaku, ponieważ będzie on służył jako stereotaktyczny punkt odniesienia (rysunek 3B).</li>
	<li>Wykonaj kraniotomię wyśrodkowaną na żądanych współrzędnych (w tym przykładzie 3 mm z tyłu i 3 mm z boku do bregmy). Pozostaw oponę twardą nienaruszoną. Przykryj kraniotomię zmodyfikowanym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (125 mM NaCl, 10 mM glukozy, 10 mM HEPES, 3,1 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, pH 7,4)13 (Figura 3C).</li>
	<li>Wytnij probówkę wirówkową o pojemności 0,2 ml na długość 4-5 mm i odetnij nakrętkę. Umieść rurkę na czaszce i wyśrodkuj ją nad kraniotomią.</li>
	<li>Nałóż cement dentystyczny na dno tubki, aby uszczelnić podstawę rurki do czaszki. Uważaj, aby nie przeciekać cementu do odsłoniętej kraniotomii (ryc. 3D).</li>
	<li>Wywierć kolejny mały otwór (o średnicy około 1/2 mm) w przeciwległej płytce czaszki i ostrożnie włóż drut odniesienia. Skonstruuj przewód odniesienia, przylutowując pin łączący się z nagrywającym amplifier do końca przewodu (patrz rozdział Sprzęt). Nie ruszaj przewodem odniesienia, gdy znajdzie się on w mózgu, ponieważ może to spowodować uszkodzenie.</li>
	<li>Nałóż superglue na otwór, w który został włożony drut. Spowoduje to tymczasowe uszczelnienie kołka i drutu na miejscu.</li>
	<li>Wymieszaj dwie części zestawu żelu silikonowego (patrz rozdział Materiały) w mniej więcej równych porcjach. Odczekaj dwie minuty na wymieszanie i napełnij probówkę wirówkową żelem do około 1/3.</li>
	<li>Przymocować słupek pod kątem prostym clamp (patrz rozdział Materiały) do belki zagłówka. Przymocuj płytę czołową (Rysunek 2A) do belki mocującej (Rysunek 2B) pod kątem nachylenia 45°, tak aby spód płyty był skierowany w stronę nosa zwierzęcia. Pomocne jest użycie inklinometru w celu ustawienia kąta nachylenia tak, aby odpowiadał kątowi nachylenia eksperymentalnego przyrządu (ilustracja 4).</li>
	<li>Przymocuj drążek mocujący do ramienia manipulatora stereotax tak, aby drążek był równoległy do nauszników. Obniż pręt i płytkę tak, aby płytka znajdowała się za szwem lambda i przed śrubą o najbardziej ogonowym szczecinie.</li>
	<li>Chwyć z przednim (kołek lub 8-32, patrz rozdział Materiały) pod kątem około 45° za pomocą ramienia pomocnej ręki i clamp, tak aby był skierowany w dół i w kierunku ogona zwierzęcia. Opuść tak, aby dotykała przednich 0-80 (Rysunek 3F, G).</li>
	<li>Zabezpiecz i płytkę na miejscu za pomocą akrylu dentystycznego. Nałóż akryl dentystyczny wokół kostnych, kołka referencyjnego i po bokach probówki wirówkowej. Odczekaj około 10 minut, aż akryl dentystyczny wyschnie (rysunek 3H).</li>
	<li>Nałóż warstwę cementu dentystycznego wokół krawędzi akrylu dentystycznego, przyklejając skórę do implantu. Poczekaj, aż cement wyschnie.</li>
	<li>Zrób kilka otworów w nasadce probówki wirówkowej i umieść nasadkę na probówce.</li>
	<li>Zdejmij zacisk pomocnych rąk. Następnie ostrożnie zdejmij drążek przytrzymujący głowę ze stereotax, a następnie zdejmij płytę głowicy z drążka (Rysunek 3I).</li>
	<li>Wyjmij zwierzę ze stereolaku i zapewnij mu opiekę pooperacyjną i monitorowanie zgodnie ze wszystkimi obowiązującymi zasadami, przepisami i przepisami (np. Buprenorfina 0,02 mg/kg co 8-12 godzin przez co najmniej 24 godziny). Jeśli stan zapalny rozwinie się wokół krawędzi implantu, należy codziennie nakładać cienką warstwę maści z antybiotykiem na dotknięte miejsce, aż do ustąpienia.</li>
</ol>
3. Monitorowanie jednostek neuronalnych w trybie juxtacellular
<ol>
	<li>Pociągnij kwarcową rurkę kapilarną na laserowym ściągaczu do mikropipet z dwutlenkiem węgla (patrz rozdział Wyposażenie) o średnicy końcówki mniejszej niż 1 μm (Rysunek 5A). 
	UWAGA: parametry ogrzewania będą się różnić w zależności od konkretnego instrumentu, a wymagana średnica szyjki będzie się różnić w zależności od interesującej struktury mózgu. W przypadku nagrań we wzgórzu szczura mikropipety mają szyjki w zakresie od 5 do 7 mm.</li>
	<li>Zamocuj pipetę na miejscu pod mikroskopem z kontrastem różnicowym (DIC) wyposażonym w obiektywy o dużej odległości roboczej. Użyj plasteliny, aby przytrzymać pipetę na miejscu na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Powoli przesuń szklany blok (o grubości 0,5 - 1 cm; kawałek szkła używany do robienia noży ultra-mikrotomowych jest wygodny) w pole view za pomocą końcówki pipety. Za pomocą mikromanipulatora stolika delikatnie przyłóż końcówkę pipety do szklanki, powodując jej pęknięcie. W razie potrzeby powtarzaj tę czynność, aż średnica zewnętrzna końcówki pipety będzie wynosić od 1 do 3 μm (Rysunek 5B,C). Upewnij się, że te mikropipety mają impedancję w zakresie około 5-15 MΩ.</li>
	<li>Przygotuj sól fizjologiczną zewnątrzkomórkową (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, pH 7,2 z NaOH)8 i dodaj 2% (w/v) Chicago Sky Blue. Za pomocą strzykawki z igłą o sile 30 G lub mniejszej napełnić tylną część pipety roztworem. Alternatywnie, w przypadku znakowania pojedynczego komórkowego w zestawieniu komórkowym, dodaj 2% (w/v) neurobiotyny lub biotynylowanej aminy dekstranu (BDA-3000 lub BDA-10000) do roztworu soli fizjologicznej zamiast Chicago Sky Blue.</li>
	<li>Umieść szczura w skarpetce z tkaniny wewnątrz sztywnej rurki na odpowiednim przyrządzie doświadczalnym (ryc. 4). Po zabiegu należy odczekać co najmniej 72 godziny przed umieszczeniem zwierzęcia na przyrządzie zagłówka. Zaciśnij sznurek wokół górnej części mostka, a nie na szyi, aby uniknąć niedrożności dróg oddechowych. Jeśli oddychanie wydaje się być utrudnione lub utrudnione, poluzuj sznurek lub przesuń go do tyłu. Wykonaj tę procedurę, gdy szczur jest czujny.</li>
	<li>Przymocuj płytkę krępującą głowę szczura do odpowiedniego elementu przyrządu. W tym celu należy najpierw przypiąć płytę zagłówka, a następnie zabezpieczyć ją śrubą 4-40. Pamiętaj, aby poczekać, aż zwierzę się uspokoi, aby uniknąć nadmiernego momentu obrotowego na głowę. Następnie umieść nakrętkę 8-32 na przytrzymującej głowę, która jest wszczepiona szczurowi. Następnie wkręć gwintowany pręt ze stali nierdzewnej do z. Przymocuj pręt do eksperymentalnego przyrządu w taki sposób, aby można go było zacisnąć na miejscu (Rysunek 4). 
	UWAGA: Zabezpieczenie zwierzęcia śrubą pod głowicą oraz płytą zagłówka minimalizuje zginanie aparatu i poprawia stabilność nagrywania. W większości przypadków rejestrowanie można rozpocząć w pierwszym dniu, w którym zwierzę ma skrępowaną głowę. Jeśli jednak zwierzę nadmiernie się wierci lub wokalizuje, przed rozpoczęciem jakichkolwiek nagrań należy zapewnić jednodniowy trening przyzwyczajania do zagłówków. W takim przypadku pozostaw zwierzę na przyrządzie na 15 minut, a następnie umieść je z powrotem w klatce. Powtórz ten krok następnego dnia i kontynuuj działanie protokołu.</li>
	<li>Otwórz komorę nagrywania i usuń żel silikonowy. Oczyść kraniotomię za pomocą cienkich kleszczy, jeśli tkanka ponownie odrosła podczas kraniotomii.</li>
	<li>Podłącz pipetę do zmotoryzowanego mikromanipulatora i podłącz przedwzmacniacz czołowyamplifier. 
	UWAGA: W niniejszej demonstracji mały obwód przekaźnikowy na stacji czołowej służy do przełączania między przewodami przewodzącymi wzmacniacza a zewnętrznym źródłem prądu o wysokiej zgodności (Rysunek 6A-C). Należy pamiętać, że niektóre wzmacniacze mają odpowiednie wbudowane źródło o wysokiej zgodności (patrz sekcje Dyskusja i Materiały).</li>
	<li>Za pomocą zmotoryzowanego mikromanipulatora przesunąć końcówkę pipety do stereotaktycznego znaku w komorze nagrywającej. Zanotuj współrzędne tej lokalizacji. Uważaj, aby nie złamać końcówki pipety na czaszce.</li>
	<li>Przesuń pipetę do żądanego miejsca zapisu w osi przednio-tylnej i przyśrodkowej-bocznej. Następnie przesunąć pipetę brzusznie przez oponę twardą, aż znajdzie się około 500 μm grzbietowo do zamierzonego miejsca zapisu.</li>
	<li>Powoli przesuwaj pipetę, nasłuchując na monitorze audio impulsów o wzmocnionym napięciu zarejestrowanym między końcówką pipety a przewodem odniesienia. Po zidentyfikowaniu impulsów należy kontynuować przesuwanie pipety w zakresie 0-100 μm, aż do momentu zaobserwowania odchyleń dodatniego napięcia roboczego większych niż około 500 μV. 
	UWAGA: W takim przypadku rezystancja elektrody wzrośnie o około 1,5-10 razy.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie, gdy jednostka zostanie odizolowana, zgodnie z krokiem 3.11, wraz ze wszystkimi innymi interesującymi pomiarami behawioralnymi i fizjologicznymi. W niniejszej demonstracji samodzielnie wygenerowane ruchy wibrysów są monitorowane za pomocą szybkiej wideografii (patrz sekcja Materiały).</li>
	<li>Aby oznaczyć miejsce nagrywania, przełącz przewody elektrody, aby podłączyć je do źródła prądu. Można to zrobić na kilka sposobów: za pomocą obwodu przekaźnika (Rysunek 6A-C), wbudowanego źródła prądu we wzmacniaczu lub ręcznie (Rysunek 6D, patrz krok 3.8 i Omówienie). Przejście -4 μA z impulsami trwającymi 2 sekundy w 50% cyklu pracy przez 4 minuty, aby jonoforetycznie wstrzyknąć Chicago Sky Blue przez pipetę.</li>
	<li>Zabić i poddać zwierzę perfuzji po kilku procedurach etykietowania zgodnie ze standardową praktyką. W razie potrzeby należy przeciąć mózg i przeciwbarwić, aby zidentyfikować anatomiczną lokalizację miejsca nagrania. Przeciwbarwić tkankę pod kątem reaktywności oksydazy cytochromowej zgodnie z14. Alternatywnie, zidentyfikuj osady Chicago Sky Blue za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. 
	UWAGA: Aby dokładnie rozróżnić różne oznakowane jednostki, ważne jest, aby wszystkie etykiety zostały wykonane tą samą pipetą tego samego dnia, bez odkręcania pipety między etykietami. W tym przypadku miejsca rejestracji można rozróżnić na podstawie ich względnego położenia w histologii post-hoc wraz z zanotowanymi współrzędnymi manipulatora każdego miejsca (patrz krok 3.9). Aby uzyskać jednoznaczną identyfikację, oznacz etykiety w odległości co najmniej 200 μm od siebie i nie więcej niż 3-5 etykiet na region mózgu.</li>
</ol>

<ol><li>Fee, M. S., Leonardo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+motorized+microdrive+and+commutator+system+for+chronic+neural+recording+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniature motorized microdrive and commutator system for chronic neural recording in small animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (2), 83-94 (2001).</li>
<li>Ventakachalam, S., Fee, M. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-miniature+headstage+with+6-channel+drive+and+vacuum-assisted+micro-wire+implantation+for+chronic+recording+from+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultra-miniature headstage with 6-channel drive and vacuum-assisted micro-wire implantation for chronic recording from neocortex.</a> Journal of Neuroscience Methods. 90 (1), 37-46 (1999).</li>
<li>Szuts, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+multi-channel+neural+amplifier+for+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A wireless multi-channel neural amplifier for freely moving animals.</a> Nature Neuroscience. 14 (2), 263-269 (2011).</li>
<li>Roy, S., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+multi-channel+single+unit+recording+in+freely+moving+and+vocalizing+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Wireless multi-channel single unit recording in freely moving and vocalizing primates.</a> Journal of neuroscience. 203 (1), 28-40 (2012).</li>
<li>Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+metrics+to+accompany+spike+sorting+of+extracellular+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quality metrics to accompany spike sorting of extracellular signals.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 8699-8705 (2011).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control%3A+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> Journal of neuroscience. 65 (2), 113-136 (1996).</li>
<li>Person, A. L., Perkel, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pallidal+neuron+activity+increases+during+sensory+relay+through+thalamus+in+a+songbird+circuit+essential+for+learning%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pallidal neuron activity increases during sensory relay through thalamus in a songbird circuit essential for learning.</a> The Journal of neuroscience. 27 (32), 8687-8698 (2007).</li>
<li>Kock, C. P., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 106 (38), 16446-16450 (2009).</li>
<li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67 (6), 10481061(2010).</li>
<li>Hellon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marking+of+electrode+tip+positions+in+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">The marking of electrode tip positions in nervous tissue.</a> The Journal of physiology. 214, 12P(1971).</li>
<li>Furuta, T., Deschênes, M., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+distribution+of+thalamocortical+boutons+in+barrels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anisotropic distribution of thalamocortical boutons in barrels.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (17), 6432-6439 (2011).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (1986).</li>
<li>Kleinfeld, D., Delaney, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributed+representation+of+vibrissa+movement+in+the+upper+layers+of+somatosensory+cortex+revealed+with+voltage+sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes.</a> Journal of Comparative Neurology. 375 (1), 89-108 (1996).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain research. 171 (1), 11-28 (1979).</li>
<li>Moore, J. D., Deschênes, M., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-generated+vibrissa+motion+and+touch+are+differentially+represented+throughout+ventral+posterior+medial+thalamus+in+awake%2C+head-fixed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience+Annual+Meeting.+41+496.08%2FTT424+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Self-generated vibrissa motion and touch are differentially represented throughout ventral posterior medial thalamus in awake, head-fixed rats.</a> Society for Neuroscience Annual Meeting. 41 496.08/TT424 Society for Neuroscience. 41, (2011).</li>
<li>Khatri, V., Bermejo, R., Brumberg, J. C., Zeigler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whisking+in+air%3A+Encoding+of+kinematics+by+VPM+neurons+in+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensory+and+Motor+Research%22%5BJournal%5D)">Whisking in air: Encoding of kinematics by VPM neurons in awake rats.</a> Somatosensory and Motor Research. 27 (2), 344-356 (2010).</li>
<li>Hill, D. N., Curtis, J. C., Moore, J. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+motor+cortex+reports+efferent+control+of+vibrissa+position+on+multiple+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Primary motor cortex reports efferent control of vibrissa position on multiple time scales.</a> Neuron. 72 (2), 344-356 (2011).</li>
<li>Moore, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchy+of+orofacial+rhythms+revealed+through+whisking+and+breathing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hierarchy of orofacial rhythms revealed through whisking and breathing.</a> Nature. 497, 205-210 (2013).</li>
<li>Duque, A., Zaborszky, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuque%2C+A+%22Neuroanatomical+Tract-Tracing+3%22">Neuroanatomical Tract-Tracing 3</a>. , Springer. 197-236 (2006).</li>
<li>Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://kationscientific.com/fsubstances.html">http://kationscientific.com/fsubstances.html</a> Forthcoming.</li>
<li>Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. , Kation Scientific. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://kationscientific.com/fdyes.html">http://kationscientific.com/fdyes.html</a> Forthcoming.</li>
<li>Urbain, N., Deschênes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroactive+substances%3A+Neuropharmacology+by+microiontophoresis.+%28Kation+Scientific%29%2C+Dyes+and+Tracers%3A+Sitemarking+and+tracktracing+by+microiontophoresis.+%28Kation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroactive substances: Neuropharmacology by microiontophoresis. (Kation Scientific), Dyes and Tracers: Sitemarking and tracktracing by microiontophoresis. (Kation).</a> Journal of Neuroscience. 27 (45), 12407-12412 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Budowa eksperymentalnego przyrządu
Opis części mechanicznych użytych do budowy eksperymentalnego przyrządu (rysunek 4) został pominięty w protokole, ponieważ można go skonstruować na różne sposoby. W tej demonstracji standardowe części optomechaniczne i zaciski podporowe są używane do montażu pałąka zagłówka i rury przytrzymującej nadwozie (patrz rozdział Materiały ). Podobne części optomechaniczne można wykorzystać do zamontowan...

Monitorowanie aktywności neuronalnej u czujnego zwierzęcia aktywnie zaangażowanego w zadanie behawioralne jest kluczowe dla zrozumienia funkcji i organizacji układu nerwowego. Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności elektrycznej pojedynczych jednostek neuronalnych od dawna jest podstawowym narzędziem neurobiologii systemowej i jest nadal szeroko stosowany. Dostępnych jest wiele typów i konfiguracji elektrod w zależności od wymagań naukowych i technicznych konkretnego eksperymentu. Przewlekle wszczepiane mikronapędy lub układy elektrod są często używane u swobodnie poruszających się zwierząt, w tym ptaków, gryzoni i naczelnych1-4. Alternatywnie, ostre penetracje mikroelektrodami metalowymi lub szklanymi za pomocą zewnętrznego mikromanipulatora są często wykorzystywane do nagrywania od znieczulonych lub skrępowanych zwierząt. Szklane elektrody do mikropipet mają tę zaletę, że mogą być używane w konfiguracji zestawionej komórkowej lub "przyłączonej do komórki" w celu jednoznacznego wyizolowania aktywności pojedynczych neuronów bez komplikacji związanych z sortowaniem szczytów post-hoc5. Elektrody te umożliwiają ponadto rejestrację z anatomicznie zidentyfikowanych komórek lub lokalizacji, ponieważ mogą być używane do wstrzykiwania małych depozytów barwnika lub znaczników neuroanatomicznych, a nawet do wypełniania pojedynczej zarejestrowanej komórki. Ta konfiguracja została z powodzeniem zastosowana u szczurów, myszy i ptaków6-10. Obecnie opisana technika koncentruje się na monitorowaniu komórkowym i zewnątrzkomórkowych złogach barwnika u czujnych, skrępowanych głowami szczurów. Należy zauważyć, że w przeciwieństwie do jednokomórkowych wypełnień zbliżeniowych, te złoża barwnika nie dostarczają informacji o morfologii komórek ani projekcjach aksonalnych11, ale umożliwiają dokładną lokalizację anatomiczną do około 50 μm i, co najważniejsze, mają znacznie wyższą wydajność u zwierząt czujnych. Informacje na temat jednokomórkowych wypełnień przykomórkowych są jednak dostarczane jako alternatywna strategia znakowania anatomicznego.
W skrócie, protokół składa się z trzech głównych faz. W pierwszej fazie szczur jest przyzwyczajany do krępowania ciała w skarpetce z tkaniny (ryc. 1) przez okres 6 dni. W drugiej fazie chirurgicznie wszczepia się zagłówek (ryc. 2) i komorę zapisu, tak aby szczur mógł być utrzymywany w płaszczyźnie stereotaktycznej podczas wielu kolejnych sesji nagraniowych (ryc. 3); Procedura ta umożliwia eksperymentatorowi ukierunkowanie określonych podkorowych obszarów mózgu do badania elektrofizjologicznego w oparciu o standardowe współrzędne odniesienia12. Trzecia faza polega na umieszczeniu szczura w odpowiednim przyrządzie do przeprowadzenia eksperymentów behawioralnych i elektrofizjologicznych (Ryc. 4), skonstruowaniu elektrody z kwarcowej rurki kapilarnej (Ryc. 5), wykonaniu zestawień neuronalnych komórkowych, które jednoznacznie izolują pojedyncze jednostki6-9 i zaznaczeniu anatomicznej lokalizacji miejsca zapisu barwnikiem Chicago Sky Blue (Ryc. 6 i 7). Nagrania wykonywane są z jednoczesnym monitorowaniem zachowań; Jednak techniczne szczegóły zachowania będą zależeć od celów naukowych każdego eksperymentu, a zatem wykraczają poza zakres pojedynczego protokołu. Po zakończeniu procedury doświadczalnej, którą można powtarzać przez wiele dni, zwierzę jest poddawane eutanazji. Mózg jest ekstrahowany i przetwarzany zgodnie ze standardowymi technikami neuroanatomicznymi przy użyciu mikroskopii jasnego pola lub mikroskopii fluorescencyjnej.

<table><tbody><tr><td>Ketaset (Ketamina HCl)</td><td>Fort Dodge</td><td>N/A Anased</td><td></td></tr><tr><td>(roztwór ksylazyny)</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Betadyne (powidon-jod)</td><td>CVS Pharmacy</td><td>269281</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495</td><td>Grainger Industrial Supply</td><td>4KL86</td><td>20 - 40 cp cyjanoakrylan</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Cement uchwytowy proszek</td><td>Dentsply Intl</td><td>675571</td><td>Na podstawę komory nagraniowej</td></tr><tr><td>Płyn cementowy</td><td>Dentsply Intl</td><td>675572</td><td>Na podstawę komory nagraniowej</td></tr><tr><td>Żel silikonowy</td><td>Dow Corning</td><td>3-4680</td><td></td></tr><tr><td>Proszek akrylowy do naprawy protez zębowych Jet</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do mocowania zagłówka do czaszki</td></tr><tr><td>Ortho-Jet Szybko utwardzająca się ortodontyczna żywica akrylowa w płynie</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>Nie dotyczy Do</td><td>mocowania zagłówka do czaszki</td></tr><tr><td>Chicago sky blue</td><td>Sigma</td><td>C8679</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Do perfuzji i utrwalania tkanek</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td>Do perfuzji i utrwalania tkanek</td></tr><tr><td>Cytochrom C</td><td>Sigma</td><td>C2506</td><td>Do barwienia oksydazą cytochromową, < mocny>Rysunek 7< / silny></td></tr><tr><td>Diaminobenzydyna</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td>Do barwienia oksydazą cytochromową, <silny>Rysunek 7< / mocny></td></tr><tr><td>Skarpeta dla szczurów</td><td>Szyj elegancką (San Diego, Kalifornia)</td> Nie <td>dotyczy</td><td>Wykonane na zamówienie, <mocne>Rysunki 1, 4< / mocny></td></tr><tr><td>rura PVC 2 i frac12; "</td><td>U.S. Plastic Co.</td><td>34108</td><td>Rysunek 4</td></tr><tr><td>Subminiaturowe piny i gniazda D</td><td>TE Connectivity</td><td>205089-1</td><td>Rysunek 3< / mocny></td></tr><tr><td>Drut muzyczny ze stali nierdzewnej o średnicy 0,010"</td><td>Precision Brand Products, Inc.</td><td>21010</td><td>Rysunek 3</td></tr><tr><td>Stereotaktyczny uchwyt</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td>Rysunek 3</td></tr><tr><td>Stereotaktyczne nauszniki</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 957</td><td><mocny>Rysunek 3</silny></td></tr><tr><td>Manipulator stereotaktyczny</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 960</td><td><silny>Rysunek 3</silny></td></tr><tr><td>&frac12; mm wiertło wiertło</td><td>Henry Schein</td><td>100-3995</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne Quiet-Air</td><td>Midwest Dental</td><td>393-1600</td><td></td></tr><tr><td>Stal nierdzewna 0-80 i frac18; &rdquo; śruba</td><td>Łącznik supermarket</td><td>247438</td><td><mocny>Rysunek 3</mocny></td></tr><tr><td>0,2 ml probówka wirówkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-407-8A</td><td><mocny>Rysunek 3</mocny></td></tr><tr><td>Niestandardowy drążek do trzymania głowicy</td><td>UCSD SIO Warsztat mechaniczny</td><td>Nie dotyczy</td><td>Wykonane na zamówienie, <mocne>Rysunki 2 - 4</mocna></td></tr><tr><td>Niestandardowa płyta mocująca głowicę</td><td>UCSD SIO Warsztat mechaniczny</td><td>Nie dotyczy</td><td>Wykonane na zamówienie, <mocne>Rysunki 2 - 4</mocny></td></tr><tr><td>Kątowy zacisk słupkowy</td><td>Newport</td><td>MCA-1</td><td><mocny>Rysunki 3, 4</mocny>; standardowe części optomechaniczne do eksperymentalnego przyrządu (Rysunek 4) również pochodzą z Newport Corp.</td></tr><tr><td>8-32 &frac34; &rdquo; śruba</td><td>Łącznik Superstore</td><td>240181</td><td>Do zagłówka, <mocny>Rysunek 3</mocny></td></tr><tr><td>4-40 &frac14; &rdquo; śruba</td><td>Łącznik Superstore</td><td>239958</td><td>Do zagłówka, <mocny>Rysunki 3, 4</mocny></td></tr><tr><td>rurka kapilarna kwarcowa</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF-100-60-10</td><td><mocny>Rysunek 5</mocny></td></tr><tr><td>Ściągacz laserowy na dwutlenek węgla</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator z napędem</td><td>silnikowym Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz mikroelektrod</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Multiclamp 700B</td><td>Część alternatywna: Urządzenia molekularne Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Stopień głowicy wzmacniacza mikroelektrody</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>CV-7B</td><td>Część alternatywna: HS-9Ax10 z urządzeniami molekularnymi Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Izolowany stymulator impulsów</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2100</td><td>Część alternatywna: HS-9Ax10 z urządzeniami molekularnymi Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>Monitor audio</td><td>Radio Shack</td><td>32-2040</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na pipety</td><td>Warner Instruments</td><td>#MEW-F10T</td><td>Części alternatywne: patrz Dyskusja, Rysunek 6A</td></tr><tr><td>Przewód ołowiany elektrody</td><td>Drut Cooner</td><td>NEF34-1646</td> <td>(opcjonalnie), <mocny>Rysunek 6D</td></tr><tr><td>Przekaźnik do wzmacniacza stopnia czołowego</td><td>COTO Technology</td><td>#2342-05-000</td><td>(Opcjonalnie) Używany z wykonaną na zamówienie płytką drukowaną (UCSD Physics Electronics Shop), Rysunek 6A-C</td></tr><tr><td>Cyfrowa kamera wideo</td><td>Basler</td><td>A602fm</td> <td>(opcjonalnie) Do monitorowania behawioralnego, <silny>Rysunek 7</silny></td></tr><tr><td>Maść weterynaryjna Puralube</td><td>Amazon.com, Inc</td><td>NC0138063</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorowanie i lokalizacja pojedynczych neuronów w podkorowych strukturach mózgu czujnych, skrępowanych głową szczurów

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

Istnieje wiele technik monitorowania aktywności zewnątrzkomórkowej pojedynczych jednostek neuronalnych. Jednak monitorowanie tej aktywności na podstawie głębokich struktur mózgu u zachowujących się zwierząt pozostaje wyzwaniem technicznym, zwłaszcza jeśli struktury te muszą być celowane stereotaktycznie. Protokół ten opisuje wygodne techniki chirurgiczne i elektrofizjologiczne, które utrzymują głowę zwierzęcia w płaszczyźnie stereotaktycznej i jednoznacznie izolują aktywność impulsową pojedynczych neuronów. Protokół łączy w sobie zagłówek czujnych gryzoni, monitorowanie komórkowe za pomocą elektrod z mikropipetami oraz wstrzyknięcie barwnika jonoforetycznego w celu zidentyfikowania lokalizacji neuronu w histologii post-hoc. Chociaż każda z tych technik jest sama w sobie dobrze ugruntowana, protokół koncentruje się na specyfice ich łącznego zastosowania w jednym eksperymencie. Te techniki neurofizjologiczne i neuroanatomiczne są połączone z monitorowaniem behawioralnym. W niniejszym przykładzie połączone techniki są wykorzystywane do określenia, w jaki sposób samodzielnie generowane ruchy wibrysy są kodowane w aktywności neuronów w somatosensorycznym wzgórzu. Mówiąc bardziej ogólnie, łatwo jest dostosować ten protokół do monitorowania aktywności neuronalnej w połączeniu z różnymi zadaniami behawioralnymi u szczurów, myszy i innych zwierząt. Co najważniejsze, połączenie tych metod pozwala eksperymentatorowi na bezpośrednie powiązanie anatomicznie zidentyfikowanych sygnałów neurofizjologicznych z zachowaniem.

Jednostki neuronalne w brzuszno-przyśrodkowej części jądra tylnego (VPM) wzgórza kodują fazę ruchu wibrysy podczas samodzielnego drgania wąsów (whisking)15,16. Rycina 7A przedstawia przykładową aktywność impulsową jednostki VPM wzgórza podczas aktywnego drgania wąsów u szczura. Rycina 7B przedstawia histogram czasów wystąpienia impulsów wyrównany do chwilowej fazy ruchu wibrysy17. Więcej impulsów występuje podczas fazy retrakcji drgania wąsów. Po zakończeniu rejestr...

Ten protokół opisuje projektowanie i chirurgiczne wszczepienie mechanizmu krępującego głowę do monitorowania aktywności neuronalnej w podkorowych strukturach mózgu u szczurów czujnych. Wyznacza procedury izolowania pojedynczych neuronów w konfiguracji przyściennej i skutecznego identyfikowania ich lokalizacji anatomicznych.

Monitorowanie i lokalizacja pojedynczych neuronów w podkorowych strukturach mózgu czujnych, skrępowanych głową szczurów

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie i lokalizacja aktywności pojedynczych neuronów w strukturach podkorowych mózgu czujnych szczurów z unieruchomioną głową. Jest to osiągane poprzez wstępną aklimatyzację szczura do unieruchomienia ciała w materiałowej skarpetce. Drugim krokiem jest chirurgiczne wszczepienie aparatu do unieruchomienia głowy oraz komory rejestracyjnej w taki sposób, aby szczur mógł być utrzymywany w płaszczyźnie stereotaktycznej podczas wielu kolejnych sesji rejestracyjnych.Następnie szczura umieszcza się w odpowiednim uchwycie do przeprowadzenia eksperymentów behawioralnych i elektrofizjologicznych, a następnie wykonuje się rejestrację neuronalną metodą juxtacellular. Proces ten umożliwia jednoznaczne wyizolowanie pojedynczych jednostek. Ostatnim krokiem jest oznaczenie anatomicznej lokalizacji miejsca rejestracji barwnikiem Chicago Sky Blue, aby można go było zwizualizować podczas badania histologicznego post hoc.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodami, takimi jak rejestracja zewnątrzkomórkowa za pomocą metalowych mikroelektrod, jest możliwość jednoznacznej izolacji impulsów z pojedynczych jednostek oraz możliwość zlokalizowania miejsca rejestracji w badaniu histologicznym post hoc. Aby rozpocząć tę procedurę, uśpij zwierzę poprzez wstrzyknięcie ketaminy i ksylazyny. Sprawdź odruch wycofania palca, aby określić stopień znieczulenia, a następnie podtrzymaj anestezję poprzez dalsze podawanie środka znieczulającego.W razie potrzeby ogolić głowę i zdezynfekować miejsce operacji jodkiem powidonu. Następnie umieścić szczura w ramie stereotaksycznej i unieruchomić głowę za pomocą prętów usznych. Wykonać skalpelem nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki, od punktu pomiędzy oczami do tylnej części uszu.Następnie należy usunąć pas skóry o szerokości od dwóch do trzech milimetrów po obu stronach nacięcia. Zeskrobać okostną, aby odsłonić czaszkę aż do grzebieni bocznych. Następnie odsłoniętą czaszkę pokryć cienką warstwą superkleju.Następnie wywierć mały otwór bezpośrednio za miejscem, w którym szew bgma łączy się z grzebieniem bocznym, pod kątem od 30 do 45 stopni w głąb czaszki. W następnie wkręć w otwór wkręt maszynowy z płaskim dnem rozmiaru 0-80 pod kątem od 30 do 45 stopni; należy uważać, aby nie wkręcić go zbyt głęboko, aby uniknąć uszkodzenia leżącej poniżej tkanki mózgowej.Powtórz tę procedurę dla sześciu kolejnych śrub w tej konfiguracji. Następnie nałóż superklej u podstawy wszystkich śrub. Teraz umieść igłę strzykawki w manipulatorze stereotaktycznym.Za pomocą igły wykonaj wgłębienie w czaszce, aby zaznaczyć odpowiednie miejsce referencyjne. Następnie oznacz to wgłębienie trwałym markerem. W dalszej kolejności wykonaj kraniotomię wycentrowaną na pożądanej współrzędnej, pozostawiając oponę twardą nienaruszoną.Przykryj otwór trepanacyjny zmodyfikowanym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Następnie utnij probówkę wirówkową o objętości 0,2 ml na długość od czterech do pięciu milimetrów i odetnij nakrętkę. Umieść probówkę na czaszce, centrując ją nad otworem trepanacyjnym.Następnie nałóż cement stomatologiczny wokół dołu rurki, aby uszczelnić jej podstawę w miejscu przylegania do czaszki. Należy uważać, aby cement nie wpłynął do odsłoniętego otworu trepanacyjnego. Teraz wywierć kolejny mały otwór w przeciwległej części płytki czaszkowej.Ostrożnie włóż przewód referencyjny przylutowany do konektora pinu. Następnie nałóż superklej do otworu, w którym umieszczono przewód, aby unieruchomić pin i przewód. Następnie wymieszaj obie części zestawu żelu silikonowego w równych proporcjach.Odczekać dwie minuty i wypełnić probówkę wirówki żelem. Po wypełnieniu do około jednej trzeciej objętości, przymocować płytkę głowową do wspornika stabilizującego głowę. W tym przypadku wspornik został przymocowany do kątowego zacisku słupkowego pod kątem 45 stopni.Następnie przymocuj poprzeczkę mocującą do ramienia manipulatora stereotaktycznego za pomocą zacisku słupkowego w taki sposób, aby poprzeczka była równoległa do prętów usznych, a następnie opuść poprzeczkę i płytkę tak, aby płytka znajdowała się za szwem lambda i przed śrubą w okolicy guzka potylicznego. Następnie chwyć przednią śrubę głowową kleszczami pod kątem około 45 stopni, tak aby łeb śruby był skierowany w dół i w stronę ogona zwierzęcia. Po tym opuść śrubę, aż dotknie ona czaszki.Następnie unieruchom śrubę i płytkę w miejscu docelowym za pomocą akrylu dentystycznego. Nałóż warstwę cementu dentystycznego wokół krawędzi akrylu dentystycznego, aby przytwierdzić skórę do implantu. Po wyschnięciu cementu wykonaj kilka otworów w zakrętce probówki do wirowania i załóż zakrętkę na probówkę.Teraz zdejmij zacisk. Ostrożnie wyjmij poprzeczkę mocującą głowę ze stereotaksji. Następnie zdejmij płytkę mocującą głowę z poprzeczki.Na koniec wyjmij zwierzę ze stereotaksji i zapewnij opiekę oraz monitorowanie pooperacyjne. W tej procedurze wykorzystaj mikro-pipetę laserową z dwutlenkiem węgla z rurką z kapilary kwarcowej. Następnie unieruchom pipetę pod mikroskopem z kontrastem interferencyjnym różnicowym wyposażonym w obiektyw o dużej odległości roboczej.Powoli wprowadź blok szklany w pole widzenia za pomocą końcówki pipety. Używając mikromanipulatora przedniej platformy, odłam końcówkę pipety, delikatnie dotykając szkła. Powtarzaj procedurę, aż końcówka pipety.Średnica zewnętrzna wynosi od 1 do 3 µm. Następnie należy przygotować sól zewnątrzkomórkową i dodać 2% Chicago sky blue. Za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 30 G należy napełnić tylną część pipety roztworem.Następnie umieść szczura w materiałowej skarpetce i przenieś skarpetkę do sztywnej rurki zamocowanej na odpowiednim uchwycie eksperymentalnym. Przymocuj płytkę stabilizującą głowę szczura do odpowiadającego jej elementu uchwytu. Następnie nałóż nakrętkę 8 32 na śrubę stabilizującą głowę wszczepioną u szczura.Następnie wkręć gwintowany pręt ze stali nierdzewnej w śrubę czaszkową. Po tym otworzyć komorę rejestracyjną i usunąć żel silikonowy. Wyczyścić miejsce kraniotomii za pomocą precyzyjnej pęsety.Jeśli w miejscu kraniotomii odrosła tkanka, w razie potrzeby zastosuj znieczulenie izofluranem podczas tego procesu. Następnie przymocuj pipetę do zmotornego mikromanipulatora. Przesuń pipetę do pożądanego miejsca rejestracji w osiach przedniej, tylnej oraz przyśrodkowo-bocznej.Następnie przesuwaj pipetę w kierunku brzuszny przez oponę twardą, aż znajdzie się ona około 500 µm powyżej (grzbietowo) zamierzonego miejsca rejestracji. Powoli przesuwaj pipetę, nasłuchując zdarzeń impulsowych w monitorze audio wzmocnionego rejestrowanego napięcia. Po zidentyfikowaniu zdarzeń impulsowych kontynuuj przesuwanie pipety o około 0–100 µm, aż dodatnie odchylenia napięcia przekroczą około 500 µV.Aby oznakować miejsce rejestracji, ustaw źródło prądu na -4 µA z impulsami trwającymi 2 s przy cyklu pracy 50% i podawaj prąd przez cztery minuty do jonoforu, wstrzykując przez pipetę barwnik Chicago sky blue. Po zakończeniu eksperymentu przeprowadź perfuzję zwierzęcia zgodnie ze standardową procedurą. Następnie wykonaj skrawki mózgu i zastosuj barwienie kontrastowe, jeśli jest to konieczne, aby zidentyfikować anatomiczną lokalizację przedstawionego miejsca rejestracji.Oto przykładowa aktywność impulsowa jednostki wzgórzowej VPM podczas aktywnego poruszania wibrysami przez szczura. Poniżej znajduje się histogram czasów wystąpienia impulsów wyrównany do chwilowej fazy ruchu wibrys. W fazie cofania wibrys obserwuje się więcej impulsów.Po dokonaniu rejestracji lokalizacja tej jednostki została oznaczona za pomocą aferozy barwnika Chicago sky blue. Jak pokazano tutaj, tkanka została poddana barwieniu kontrastowemu na aktywność cytochromowej oksydazy, aby ujawnić neuroanatomiczne granice jądra VPM wzgórza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat przeprowadzania technik chirurgicznych i elektrofizjologicznych, które utrzymują głowę zwierzęcia w płaszczyźnie stereotaktycznej i jednoznacznie izolują aktywność impulsową pojedynczych neuronów.

juxtacellular-monitoring-localization-single-neurons-within-sub

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Monitorowanie przykomórkowe i lokalizacja pojedynczych neuronów w strukturach podkorowych mózgu u czujnych, ułożonych szczurów

Monitorowanie poziomów neurotransmiterów pozakomórkowych w określonych obszarach mózgu swobodnie poruszających się zwierząt dostarcza wiedzy na temat związku między uwalnianiem neurotransmiterów a zachowaniem. Mikrodializa in vivo w połączeniu z detekcją elektrochemiczną zapewnia doskonałą rozdzielczość anatomiczną i chemiczną, a także informacje o tym, w jaki sposób podstawowa neurotransmisja ulega zmianom pod wpływem manipulacji farmakologicznych lub fizjologicznych.

Przeżywalna operacja stereotaktyczna u gryzoni

Opisane zostaną zewnątrzkomórkowe rejestracje aktywności neuronalnej z wykorzystaniem sond krzemowych u znieczulonego szczura. Technika ta pozwala na pozyskiwanie informacji z wielu obszarów mózgu od ponad 100 neuronów jednocześnie. Dostarcza ona informacji z rozdzielczością pojedynczych komórek na temat dynamiki zespołów neuronalnych w wielu obwodach lokalnych.

Rejestracja wielkoskalowych zespołów neuronalnych za pomocą sond krzemowych u znieczulonego szczura

Ten film demonstruje szczegółową procedurę przygotowania znieczulonego szczura do elektrofizjologicznych zapisów aktywności mózgu z wielu miejsc. Skóra głowy jest preparowana w celu uzyskania dostępu do czaszki, a otwory są wiercone w precyzyjnych miejscach, aby zainstalować i zabezpieczyć elektrody. Elektrody wolframowe są następnie umieszczane w docelowym miejscu w celu zarejestrowania danych.

Elektrofizjologiczne zapisy in vivo aktywności mózgu z wielu miejsc u szczurów

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Źródło: Moore, J. D., et al. Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restricted Rats. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje metodę zestawiania nagrań komórkowych i barwienia u skrępowanego, przytomnego szczura. Zabieg polega na rejestrowaniu sygnałów z neuronów i wstrzykiwaniu barwnika w celu precyzyjnej lokalizacji miejsca zapisu. Technika ta pozwala na dokładne odwzorowanie aktywności neuronalnej na anatomiczną strukturę...

Zapis i barwienie Juxtacellular w celu precyzyjnego mapowania aktywności neuronalnej u obudzonego szczura 

Źródło: Lai, J., et al. Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcje środków hamujących do mózgu gryzonia. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje technikę opartą na mikroiniekcjach do jednoczesnego rejestrowania i hamowania neuronów w wzgórku górnym szczura. Procedura obejmuje celowanie stereotaktyczne, wiercenie czaszki i wprowadzenie iniekrody, która dostarcza neuroprzekaźnik hamujący, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów. Stymulacja światłem wywołuje potencjały...

Hamowanie aktywności neuronalnej i jej wykrywanie za pomocą elektrofizjologii u szczura

Aby zrozumieć strukturę sieci neuronowych, konieczna jest funkcjonalna i morfologiczna charakterystyka poszczególnych neuronów. Tutaj demonstrujemy znakowanie biocytyny przykłasomalnej, które umożliwia zapisy elektrofizjologiczne w konfiguracji zewnątrzkomórkowej, zachowując jednocześnie zdolność do wewnątrzkomórkowego znakowania neuronu w celu rekonstrukcji post hoc architektury dendrytycznej i aksonalnej.

Znakowanie biocytyny Juxtasomal w celu zbadania zależności struktura-funkcja poszczególnych neuronów korowych

Ta metoda tworzy namacalne, znajome środowisko dla myszy do nawigacji i eksploracji podczas obrazowania mikroskopowego lub jednokomórkowych zapisów elektrofizjologicznych, które wymagają mocnego unieruchomienia głowy zwierzęcia.

Płaska podłoga podniesiona powietrznie: nowa metoda łączenia zachowania z mikroskopią lub elektrofizjologią na obudzonych, swobodnie poruszających się gryzoniach

W tym badaniu przedstawiono metodologię wykonywania wielomiejscowych zapisów elektrofizjologicznych in vivo ze szlaku hiperbezpośredniego w znieczuleniu uretanowym.

Ostre zapisy elektrofizjologiczne in vivo lokalnych potencjałów pola i aktywności wielocząsteczkowej ze szlaku hiperbezpośredniego u znieczulonych szczurów

Po zintegrowaniu z płytą czołową i konstrukcją optyczną kompatybilną zarówno z mikroskopami jedno-, jak i dwufotonowymi, soczewka mikropryzmatyczna daje znaczącą przewagę w pomiarze odpowiedzi neuronalnych w pionowej kolumnie w różnych warunkach, w tym w dobrze kontrolowanych eksperymentach w stanach skupienia na głowie lub naturalnych zadaniach behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.

Długoterminowe obrazowanie zidentyfikowanych populacji neuronów za pomocą mikropryzmatów u zwierząt swobodnie poruszających się i z unieruchomioną głową

Podstawowe obszary czuciowe w korze nowej wykazują unikalne spontaniczne działania podczas rozwoju. W tym artykule opisano, jak wizualizować aktywność poszczególnych neuronów i podstawowych obszarów czuciowych w celu analizy synchronicznych działań specyficznych dla danego obszaru u noworodków myszy in vivo.

Wizualizacja in vivo spontanicznej aktywności w korze czuciowej noworodków myszy w rozdzielczości pojedynczego neuronu

Poznaj metodę juxtacelularnych rejestracji neuronów w strukturach podkorowych czujnych szczurów z utrzymaniem głowy. Technika umożliwia niejednoznaczną izolację pojedynczych jednostek i precyzyjną lokalizację anatomiczną.

Monitorowanie i lokalizacja pojedynczych neuronów w podkorowych strukturach mózgu czujnych, skrępowanych głową szczurów

Przeglądaj więcej filmów