Name: Pęseta magnetyczna do pomiaru skrętu i momentu obrotowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-19T16:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Poznaj techniki pęset magnetycznych do pomiaru skrętu i momentu obrotowego DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek. Metoda ta umożliwia badanie mechaniki DNA i interakcji z białkami w biologii molekularnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet Techniczny w Delft, Holenderską Organizację Badań Naukowych (NWO), Fundację Badań Podstawowych nad Materią oraz przez Europejską Fundację Nauki.

1. Przygotowanie i inkubacja próbki DNA
<ol>
	<li>Przygotuj konstrukty DNA, które są ligowane do końców dupleksowych (zwykle wykorzystują ≈ 600 pz fragmentów DNA PCR), które są funkcjonalizowane wieloma grupami biotyny i digoksygeniny, odpowiednio18. Na początek zalecana jest długość uwięzi DNA > 1 μm, np. 7,9 kbp odpowiadająca rozciągniętej długości ~2,7 μm, jak zastosowano tutaj, ze względu na łatwość użycia; w szczególności użycie długości DNA, która jest podobna lub krótsza niż promień stopki, jest problematyczne ze względu na geometrię mocowania w MTT i FOMT. Zobacz Dyskusję, aby dowiedzieć się, jak długość DNA wpływa na odpowiedź czasową w domenie kątowej.</li>
	<li>Zmontuj komórki przepływowe do eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami. W przypadku komórek przepływowych należy użyć dwóch szklanych szkiełek nakrywkowych mikroskopu oddzielonych dwuwarstwową przekładką Parafilm. Szkiełko nakrywkowe górnego mikroskopu powinno mieć dwa otwory na płyn wchodzący i odprowadzający do komórki. Do wiercenia otworów wygodnie jest używać piaskarki. Dolne szkiełko nakrywkowe pokryte jest nitrocelulozą (0,1% wag./obj. w octanie amylu). Umieść przekładki Parafilm po stronie pokrytej nitrocelulozą dolnych szkiełek i zamknij górę czystymi szkiełkami górnymi.</li>
	<li>Uszczelnij komory przepływowe. Za pomocą fizycznej pęsety umieść zmontowaną komórkę przepływową na płycie grzejnej ustawionej na 80-100 °C na ~1 min. Zwróć uwagę, że komora przepływowa jest dobrze uszczelniona, że Parafilm nie zamyka otworów łączących się z wlotem i wylotem oraz że szkiełka szklane są dobrze wyrównane. 
	Uwaga: Aby zapewnić dobre uszczelnienie, zaleca się wytrzepanie pęcherzyków w Parafilmie za pomocą dużego bawełnianego wacika. Komórkę przepływową można następnie zamontować na pęsetie magnetycznej.</li>
	<li>Przygotuj. Przygotować bufor do uwięzi TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i 200 mM NaCl). Alternatywnie można użyć buforu PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM buforu fosforanowego, pH 7,4) uzupełnionego 100 μg/ml BSA, 0,1% Tween i 5 mM azydku sodu (PBS+) jako buforu wiążącego. Przepłukać bufor tetheringowy TE o objętości 2-3 komórek do komory przepływowej.</li>
	<li>Inkubować niemagnetyczne kulki lateksowe o promieniu 0,5 lub 1,5 μm w komorze przepływowej przez ~30 minut. Kulki te będą działać jako kulki referencyjne podczas pomiarów pęsetą magnetyczną, co pozwala zminimalizować efekt dryfu między obiektywem a uchwytem próbki (tj. komórką przepływową). Wypłucz nieprzyczepione kulki niemagnetyczne, spłukując je 2-3 objętościami ogniw bufora tetheringowego TE.</li>
	<li>Funkcjonalizować dolną powierzchnię komory przepływowej przez inkubację z antydigoksygeniną w stężeniu 100 μg/ml w PBS przez co najmniej 1 godzinę (najlepiej dłużej; inkubację można przeprowadzić przez noc), aby zapewnić przyłączenie DNA. Przepłukać 2-3 objętościami komórek bufora do uwięzi TE. Na koniec inkubować komórkę przepływową z 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w buforze do wiązania TE przez 30 minut w celu pasywacji powierzchniowej.</li>
	<li>Pobrać podwielokrotność 2 ml superparamagnetycznych kulek MyOne pokrytych streptawidyną (patrz Dyskusja i Tabela Materiałów) i rozcieńczyć 10 ml buforu do wiązania TE. Przemyć dwukrotnie 10 ml buforu do tetheringu TE za pomocą magnetycznego koncentratora cząstek i ponownie zawiesić w 10 ml buforze do tetheringu TE. Przyłącz ~ 1 ml cząsteczek DNA (około 1 ng) do tych kulek przez inkubację w buforze do wiązania TE przez 30 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór superparamagnetycznych kulek na uwięzi DNA dziesięciokrotnie, dodając 90 ml buforu do wiązania TE. Na koniec wstrzyknąć roztwór do komórki przepływowej i inkubować przez ~ 1 godzinę, aby umożliwić przyłączenie DNA do powierzchni pokrytej anty-digoksygeniną. Dokładnie umyj komorę przepływową za pomocą bufora do uwięzi TE. Po inkubacji konstruktów na uwięzi DNA, należy dokładnie przepłukać eksperymentalnym buforem (może to być bufor do wiązania TE), aby usunąć wszystkie nieprzyłączone kulki.</li>
	<li>W przypadku pomiarów, które wykorzystują protokół śledzenia kątowego, który wymaga fiducialnych koralików znacznikowych przymocowanych do kulek magnetycznych23 (patrz Dyskusja), należy inkubować komórkę przepływową z 1000-krotnie rozcieńczonym zapasem kulek znacznikowych w buforze do uwięzi TE przez co najmniej 30 minut i dokładnie spłukać buforem.</li>
</ol>
2. Pomiary pojedynczej cząsteczki DNA w konwencjonalnej pęsetie magnetycznej
<ol>
	<li>Korzystając z konwencjonalnego MT (patrz Dyskusja) z odpowiednią konfiguracją pola (Rysunek 1a) i zarówno translacyjną, jak i rotacyjną kontrolą położenia magnesu, poszukaj rotacyjnie ograniczonych cząsteczek DNA w komórce przepływowej. Przy siłach ciągnących ≥ 1 pN (patrz odnośniki 4,19,20,28,29 dotyczące kalibracji siły w pęsetach magnetycznych), koraliki na uwięzi można łatwo odróżnić od koralików przyklejonych do powierzchni dolnego szkiełka na podstawie ich różnych wysokości w ognisku. To, czy cząsteczka DNA jest ograniczona rotacyjnie, można ocenić, wprowadzając 20-30 zwojów magnesów przy sile ≈ 0,25 pN: tutaj długość uwięzi powinna zmniejszyć się o 0,4-0,5 μm. 
	Uwaga: Aby przeprowadzić eksperymenty z pęsetą magnetyczną, przetwarzanie obrazu służy do określenia pozycji x, y i z koralików na uwięzi DNA. Niestandardowe oprogramowanie Labview do tego celu jest dostępne u autorów na życzenie.
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy koralik jest przymocowany pojedynczą linką DNA. Można tego dokonać, porównując zachowanie pod dodatnimi i ujemnymi zwojami przy siłach > 1 pN (rysunek 2a). W tym reżimie siłowym obecność wielu uwięzi DNA spowoduje w przybliżeniu symetryczny spadek rozciągnięcia po wprowadzeniu dodatnich i ujemnych zwojów, podczas gdy pojedyncze uwięzi DNA spowodują asymetryczną odpowiedź.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyszukaj odpowiednie stałe koraliki przyklejone do dolnej powierzchni w pobliżu interesującej Cię linki, które mogą służyć jako koraliki referencyjne.</li>
	<li>Skalibruj długość DNA, l. Położenie powierzchni komory przepływowej można określić, doprowadzając koralik na uwięzi do powierzchni (np. obracając magnes o ~60 obrotów z siłą poniżej 0,2 pN). Pomiary pionowego położenia stopki na uwięzi w stosunku do tej powierzchni wskazują na wartość bezwzględną l. 
	Uwaga: Aby zminimalizować późniejsze skutki dryftu, zaleca się wykonanie pomiarów l w stosunku do położenia stopki odniesienia przymocowanej do powierzchni.</li>
	<li>Zapisać krzywą rotacji (tj. pomiar wydłużenia DNA w funkcji liczby zwojów) przy sile rozciągającej ≈ 0,25 pN (rysunek 2a).
	<ol>
		<li>Określ liczbę zwojów, przy których rozciągnięcie jest maksymalne, ponieważ odpowiada to stanowi, w którym cząsteczka DNA jest rozluźniana skrętnie. W tym celu przydatne jest lokalne dopasowanie krzywej obrotu za pomocą funkcji parabolicznej lub gaussowskiej w celu określenia położenia środkowego. Zdefiniuj ten punkt jako "zero obrotów". 
		Uwaga: Specjalnie napisana w tym celu procedura jest dostępna u autorów na życzenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla serii ~20 pozycji magnesu należy określić średnie rozciągnięcie cząsteczki rozluźnionej skrętnie (tj. przy "zerowych obrotach", patrz krok 2.4.1) od śladu z.</li>
	<li>Dla każdego punktu pomiarowego w kroku 2.5 dokładnie określ siłę rozciągającą na podstawie wahań w pozycji x lub y 20,28,29 lub, jeśli namagnesowanie ściegu jest dobrze znane, korzystając ze znajomości lokalnego gradientu pola4. Wykreślenie siły rozciągającej w funkcji średniego wydłużenia daje w wyniku krzywą siła-wydłużenie (rysunek 2b).
	<ol>
		<li>Dopasuj wynikowe dane o rozciągnięciu siły do równania łańcucha podobnego do robaka, korzystając z przybliżenia wielomianu Bouchiata i wsp. 30.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowując się do kolejnych pomiarów FOMT, powoli obracaj magnesy, rejestrując ruchy kulki magnetycznej w (x,y). 
	Uwaga: Im mniejszy promień powstałego pierścienia w konwencjonalnej konfiguracji MT, tym ściślej cząsteczka DNA jest uwiązana bliżej "bieguna południowego" kulki magnetycznej. Kiedy przełączymy się na konfigurację FOMT, taka cząsteczka DNA będzie ściśle związana z "równikiem" koralika magnetycznego, co umożliwia niezawodne śledzenie kąta obrotu od pozycji (x,y) (patrz Dyskusja).</li>
</ol>
3. Pomiary skrętu DNA za pomocą swobodnie poruszającej się pęsety magnetycznej
<ol>
	<li>Ręcznie zastąp kwadratowe magnesy konwencjonalnej pęsety magnetycznej magnesem cylindrycznym, który jest używany do FOMT (Rysunek 1b). Operację tę należy wykonać w taki sposób, aby wybrana linka DNA pozostała w polu widzenia.
	<ol>
		<li>Można to osiągnąć w mniej niż 1 minutę, po prostu odkręcając całą głowicę magnesu, która utrzymuje magnesy w konwencjonalnej konfiguracji pęsety i zastępując ją głowicą magnetyczną, która zawiera magnes cylindryczny dla FOMT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skoki w (x,y) kulki magnetycznej uwiązanej pojedynczą linką dsDNA zależą silnie od położenia uwięzi w stosunku do osi magnesu cylindrycznego (rysunek 1b, rysunek 3a). Rejestruj przemieszczenia (x,y) w celu określenia odpowiedniego położenia w charakterystycznym wzorcu fluktuacji (Rysunek 3a, Omówienie).</li>
	<li>Wykonaj zgrubne wyrównanie magnesu w FOMT. Można to osiągnąć, przesuwając magnes cylindryczny nad komórką przepływową za pomocą etapów translacji (x,y). Jeśli ruchy (x,y) przebiegają po łuku, magnes cylindryczny nie jest prawidłowo wyrównany i należy go przesunąć w odpowiednim kierunku (rysunek 3b).
	<ol>
		<li>Wyrównanie zgrubne można wykonać w ciągu 15 minut w przypadku koralików MyOne z linkami 7,9 kbp i jest zakończone, gdy pomiar przemieszczeń (x,y) spowoduje obserwację ruchu kołowego (rysunek 3b, środek). 
		Uwaga: Zgrubne wyrównanie jest zwykle wystarczające do zaobserwowania zmian w skręceniu spowodowanych wiązaniem białek z pojedynczymi DNA uwiązanymi w konfiguracji FOMT21,31 (reprezentatywne wyniki, ryc. 5), pomimo faktu, że towarzyszący dwuwymiarowy histogram może nie mieć absolutnie równomiernie rozłożonych liczb wzdłuż okrągłego pierścienia (figura 3c).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli jest to wymagane do dalszych eksperymentów, wykonaj dokładne wyrównanie w FOMT. Można to osiągnąć za pomocą mikrometrycznych o wysokiej rozdzielczości lub zautomatyzowanego stolika o wysokiej rozdzielczości, który przesuwa magnes lub komórkę przepływową w celu wyśrodkowania magnesu cylindrycznego na stopce z dokładnością do ~10 μm. Na etapie precyzyjnego wyrównania magnes jest starannie ustawiany w taki sposób, aby fluktuacje na pierścieniu koła były prawie równomierne, co odpowiada sytuacji, w której bariera energetyczna dla pełnego obrotu spowodowanego przez magnes wynosi kBT (rysunek 4). 
	Uwaga: Skrypt MATLAB do wykreślania fluktuacji na histogramie lub termogramie, jak na rysunku 4, jest dostępny u autorów na żądanie. 
	Uwaga: Precyzyjne wyrównanie można osiągnąć w ciągu 45 minut w przypadku koralików MyOne z linkami 7,9 kbp, a w skróconych ramach czasowych stosuje się mniejsze koraliki i krótsze pasy (patrz Dyskusja). 
	Uwaga: Dokładne wyrównanie jest zwykle wymagane do wykonania pomiarów sztywności skrętnej gołego lub pokrytego białkiem DNA (reprezentatywne wyniki, rysunek 4).</li>
	<li>Jeśli jest to wymagane do analizy, skalibruj siłę w FOMT. Można to przeprowadzić w sposób analogiczny do MT, używając albo fluktuacji promieniowych stopki <r2> (gdzie nawiasy kątowe oznaczają średnią czasową), jak pokazano na załączonym filmie i szczegółowo opisanym w Lipfert et al21, lub, jeśli namagnesowanie koralika jest dobrze znane, wykorzystując wiedzę o lokalnym gradiencie pola21.</li>
</ol>
4. Pomiary momentu obrotowego DNA za pomocą magnetycznej pęsety dynamometrycznej
<ol>
	<li>Ręcznie zastąp magnes cylindryczny używany w FOMT magnesem cylindrycznym oraz magnesem bocznym (stałym) w MTT (Rysunek 1c). Operację tę należy wykonać w taki sposób, aby wybrana linka DNA pozostała w polu widzenia.
	<ol>
		<li>Najprostszym sposobem na osiągnięcie tego celu jest ręczne dodanie magnesu bocznego we właściwym miejscu, co można osiągnąć w ciągu 1 minuty. Nie jest konieczne dalsze wyrównanie. 
		Uwaga: Alternatywą dla magnesu bocznego jest zastosowanie elektromagnesów32.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli jest to wymagane do analizy, skalibrować siłę w sposób analogiczny do MT, wykorzystując fluktuacje x lub y ściegu lub, jeśli namagnesowanie kulki jest dobrze znane, wykorzystując wiedzę o lokalnym nachyleniu pola21.</li>
	<li>Śledź fluktuacje kątowe w funkcji czasu θ(t) za pomocą protokołu śledzenia opartego na zaufaniu23 lub, jak pokazano na załączonym filmie, protokołu śledzenia kątowego opartego na monitorowaniu pozycji (x,y) (patrz Dyskusja). W pierwszym przypadku należy zapisać pełne obrazy koralika w funkcji czasu w celu późniejszego przetwarzania obrazu. W tym drugim przypadku wystarczy zarejestrować wahania koralika (x,y) na tym etapie. 
	Uwaga: Skrypt MATLAB do określania θ(t) z pełnych obrazów koralika w funkcji czasu w protokole śledzenia opartym na zaufaniu jest dostępny u autorów na żądanie.
	<ol>
		<li>Jak opisano w Dyskusji, dla protokołu śledzenia kątowego opartego na monitorowaniu pozycji (x,y) zaleca się również rejestrowanie śladu czasowego, w którym magnesy są powoli (zwykle z częstotliwością 0,1 Hz) obracane o kilka obrotów. Pozwoli to na dokładne przeliczenie współrzędnych kartezjańskich (x,y) na współrzędne biegunowe (r,θ) za pomocą równań 3-5 z Dyskusji. 
		Uwaga: Skrypt MATLAB dla skryptu śledzenia kątowego opartego na monitorowaniu pozycji (x,y) jest dostępny u autorów na żądanie. 
		Uwaga: Czas pomiaru zależy głównie od żądanej rozdzielczości momentu obrotowego. Szczegółowy argument znajduje się w Lipfert i wsp. 24. Dla koralików MyOne i uwięzi DNA o długości 8 kbp pomiar przez 30-100 sekund powinien wystarczyć, aby uzyskać rozdzielczość momentu obrotowego w zakresie ~1 pN·nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznacz sztywność pułapki skrętnej na podstawie wariancji fluktuacji kątowych (σθ2 w radianach) za pomocą: 
	kθ = kBT / σθ2 (1) 
	Uwaga: Typowe sztywności pułapki rotacyjnej osiągane w MTT mieszczą się w zakresie 10-1 000 pN·nm/rad, czyli są niższe niż w przypadku konwencjonalnych pęset magnetycznych.</li>
	<li>Ponadto zapisz pozycję z stopki i użyj jej do określenia długości paska l (patrz również kroki 2.4-2.7).</li>
	<li>Obróć N obrotów i ponownie zapisz θ(t) i l(t). 
	Uwaga: Zmniejszona sztywność pułapki rotacyjnej MTT w porównaniu z MT sprawia, że nadaje się ona do pomiarów momentu obrotowego pojedynczej cząsteczki, ale oznacza, że maksymalny moment obrotowy, który może być wywierany, jest zmniejszony. Oznacza to, że MTT może nie być w stanie zrównoważyć wysokich momentów oporu spowodowanych szybkimi obrotami. W związku z tym należy uważać, aby nie przekroczyć prędkości maksymalnej; zwykle obracają się z szybkością bliską 0,1 Hz.</li>
	<li>Określ moment obrotowy zgromadzony w uwięzi kwasu nukleinowego po obrotach N za pomocą: 
	Γ = − kθ <θN - θ0> (2) 
	Gdzie <...> oznacza średnią, a θ0 i θN są kątem przy zerowych zwojach (odpowiadającym skrętnie rozluźnionemu uwięzi, por. odpowiednio krok 2.3 i N obrotów.</li>
	<li>W razie potrzeby powtórzyć kroki 4.5 i 4.6, aby w pełni określić reakcję cząsteczki na moment obrotowy w jednym przebiegu pomiarowym (reprezentatywne wyniki, rysunek 6).</li>
</ol>

<ol><li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+a+single+supercoiled+DNA+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The elasticity of a single supercoiled DNA molecule.</a> Science. 271, 1835-1837 (1996).</li>
<li>Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+tension%3A+single-molecule+DNA+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics.</a> Nature. 421, 423-427 (2003).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+modeling+and+optimization+of+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers.</a> Biophysical journal. 96, 5040-5049 (2009).</li>
<li>Ribeck, N., Saleh, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+single-molecule+measurements+with+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Review+of+scientific+instruments%22%5BJournal%5D)">Multiplexed single-molecule measurements with magnetic tweezers.</a> The Review of scientific instruments. 79, (2008).</li>
<li>De Vlaminck, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+magnetic+tweezers+by+targeted+DNA+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Highly parallel magnetic tweezers by targeted DNA tethering.</a> Nano letters. 11, 5489-5493 (2011).</li>
<li>Koster, D. A., Crut, A., Shuman, S., Bjornsti, M. A., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+strategies+for+regulating+DNA+supercoiling%3A+a+single-molecule+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular strategies for regulating DNA supercoiling: a single-molecule perspective.</a> Cell. 142, 519-530 (2010).</li>
<li>Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+genomic+processes+at+the+single-molecule+level%3A+introducing+the+tools+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications.</a> Nature reviews. Genetics. 14, 9-22 (2013).</li>
<li>Ajjan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+variation+in+the+C-terminal+region+of+the+fibrinogen+beta-chain%3A+effects+on+fibrin+structure%2C+fibrinolysis+and+clot+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Common variation in the C-terminal region of the fibrinogen beta-chain: effects on fibrin structure, fibrinolysis and clot rigidity.</a> Blood. 111, 643-650 (2008).</li>
<li>Mierke, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-coupling+and+regulation+of+contractility+by+the+vinculin+tail+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mechano-coupling and regulation of contractility by the vinculin tail domain.</a> Biophysical journal. 94, 661-670 (2008).</li>
<li>Shang, H., Lee, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers+measurement+of+the+bond+lifetime-force+behavior+of+the+IgG-protein+A+specific+molecular+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers measurement of the bond lifetime-force behavior of the IgG-protein A specific molecular interaction.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 6640-6646 (2007).</li>
<li>Shang, H. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+magnetic+force+differentiation+for+the+measurement+of+the+affinity+of+peptide+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Magn+Mater%22%5BJournal%5D)">The application of magnetic force differentiation for the measurement of the affinity of peptide libraries.</a> J Magn Magn Mater. 293, 382-388 (2005).</li>
<li>Lee, G. U., Metzger, S., Natesan, M., Yanavich, C., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+force+differentiation+in+the+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Implementation of force differentiation in the immunoassay.</a> Analytical biochemistry. 287, 261-271 (2000).</li>
<li>Smith, A. S., Sengupta, K., Goennenwein, S., Seifert, U., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-induced+growth+of+adhesion+domains+is+controlled+by+receptor+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Force-induced growth of adhesion domains is controlled by receptor mobility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6906-6911 (2008).</li>
<li>Kanger, J. S., Subramaniam, V., van Driel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+manipulation+of+chromatin+using+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research+%3A+an+international+journal+on+the+molecular%2C+supramolecular+and+evolutionary+aspects+of+chromosome+biology%22%5BJournal%5D)">Intracellular manipulation of chromatin using magnetic nanoparticles.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 16, 511-522 (2008).</li>
<li>Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers in cell biology.</a> Methods in cell biology. 83, 473-493 (2007).</li>
<li>Bausch, A. R., Moller, W., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+local+viscoelasticity+and+forces+in+living+cells+by+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of local viscoelasticity and forces in living cells by magnetic tweezers.</a> Biophysical journal. 76, 573-579 (1999).</li>
<li>Lipfert, J., Koster, D. A., Vilfan, I. D., Hage, S., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+magnetic+tweezers+studies+of+type+IB+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule magnetic tweezers studies of type IB topoisomerases.</a> Methods Mol Biol. 582, 71-89 (2009).</li>
<li>Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVilfan%2C+ID+%22Handbook+of+Single-Molecule+Biophysics%22">Handbook of Single-Molecule Biophysics</a>. Hinterdorder, P., van Oijen, A. , Springer. (2009).</li>
<li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers%3A+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophysical journal. 82, 3314-3329 (2002).</li>
<li>Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freely+orbiting+magnetic+tweezers+to+directly+monitor+changes+in+the+twist+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids.</a> Nature communications. 2, 439(2011).</li>
<li>Celedon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers+measurement+of+single+molecule+torque%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers measurement of single molecule torque.</a> Nano letters. 9, 1720-1725 (2009).</li>
<li>Lipfert, J., Kerssemakers, J. J., Rojer, M., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+track+rotational+motion+for+use+in+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Review+of+scientific+instruments%22%5BJournal%5D)">A method to track rotational motion for use in single-molecule biophysics.</a> The Review of scientific instruments. 82, (2011).</li>
<li>Lipfert, J., Kerssemakers, J. W., Jager, T., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+torque+tweezers%3A+measuring+torsional+stiffness+in+DNA+and+RecA-DNA+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Magnetic torque tweezers: measuring torsional stiffness in DNA and RecA-DNA filaments.</a> Nature. 7, 977-980 (2010).</li>
<li>Mosconi, F., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+torque+on+a+single+stretched+and+twisted+DNA+using+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Measurement of the torque on a single stretched and twisted DNA using magnetic tweezers.</a> Physical review letters. , 102(2009).</li>
<li>Mosconi, F., Allemand, J. F., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+magnetic+tweezers%3A+A+proof+of+principle%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Soft magnetic tweezers: A proof of principle.</a> Review of Scientific Instruments. 82 (12), (2011).</li>
<li>Kauert, D. J., Kurth, T., Liedl, T., Seidel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+reveal+the+material+properties+of+three-dimensional+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements reveal the material properties of three-dimensional DNA origami.</a> Nano letters. 11, 5558-5563 (2011).</li>
<li>Velthuis, A., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Guidelines+for+Force+Calibration+through+Spectral+Analysis+of+Magnetic+Tweezers+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative Guidelines for Force Calibration through Spectral Analysis of Magnetic Tweezers Data.</a> Biophysical journal. 99, 1292-1302 (2010).</li>
<li>Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+spectrum+and+Allan+variance+methods+for+calibrating+single-molecule+video-tracking+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Review+of+scientific+instruments%22%5BJournal%5D)">Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments.</a> The Review of scientific instruments. 83, (2012).</li>
<li>Bouchiat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+persistence+length+of+a+worm-like+chain+molecule+from+force-extension+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements.</a> Biophysical journal. 76, 409-413 (1999).</li>
<li>Lee, M., Lipfert, J., Sanchez, H., Wyman, C., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+torsional+properties+of+the+RAD51-dsDNA+nucleoprotein+filament%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Structural and torsional properties of the RAD51-dsDNA nucleoprotein filament.</a> Nucleic acids research. 41, (2013).</li>
<li>Janssen, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromagnetic+torque+tweezers%3A+a+versatile+approach+for+measurement+of+single-molecule+twist+and+torque%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Electromagnetic torque tweezers: a versatile approach for measurement of single-molecule twist and torque.</a> Nano letters. 12, 3634-3639 (2012).</li>
<li>Baumann, C. G., Smith, S. B., Bloomfield, V. A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+effects+on+the+elasticity+of+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ionic effects on the elasticity of single DNA molecules.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 6185-6190 (1997).</li>
<li>Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freely+orbiting+magnetic+tweezers+to+directly+monitor+changes+in+the+twist+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids.</a> Nat Commun. 2, 439(2011).</li>
<li>Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+algorithms+for+tracking+single+fluorescent+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles.</a> Biophys. J. 81, 2378-2388 (2001).</li>
<li>Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+kinesin-driven+movements+with+nanometre-scale+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision.</a> Nature. 331, 450-453 (1988).</li>
<li>Loenhout, M. T., Kerssemakers, J. W., De Vlaminck, I., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-bias-limited+tracking+of+spherical+particles%2C+enabling+nanometer+resolution+at+low+magnification%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Non-bias-limited tracking of spherical particles, enabling nanometer resolution at low magnification.</a> Biophysical journal. 102, 2362-2371 (2012).</li>
<li>Kim, K., Saleh, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+magnetic+tweezer+for+single-molecule+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A high-resolution magnetic tweezer for single-molecule measurements.</a> Nucleic acids research. 37, 136(2009).</li>
<li>Deufel, C., Forth, S., Simmons, C. R., Dejgosha, S., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofabricated+quartz+cylinders+for+angular+trapping%3A+DNA+supercoiling+torque+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Nanofabricated quartz cylinders for angular trapping: DNA supercoiling torque detection.</a> Nature methods. 4, 223-225 (2007).</li>
<li>Huang, Z., Pedaci, F., van Oene, M., Wiggin, M. J., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+beam+fabrication+of+birefringent+microcylinders%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Electron beam fabrication of birefringent microcylinders.</a> ACS nano. 5, 1418-1427 (2011).</li>
<li>La Porta, A., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+torque+wrench%3A+angular+trapping%2C+rotation%2C+and+torque+detection+of+quartz+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Optical torque wrench: angular trapping, rotation, and torque detection of quartz microparticles.</a> Physical review letters. 92, (2004).</li>
<li>Gore, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+overwinds+when+stretched%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA overwinds when stretched.</a> Nature. 442, 836-839 (2006).</li>
<li>Bryant, Z., Oberstrass, F. C., Basu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+single-molecule+DNA+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent developments in single-molecule DNA mechanics.</a> Curr Opin Struct Biol. 22, 304-312 (2012).</li>
<li>Oberstrass, F. C., Fernandes, L. E., Bryant, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque+measurements+reveal+sequence-specific+cooperative+transitions+in+supercoiled+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Torque measurements reveal sequence-specific cooperative transitions in supercoiled DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6106-6111 (2012).</li>
<li>Forth, S., Sheinin, M. Y., Inman, J., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque+measurement+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Torque measurement at the single-molecule level.</a> Annu Rev Biophys. 42, 583-604 (2013).</li>
</ol>

Patent związany z tą pracą został złożony pod numerem referencyjnym PCT/NL2011/050446.

Podczas przeprowadzania eksperymentów z wykorzystaniem MTT lub FOMT należy dokonać szeregu wyborów dotyczących kulek, magnesów, protokołów śledzenia itp. Optymalne decyzje będą zależały od celu konkretnego doświadczenia. Poniżej opisujemy kompromisy związane z różnymi wyborami, co powinno ułatwić dobór parametrów do danego eksperymentu. Następnie opisujemy kilka krytycznych etapów towarzyszących wyrównaniu i przeprowadzaniu eksperymentów MTT oraz FOMT. Na koniec omawiamy znaczenie MTT i FOMT w odniesieniu do istniejących metod, a także potencjalne przyszłe zastosowania.
Kwestie do rozważenia przed rozpoczęciem eksperymentów MTT i FOMT
Każdy eksperyment wymaga wyboru odpowiedniego rodzaju koralików magnetycznych. Do wyboru jest kilka dostępnych komercyjnie superparamagnetycznych koralików powlekanych streptawidyną, np. koraliki o promieniu 0,25 μm, 0,5 μm lub 1,4 μm (patrz tabela Materiały). Większe koraliki posiadają większy moment magnetyczny w porównaniu do koralików mniejszych (skaluje się on w przybliżeniu wraz z objętością), a zatem ich zastosowanie ułatwi przyłożenie większych sił (typowych sił osiąganych w naszych instrumentach przedstawiono w Tabeli 1). W przypadku potrzeby śledzenia kątowego przy użyciu koralików znacznikowych, zazwyczaj pracujemy z koralikami o promieniu 1,4 μm i wykorzystujemy niemagnetyczne koraliki biotynilowane o promieniu 0,5 μm jako koraliki znacznikowe (patrz akapit 1.9 w celu zapoznania się z odpowiednim protokołem przyłączania). Stosowanie mniejszych koralików jest szczególnie zalecane dla FOMT, ponieważ charakterystyczna skala czasowa rotacji koralików τC odpowiada stosunkowi oporu systemu do jego stałej sprężystości γ/kθ; co istotne, współczynnik oporu rotacyjnego istotny dla skali czasu pomiaru kątowego skaluje się jako ~ Rbead3, t.j. z trzecią potęgą promienia (patrz Tabela 2 w celu uzyskania charakterystycznych skal czasowych dla kilku kombinacji koralików-DNA w pomiarach FOMT i MTT). Towarzyszące temu ograniczenia maksymalnej siły, jaką można przyłożyć, można rozwiązać, stosując odwrócony stos magnesów cylindrycznych27. Niemniej jednak, w pomiarach FOMT czasami może być konieczny kompromis między najlepszą osiągalną rozdzielczością czasową a maksymalną przyłożoną siłą.
Dodatkowo, eksperyment wymaga wyboru konfiguracji magnesów. W konwencjonalnej konfiguracji pęsety magnetycznej (Rycina 1a) zazwyczaj stosujemy parę sześcianowych magnesów o wymiarach 5x5x5 mm w orientacji pionowej, z przerwą między magnesami wynoszącą 0,5 lub 1 mm4. Gdy magnesy są rozmieszczone wzdłuż osi x (y), generuje to pole magnetyczne skierowane głównie wzdłuż osi x (y). W eksperymentach FOMT wybierany jest magnes o kształcie cylindrycznym, w którego centrum pole magnetyczne jest skierowane głównie wzdłuż osi z (Rycina 1b). W praktyce stosujemy stos trzech takich magnesów cylindrycznych, z których każdy ma średnicę 6 mm i centralny otwór o średnicy 2 mm, co daje całkowitą grubość 6 mm. Gdy pożądane są wyższe siły rozciągania, preferowana jest konfiguracja magnesów w formie „odwróconego stosu” (flipped stack), w której dolny magnes jest ułożony z przeciwną magnetyzacją. Aby uzyskać konfigurację MTT (Rycina 1c), dodajemy dodatkowy magnes z boku głównego stosu magnesów konfiguracji FOMT, zazwyczaj pełny cylinder o średnicy 4 mm i wysokości 7 mm. W celu sprawdzenia, jak maksymalne siły osiągane w naszych instrumentach zależą od konfiguracji magnesów, należy zapoznać się z Tabelą 1.
Korelacja eksperymentów MTT i FOMT
Ponieważ kulki magnetyczne mają (w przybliżeniu) jednorodnie funkcjonalizowaną powierzchnię (zazwyczaj streptawidyną), a przyłączanie zarówno funkcjonalizowanych wiązań kwasów nukleinowych, jak i kulek markerowych (w przypadku zastosowania śledzenia kątowego opartego na kulkach markerowych) odbywa się poprzez prostą inkubację w roztworze, nie ma się kontroli nad tym, w którym miejscu wiązanie i/lub kulka markerowa przyłączą się do kulki magnetycznej. Kulki magnetyczne posiadają preferowaną oś namagnesowania, która ma tendencję do ustawiania się wzdłuż kierunku zewnętrznego pola. Jeśli oznaczymy punkty, w których preferowana oś namagnesowania przecina powierzchnię kulki, jako biegun północny i południowy, to kulki, w których wiązanie DNA jest przyłączone blisko równika, będą kreślić pierścień kołowy o promieniu zbliżonym do promienia kulki lub nieco większym od niego w FOMT; z kolei kulki przyłączone blisko bieguna południowego będą fluktuować na pierścieniu kołowym o bardzo małym promieniu w FOMT, co może uniemożliwić dopasowanie okręgu przy użyciu równań 3-5. Zauważamy, że na podstawie prostej geometrii sferycznej prawdopodobieństwo przyłączenia w pobliżu równika jest znacznie większe niż przyłączenie dokładnie na biegunach; w związku z tym większość kulek zostanie powiązana w taki sposób, aby śledzenie kątowe oparte na (x,y) mogło zostać pomyślnie przeprowadzone.
Podobny argument dotyczy przytwierdzania koralików znacznikowych w śledzeniu kątowym opartym na markerach fiducjalnych. Koralik znacznikowy służy do stworzenia asymetrii w obrazie koralika magnetycznego, co umożliwia śledzenie kąta. Jeśli koralik znacznikowy zostanie przytwierdzony dokładnie na biegunie północnym lub południowym koralika (t.j. bezpośrednio na górze lub na dole), otrzymany obraz pozostaje symetryczny obrotowo, a protokół śledzenia kątowego zawodzi. Jednakże, stosując ten sam argument z geometrii sferycznej, szansa na to, że koralik znacznikowy przytwierdzi się bezpośrednio na jednym z biegunów, jest stosunkowo mała; w praktyce stwierdzamy, że większość koralików znacznikowych zapewnia wystarczającą asymetrię, aby umożliwić śledzenie kątowe. Na koniec zauważamy, że w konwencjonalnych pęsetach magnetycznych kierunek pola znajduje się w płaszczyźnie (x,y); zatem preferowana oś namagnesowania koralika będzie wyrównana w płaszczyźnie (x,y), a bieguny północny i południowy, zdefiniowane powyżej, znajdą się po bokach koralika, w przeciwieństwie do sytuacji w FOMT lub MTT, gdzie bieguny znajdują się na górze i na dole.
W eksperymentach FOMT krytycznym krokiem jest ustawienie magnesu cylindrycznego w taki sposób, aby radialne pole magnetyczne w pobliżu kuleczki było pomijalnie małe. Ustawienie to przeprowadza się dla każdej kuleczki z osobna. Aby ocenić, czy ruch kuleczki w FOMT jest równomiernie rozłożony w obrębie pierścienia okrężnego, czas pomiaru powinien przekraczać 20·τC. Ponieważ τC wynosi ~45 sec dla DNA o długości 8 kbp i kuleczki o promieniu 0,5 mm, czas pomiaru w końcowych etapach ustawiania wynosi ~900 sec. Dla porównania, zastosowanie DNA o długości 1,9 kbp i kuleczek o promieniu 0,25 mm zmniejsza τC dwudziestokrotnie, do ~2 sec (patrz również Tabela 2).
Kluczowe kroki i uwagi dotyczące śledzenia podczas eksperymentów FOMT i MTT
Aby śledzić fluktuacje kulki w płaszczyźnie, t.j. jej pozycję (x,y), stosujemy analizę korelacji wzajemnej profili intensywności wykazywanych przez kulkę w kolejnych odstępach czasu35,36. Może to być wykonane z rozdzielczością subpikselową z dokładnością do kilku nanometrów20. Do śledzenia ruchu kulki w osi z zazwyczaj używamy metody opracowanej pierwotnie przez Gosse i Croquette, w której płaszczyznę ogniskową obiektywu (OFP) precyzyjnie przesuwa się w kierunku pionowym podczas obrazowania pierścieni dyfrakcyjnych kulki przyłączonej do kwasu nukleinowego20. W ten sposób generowany jest profil kalibracyjny korelujący wzór dyfrakcyjny kulki z odległością między kulką a OFP19. Po interpolacji tego profilu kalibracyjnego można również zmierzyć przemieszczenia pionowe kulki z dokładnością do kilku nm20. Odsyłamy czytelnika do dodatkowych źródeł opisujących bardziej zaawansowane algorytmy śledzenia37,38 oraz ich zastosowanie w równoległym śledzeniu wielu kulek5,6,37.
W przypadku stosowania śledzenia kątowego opartego na konwersji pozycji (x,y) na współrzędne kątowe, zalecamy postępować w następujący sposób. Wykorzystując zapis czasowy, w którym kuleczka kreśli pierścień okrężny, należy użyć pozycji (xi ,yi) (gdzie indeks i oznacza kolejne punkty pomiarowe), aby dopasować środek okręgu (x0, y0) oraz promień Rcircle (Rysunek 2a) poprzez minimalizację:
<img src="/files/ftp_upload/51503/51503eq3.jpg" width="320" fo:content-width="3.2in" alt="Równanie dopasowania okręgu, Σ((xi-x0)²+(yi-y0)²-R²)², diagram matematyczny, metoda optymalizacji." data-altupdatedat="1787630408000"> (3)
gdzie suma obejmuje wszystkie punkty danych. Po dopasowaniu x0, y0 oraz Rcircle, wyznacz współrzędne biegunowe (ri ,θi) każdego punktu danych w przebiegu czasowym, korzystając z:
<img src="/files/ftp_upload/51503/51503eq4.jpg" width="200" fo:content-width="2in" alt="Wzór na odległość, \( r_i = \sqrt{(x_i-x_0)^2 + (y_i-y_0)^2} \), matematyczna koncepcja równania." data-altupdatedat="1787630408000"> (4)
<img src="/files/ftp_upload/51503/51503eq5.jpg" width="120" fo:content-width="1.2in" alt="Wzór na obliczenie kąta θ=arctan((y_i-y_0)/(x_i-x_0)), równanie matematyczne." data-altupdatedat="1787630408000">(5)
Należy pamiętać o konieczności "rozwinięcia" kąta θ, t.j. o dodanie skoków fazy ±π w odpowiednich miejscach. Kod napisany na zamówienie do dopasowania i konwersji z współrzędnych (x,y) na (r, θ) jest dostępny u autorów na zapytanie. W FOMT ślad czasowy, w którym kuleczka kreśli pierścień okrężny, można uzyskać poprzez przeprowadzenie wstępnego wyrównania (por. krok 3.3) i rejestrację fluktuacji termicznych kuleczki. W MTT fluktuacje termiczne są niewystarczające do wykreślenia pierścienia okrężnego; zamiast tego należy użyć śladu czasowego, w którym magnesy są powoli (zazwyczaj z częstotliwością 0.1 Hz) obracane o kilka obrotów, aby dopasować okrąg przy użyciu równań 3-5.
Zauważamy, że w przypadku MTT istotny jest wybór odpowiedniego podejścia do śledzenia kątowego, t.j. poprzez marker śledzenia kątowego (Rysunek 1c, Rysunek 1d, Rysunek 3a) lub poprzez konwersję pozycji (x,y) na współrzędne kątowe (Rysunek 1d, Rysunek 2b). Choć zazwyczaj dokładność śledzenia kątowego z pozycji (x,y) i wykorzystanie kulek markerowych są porównywalne, należy mieć na uwadze, że występuje interferencja (crosstalk) między fluktuacjami kulki w płaszczyźnie (x,y) a fluktuacjami kątowymi, jak opisano w pracy Janssen et al32: zatem śledzenie kątowe z pozycji (x,y) jest poprawne tylko wtedy, gdy fluktuacje brownowskie w (x,y) wnoszą jedynie pomijalny wkład do niepewności współrzędnej kątowej, a prawidłowe zastosowanie śledzenia (x,y) może wymagać dostrojenia sztywności pułapki rotacyjnej poprzez regulację położenia magnesu bocznego. Zazwyczaj zastosowanie wyższej sztywności pułapki wymaga wykorzystania śledzenia kątowego z użyciem kulek markerowych. Stosowanie kulek markerowych wymaga dodatkowego etapu przyłączania, co może zmniejszyć liczbę użytecznych wiązań (patrz protokół przyłączania w kroku 1.9). Podczas korzystania ze śledzenia opartego na kulkach markerowych, dla uzyskania najlepszych wyników ważne jest wybranie kulek magnetycznych, w których kulka markerowa jest przymocowana w pobliżu równika.
Znaczenie podejść FOMT i MTT w porównaniu do istniejących metod i zastosowań
W powyższej części pokazaliśmy, w jaki sposób, wychodząc od konwencjonalnej MT, można łatwo zmodyfikować konfiguracje magnesów, aby przekształcić instrument w MTT lub FOMT. Ta prosta modyfikacja, której może towarzyszyć wprowadzenie śledzenia kątowego w przypadku potrzeby użycia markera śledzącego kąt, jest bezpośrednim atutem obu konfiguracji, ponieważ pozwala użytkownikowi na przyłożenie momentu obrotowego, pomiar momentu obrotowego lub pomiar skręcenia w zależności od prowadzonego eksperymentu. Jak wspomniano we Wstępie, zarówno FOMT, jak i MTT korzystają z wielu istniejących zalet MT, w szczególności z ich prostoty, przy czym MTT dodatkowo oferuje możliwość pomiarów równoległych5,6 (trudniej je osiągnąć w FOMT ze względu na wymóg wyrównania wiązania względem centrum magnesu cylindrycznego). Co istotne, MTT i FOMT nie wymagają, w przeciwieństwie do innych technik, specjalnie nanofabrykowanych cząstek22,39,40, złożonego układu optycznego41 ani wprowadzania dodatkowych kuleczek do powiązanegot cząsteczki (DNA)42. Inne techniki mogą jednak zapewniać inne korzyści, takie jak wyższa rozdzielczość czasowa27,43,44. Zarówno FOMT, jak i MTT powinny znaleźć przyszłe zastosowania w badaniach nad przetwarzaniem genomu, ponieważ zachowanie silników molekularnych na DNA jest zarówno wpływane przez lokalne skręcenie i moment obrotowy, jak i ma na nie wpływ. Dodatkowe zastosowania można znaleźć w rozwijającej się dziedzinie nanotechnologii DNA27 lub w szerszej dziedzinie silników obrotowych aktywnych w procesach biologicznych7,45.
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>M270 (Rkoralik = 1.4 µm)</td>
			<td>MyOne (Rkuleczka = 0.5 µm)</td>
			<td>Ademtech (Rkuleczka = 0.25 µm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Konwencjonalne MT (para sześcianów o wymiarach 5 x 5 x 5 mm3 magnesy, szczelina 1 mm, wyrównanie pionowe)</td>
			<td>70 pN</td>
			<td>8 pN</td>
			<td>1,6 pN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOMT lub MTT* (stos trzech magnesów cylindrycznych, średnica 6 mm, szczelina o szerokości 2 mm)</td>
			<td>9 pN</td>
			<td>1 pN</td>
			<td>0,2 pN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOMT lub MTT* (stos trzech magnesów cylindrycznych, średnica 6 mm, przerwa o szerokości 1 mm)</td>
			<td>18 pN</td>
			<td>2 pN</td>
			<td>0,4 pN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOMT lub MTT* (stos trzech magnesów cylindrycznych, z których ostatni jest odwrócony, przerwa o średnicy 1 mm)</td>
			<td>~50 pN</td>
			<td>9 pN</td>
			<td>1,8 pN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*Obecność małego magnesu bocznego w MTT ma pomijalny wpływ na siłę rozciągania
Tabela 1. Maksymalne siły zazwyczaj osiągane dla różnych konfiguracji magnesów i rodzajów kulek.
<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody >
		<tr >
			<td></td>
			<td >Rbead = 1.4 µm</td>
			<td >Rbead = 0.5 µm</td>
			<td >Rbead = 0.25 µm</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Współczynnik tarcia*</td>
			<td >120 pN·nm·sec</td>
			<td >5.5 pN·nm·sec</td>
			<td >0.7 pN·nm·sec</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Charakterystyczna skala czasu: FOMT, 10 kbp DNA**</td>
			<td >1200 sec</td>
			<td >55 sec</td>
			<td >7 sec</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Charakterystyczna skala czasu: FOMT, 1 kbp DNA</td>
			<td >120 sec</td>
			<td >5.5 sec</td>
			<td >0.7 sec</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Charakterystyczna skala czasu: MTT, kq = 100 pN·nm/rad</td>
			<td >1.2 sec</td>
			<td >0.06 sec</td>
			<td >0.007 sec</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Charakterystyczna skala czasu: MTT, kq = 1000 pN·nm/rad</td>
			<td >0.12 sec</td>
			<td >0.006 sec = 6 msec</td>
			<td >0.0007 s = 0.7 msec</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
*Współczynnik tarcia dla obrotu wokół osi przechodzącej przez „równik” (tj. sytuacja przedstawiona na Ryc. 1b), wyrażony wzorem 14·p·h·Rbead3, gdzie h to lepkość buforu. 
**W FOMT sztywność pułapki rotacyjnej jest określona przez sztywność skrętną DNA, kq,DNA = C·kBT/LC, gdzie C to efektywna długość persystencji skrętnej, przyjęta tutaj na poziomie 80 nm (co jest charakterystyczne dla pośredniego zakresu sił, F ~ 1 pN), a LC to długość konturowa DNA, 0,34 nm na parę zasad.
Tabela 2. Współczynniki tarcia i charakterystyczne skale czasowe dla FOMT i MTT.

W ostatnich latach techniki jednocząsteczkowe udowodniły swoje szerokie zastosowanie w badaniach procesowych białek motorycznych i innych enzymów, dając wgląd w ich kinetykę i podstawową mechanochemię. W kontekście spektroskopii sił, istotny wkład wniosły mikroskopia sił atomowych, rozciąganie przepływowe oraz pęsety optyczne i magnetyczne. Pęsety optyczne i magnetyczne (MT) udało się w szczególności połączyć dużą elastyczność w zakresie manipulacji molekularnej z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Tutaj skupiamy się na MT, który może przykładać zarówno siły rozciągające, jak i momenty obrotowe do cząsteczek biologicznych uwięzionych między powierzchnią a kulkami superparamagnetycznymi1-3.
Pęseta magnetyczna (MT, Rysunek 1a) to bardzo wszechstronna technika jednocząsteczkowa, która została wykorzystana do monitorowania zarówno właściwości mechanicznych kwasów nukleinowych, jak i ich interakcji z białkami. MT mają wiele mocnych stron, w tym ogólną prostotę i solidność implementacji eksperymentalnej, łatwe zastosowanie momentu obrotowego, naturalną pracę i prostą kalibrację w trybie stałej siły4, rozszerzenie do pomiarów równoległych 5,6 oraz brak nagrzewania próbki i fotouszkodzeń. W porównaniu z innymi metodami opartymi na pojedynczych cząsteczkach, MT umożliwiają wykonywanie pomiarów zależności od siły przy siłach tak niskich, jak ≈ 10 fN i mają możliwość bezpośredniego kontrolowania stopnia superzwijania. Podczas gdy MT były wykorzystywane głównie jako narzędzie eksperymentalne do badania procesów biologicznych z udziałem kwasów nukleinowych 7,8, znalazły również zastosowanie w badaniach właściwości mechanicznych białek9-13 lub komórek 10,14-17. Dostępnych jest wiele przydatnych referencji, które opisują, jak zbudować i uruchomić MT 4,18-20.
Jednak konwencjonalne MT nie śledzą bezpośrednio ruchu obrotowego, a podczas gdy stosują moment obrotowy, nie mierzą momentu bezpośrednio obrotowego. Ponadto ograniczają swobodną rotację uwięzi kwasu nukleinowego. Poniżej prezentujemy dwa przedłużenia pęsety magnetycznej. Pierwsza, zwana pęsetą magnetyczną swobodnie orbitującą (FOMT, rysunek 1b)21, umożliwia pomiary fluktuacji kąta równowagi i zmian skrętu cząsteczek kwasu nukleinowego na uwięzi, bez ograniczania ruchu obrotowego wokół osi uwięzi. Druga, zwana magnetyczną pęsetą dynamometryczną (MTT, rysunek 1c), która ma zdolność do przykładania i bezpośredniego pomiaru zarówno sił, jak i momentów obrotowych do pojedynczych biomolekuł22-27.
W poniższym protokole zakładamy, że czytelnik ma do swojej dyspozycji 'konwencjonalny' instrument MT. Odsyłamy czytelnika do Dyskusji, gdzie znajdują się informacje na temat tego, jak zbudować i uruchomić konfigurację MT, a także kwestie, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze kulek magnetycznych, magnesów i procedur śledzenia. Ponadto sekcje 1 i 2 tekstu protokołu opisują, w jaki sposób zazwyczaj przygotowujemy i inkubujemy próbkę DNA do wykorzystania w MT, a także wstępne pomiary, które można wykonać na pojedynczym DNA w konwencjonalnym MT. Sekcje 3 i 4 tekstu protokołu ilustrują, w jaki sposób przyrząd MT może być łatwo zaadaptowany i wykorzystany do pomiarów FOMT i MTT.

<table><tbody><tr><td>Piaskarka</td><td>Great Lake Orthodontics</td><td>190-070 Microetcher II</td><td></td></tr><tr><td>Nitroceluloza</td><td>Life Technologies</td><td>LC2001</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny koncentrator cząstek</td><td>Life Technologies</td><td>12002D</td><td></td></tr><tr><td>Niemagnetyczne koraliki lateksowe (0,5 &mu; m promień)</td><td>Polysciences</td><td>17010</td><td></td></tr><tr><td>Niemagnetyczne koraliki lateksowe (1,5 &mu; promień m)</td><td>Sanbio</td><td>PV05N/2179</td><td></td></tr><tr><td>Antydigoksygenina</td><td>Roche</td><td>11 214 667 001</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki superparamagnetyczne pokryte streptawidyną (0,25 &mu; Promień m)</td><td>Ademtech</td><td>3150</td><td></td></tr><tr><td>Kulki superparamagnetyczne pokryte streptawidyną (0,5 &mu; m promień, " Mój")</td><td>Life Technologies</td><td>650.01</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki superparamagnetyczne pokryte streptawidyną (1,4 &mu; m promień, " M270")</td><td>Life Technologies</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki lateksowe pokryte biotyną (0,5 &mu; m promień)</td><td>Life Technologies</td><td>F-8768</td><td></td></tr><tr><td>Magnesy sześcienne do konwencjonalnej pęsety</td><td>Supermagnete</td><td>W-05-N50-G</td><td></td></tr><tr><td>Magnes cylindryczny do MTT i FOMT</td><td>Supermagnete</td><td>R-06-02-02G</td><td></td></tr><tr><td>Magnes boczny do MTT</td><td>Supermagnete</td><td>S-04-07-N</td><td></td></tr><tr><td>Stolik liniowy</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-126. </td><td></td></tr><tr><td>PD Stolik obrotowy</td><td>Physik Instrumente</td><td>C-150</td><td></td></tr><tr><td>Zautomatyzowany stolik na próbki o wysokiej rozdzielczości</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-733.2D</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do kodowania procedur analitycznych</td> Niestandardowe procedury <td>Mathworks</td><td>MATLAB</td><td>są dostępne u autorów</td></tr></tbody></table>

pęseta magnetyczna do pomiaru skrętu i momentu obrotowego

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Techniki jednocząsteczkowe umożliwiają badanie zachowania poszczególnych cząsteczek biologicznych w roztworze w czasie rzeczywistym. Techniki te obejmują tak zwane podejścia spektroskopii sił, takie jak mikroskopia sił atomowych, pęseta optyczna, rozciąganie przepływu i pęseta magnetyczna. Wśród tych podejść pęsety magnetyczne wyróżniają się zdolnością do przykładania momentu obrotowego przy zachowaniu stałej siły rozciągającej. Pokazano tutaj, w jaki sposób taka "konwencjonalna" eksperymentalna konfiguracja pęsety magnetycznej może, poprzez prostą modyfikację jej konfiguracji pola w celu zminimalizowania wielkości pola poprzecznego, zostać przystosowana do pomiaru stopnia skręcenia w cząsteczce biologicznej. Uzyskana konfiguracja jest określana jako swobodnie orbitująca pęseta magnetyczna. Dodatkowo pokazano, w jaki sposób dalsza modyfikacja konfiguracji pola może doprowadzić do powstania pola poprzecznego o wielkości pośredniej między "konwencjonalną" pęsetą magnetyczną a swobodnie poruszającą się pęsetą magnetyczną, co umożliwia bezpośredni pomiar momentu obrotowego zmagazynowanego w cząsteczce biologicznej. Ta konfiguracja jest nazywana pęsetą magnetyczną. Załączony film wyjaśnia szczegółowo jak można dokonać konwersji konwencjonalnej pęsety magnetycznej na swobodnie poruszającą się pęsetę magnetyczną i pęsetę magnetyczną o momencie obrotowym, oraz demonstruje użycie tych technik. Te adaptacje zachowują wszystkie mocne strony konwencjonalnej pęsety magnetycznej, jednocześnie znacznie zwiększając wszechstronność tego potężnego instrumentu.

Reprezentatywne wyniki z MT (Rysunek 1a) przedstawiono na Rysunku 2. Rysunek 2a pokazuje krzywe rotacja-wydłużenie dla DNA o długości 7,9 kb przy F = 0,25, 0,5 i 2,0 pN. Reakcja pojedynczego DNA na rotację powinna być symetryczna przy najniższych siłach (0,25 pN), przy czym wydłużenie DNA maleje w wyniku tworzenia się pozytywnych lub negatywnych superzwinięć plectonemicznych. Jakościowa wiedza o tej reakcji jest przydatna podczas wstępnego poszukiwania DNA przywiązanego z ograniczeniem rotacyjnym (krok 2.1). Należy zauważyć, że wymagana jest dodatkowa inspekcja wiązania, aby zweryfikować, że składa się ono z pojedynczej cząsteczki DNA: tutaj asymetryczna reakcja pojedynczego DNA na rotację przy siłach przekraczających 0,5 pN pomaga odróżnić go od wielu cząsteczek DNA (krok 2.1.1). Po dokonaniu tej weryfikacji powraca się do reakcji rotacyjnej przy 0,25 pN, aby określić dokładną liczbę obrotów magnesu, przy której pojedyncze DNA jest rozluźnione torsyjnie, wykonując krzywą siła-wydłużenie, która powinna przypominać Rysunek 2b. Dla tego konkretnego pomiaru dopasowanie danych do modelu łańcucha typu worm-like chain (linia ciągła) dało dopasowaną długość konturową LC = 2,71 µm i długość persistencji zginania LP = 45 nm. Dla dsDNA dopasowane wartości długości persistencji powinny mieścić się w zakresie 40-55 nm, w zależności od warunków buforu33, a dopasowana długość konturowa powinna być bliska (zazwyczaj w granicach 10%) wartości oczekiwanej dla konstrukcji DNA użytej w pomiarach, zgodnie z zależnością LDNA = 0,34 nm/bp · liczba par zasad.
Rysunek 3 przedstawia procedury i wyniki centrowania w FOMT (Rysunek 1b). Początkowe odchyły (x,y) zarejestrowane w kroku 3.2 można porównać z ogólnym widokiem fluktuacji w funkcji pozycji magnesu poprzecznego przedstawionym na Rysunku 3a, gdzie widoczny jest wzór „wirujący”, który może służyć do naprowadzania podczas kolejnych przesunięć względnych między magnesem a przywiązaną do DNA kuleczką w FOMT. Po zakończeniu wstępnego centrowania fluktuacje kuleczki w płaszczyźnie (x,y) kreślą tor kołowy, co obrazuje czarny ślad na Rysunku 3b. W tym momencie moment obrotowy generowany przez magnesy wokół osi z zostaje zredukowany do poziomu, w którym fluktuacje termiczne wystarczają do obrócenia kuleczki wokół punktu przyczepienia. Promień Rcircle powstałego pierścienia kołowego (dopasowany okrąg zaznaczono na czerwono) reprezentuje odległość radialną między punktem przyczepienia DNA a środkiem kuleczki (Rysunek 1b). Jak jednak pokazano na Rysunku 3c, histogram danych z Rysunku 3b wskazuje, że wstępne centrowanie nie gwarantuje jednorodnego pokrycia wszystkich możliwych pozycji wzdłuż pierścienia kołowego. Mimo że fluktuacje termiczne są wystarczające do przeszukania wszystkich kątów obrotu na okręgu, wciąż istnieje niewielka bariera energetyczna (rzędu energii termicznej kBT) utrudniająca swobodny obrót.
Po przeprowadzeniu precyzyjnego ustawienia w FOMT (krok 3.4), instrument może zostać wykorzystany do wyznaczenia modułu skrętności DNA (Rysunek 4). Najpierw stosuje się precyzyjne ustawienie próbki w celu uzyskania ruchu kołowego (Rysunek 4a), którego dwuwymiarowy histogram powinien teraz wykazywać jednorodne pokrycie (Rysunek 4b). Odpowiadający temu przebieg czasowy q(t) fluktuacji kątowych (uzyskany z konwersji pozycji (x,y), opisanej poniżej) nie wykazuje okresowości odpowiadającej 360˚ (Rysunek 4c) i ujawnia duże wychylenia odpowiadające kilku pełnym obrotom (Rysunek 4d). Wynikający z tego profil energii jest harmoniczny w zakresie &gt; 1,000˚ (Rysunek 4e). Odchylenie standardowe fluktuacji wynosi σθ = 223°, co odpowiada kątowej sztywności pułapki kθ=kBT/σθ 2= 0.27 pN·nm/rad, co z kolei pozwala oszacować efektywną długość persistencji skrętnej DNA na wartość C = LC / σθ 2 ~ 76 nm (LC = 1,150 nm dla DNA o długości 3.4 kbp użytego w tym pomiarze) przy mierzonej sile.
Przykład wykorzystania FOMT do pomiaru zmiany skręcenia wywołanej w przytwierdzonej cząsteczce DNA poprzez wiązanie białek31,34 przedstawiono na Rysunku 5. W tym przypadku monitorowano wiązanie białka RAD51 z dwuniciowym DNA; wiadomo, że RAD51 zarówno wydłuża, jak i rozplata DNA podczas tworzenia nukleoproteinowego filamentu31. Po wprowadzeniu RAD51 do celi przepływowej obserwujemy, że kuleczka porusza się po trajektorii spiralnej w FOMT (Rysunek 5a). Poprzez przeliczenie śladu ruchu (x,y) w funkcji czasu na q(t) zgodnie z powyższym opisem, możemy na jednym wykresie przedstawić wpływ RAD51 na długość przytwierdzonego DNA oraz stopień jego rozplatania (Rysunek 5b,c).
Alternatywnym podejściem do pomiaru właściwości skrętnych DNA jest MTT (Rysunek 1c, Rysunek 6). Schemat na Rysunku 6a ilustruje zasadę pomiaru: po nawięciu (lub odwinięciu) wiązania DNA o N obrotów, DNA wywiera moment przywracający na kuleczkę, co prowadzi do przesunięcia równowagowej pozycji kątowej z θ0 do θN. W MTT poprzeczna składowa pola magnetycznego jest zredukowana w porównaniu do MT, co ułatwia pomiar takich przesunięć kątowych, jednocześnie wciąż umożliwiając rotację kuleczki (Rysunek 1). Wartość przesunięcia kątowego zmierzonego po przyłożeniu N = 45 obrotów do DNA o długości 7.9 kbp przedstawiono na Rysunku 6b. Pełna sekwencja protokołu pomiarowego MTT oraz wynikowa krzywa zależności momentu obrotowego od rotacji dla DNA są pokazane na Rysunku 6c-f. Tutaj pomiary odchylenia standardowego (Rysunek 6c) oraz średniej (Rysunek 6d) współrzędnej kątowej przedstawiono jako funkcję nawięcia i odwięcia, przy czym odchylenie standardowe jest odwrotnie proporcjonalne do sztywności kątowej pułapki (Równanie 1). Wspólnie wielkości te pozwalają na wykreślenie krzywej zależności momentu obrotowego od rotacji dla DNA (Rysunek 6f), która powinna wykazywać liniowy obszar odpowiedzi wycentrowany wokół 0 obrotów oraz dwa plateau, na których moment obrotowy nasyca się odpowiednio przy rotacjach dodatnich i ujemnych. Taka krzywa zależności momentu obrotowego od rotacji uzupełnia informacje zawarte w krzywej zależności wydłużenia od rotacji (Rysunek 6e), ilościowo określając przejścia towarzyszące wyboczeniu i denaturacji DNA.
<img alt="Schemat pęsety magnetycznej ilustrujący rodzaje i strategie śledzenia kąta z markerami fiducjalnymi." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51503/51503fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematy konwencjonalnej pęsety magnetycznej (MT), pęsety magnetycznej o swobodnej rotacji (FOMT), pęsety momentu magnetycznego (MTT) oraz dwie strategie śledzenia kąta obrotu. (a) We wszystkich trzech implementacjach pęset magnetycznych kulki magnetyczne są przytwierdzone do powierzchni komory przepływowej za pomocą funkcjonalizowanych makrocząsteczek, np. przedstawionych schematycznie dwuniciowych cząsteczek DNA. Kulki referencyjne są przyczepione do powierzchni komory przepływowej i śledzone w celu korekcji dryfu. Wszystkie trzy układy MT wykorzystują magnesy do przyłożenia siły rozciągającej skierowanej w górę do kulki magnetycznej, a tym samym do wiązania DNA. W konwencjonalnej MT para magnesów wytwarza pole magnetyczne zorientowane poprzecznie do osi wiązania, co ściśle ogranicza obrót kulki wokół osi wiązania DNA. W FOMT magnes o kształcie cylindrycznym wytwarza pole magnetyczne zorientowane wzdłuż kierunku wiązania. Gdy wiązanie jest wyrównane do centrum cylindrycznego magnesu, wszelkie pozostałe pola poprzeczne są zminimalizowane, co umożliwia swobodny obrót wokół osi wiązania. W MTT do cylindrycznego magnesu stosowanego w FOMT dodaje się magnes boczny w celu zapewnienia niewielkiego pola poprzecznego (o mniejszej wartości w porównaniu do MT). To niewielkie pole poprzeczne umożliwia przyłożenie momentu obrotowego oraz jego pomiar. (b) Przedstawiono dwie strategie pomiaru kąta obrotu kulki magnetycznej wokół osi wiązania DNA. 1): kulka markerowa (zielona) przyczepiona do kulki magnetycznej (brązowa) daje asymetryczny obraz, który umożliwia śledzenie kąta poprzez analizę obrazu. Przedstawiono dwa obrazy CCD kulki magnetycznej o promieniu 1,4-μm z markerem fiducjalnym o promieniu 0,5-μm, w ostrości i poza ostrością. 2): gdy DNA jest przytwierdzone do kulki magnetycznej w pozycji oddalonej od bieguna południowego kulki, środek kulki fluktuuje wzdłuż łuku, którego centrum definiuje pozycję kątową. Każdą z tych strategii można wykorzystać do śledzenia kąta obrotu i monitorowania przesunięć pozycji kątowej podczas naprężania skrętnego wiązania (ślady po prawej stronie), co umożliwia pomiary momentu obrotowego pojedynczej cząsteczki.
<img alt="Wydłużanie DNA i analiza siły; wykres; różne siły pN w zależności od obrotów; dane z badań biofizycznych." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51503/51503fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Pomiary kalibracyjne DNA w konwencjonalnej MT. (a) Krzywe rotacja-wydłużenie dla DNA o długości 7,9 kb zarejestrowane przy F = 0,25, 0,5 i 2,0 pN. Asymetryczna odpowiedź podczas rotacji w kierunku dodatnim i ujemnym pojedynczych dwuniciowych wiązań DNA może służyć jako wygodny test przytwierdzenia wiązania. (b) Krzywa siła-wydłużenie dla DNA o długości 7,9 kb wraz z dopasowaniem do modelu łańcucha przypominającego robaka (linia ciągła), co daje dopasowaną długość konturową LC = 2,71 µm i długość persystencji zgięcia LP = 45 nm. Wszystkie pomiary przeprowadzono w buforze PBS.
<img alt="Schemat manipulacji magnesem; badanie wyrównania cząsteczek; kierunki ruchu, analiza wliczona." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51503/51503fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wyrównanie w FOMT. (a) Fluktuacje (x,y) koralika przymocowanego do DNA, utrzymywanego w FOMT, w funkcji pozycji magnesu. Pozycję magnesu cylindrycznego skanowano na stałej wysokości 3 mm nad powierzchnią komory przepływowej w krokach 250 μm w osiach x i y, co zaznaczono na zewnętrznych osiach wykresu. Dla każdej pozycji (x,y) magnesu rejestrowano fluktuacje tego samego koralika przymocowanego do DNA i naniesiono je na małe układy współrzędnych (pasek skali w prawym dolnym rogu odnosi się do wszystkich podukładów współrzędnych). Widoczne są systematyczne zmiany wzorca fluktuacji (x,y) koralika w zależności od pozycji magnesu, przypominające cyklon lub wir. Ten wzorzec „wiru” może być wykorzystany do kierowania przesunięciem magnesu (lub alternatywnie wiązania, przy zachowaniu stałej pozycji magnesu) w osiach x i y (wskazane dużymi strzałkami) w celu uzyskania wyrównania. Po zakończeniu wstępnego wyrównania fluktuacje (x,y) koralika kreślą okrągłą trajektorię (niebieska linia w centrum wykresu). Ślad ten został zarejestrowany w oddzielnym eksperymencie po wyrównaniu magnesów w mniejszych krokach wokół centrum i został przedstawiony na tym wykresie w celach ilustracyjnych. (b) Fluktuacje (x,y) koralika przymocowanego do DNA, utrzymywanego w FOMT, po pomyślnym wstępnym wyrównaniu magnesu (czarna linia). Fluktuacje układają się w pierścień okrągły, a fluktuacje termiczne są wystarczające do zbadania wszystkich kątów obrotu na okręgu. Dopasowany okrąg przedstawiono na czerwono. (c) Histogram odpowiadający danym w (b), pokazujący, że wstępne wyrównanie nie gwarantuje równomiernego pokrycia wszystkich możliwych pozycji wzdłuż pierścienia okrągłego. Mimo że fluktuacje termiczne są wystarczające do zbadania wszystkich kątów obrotu na okręgu, nadal istnieje bariera energetyczna (rzędu energii termicznej kBT) dla swobodnego obrotu.
<img alt="Analiza równowagi statycznej; schematy przedstawiające ruch cząstki, przemieszczenie kątowe i profile energii." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51503/51503fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Pomiar sztywności skrętnej DNA przy użyciu FOMT. Trajektoria (x,y) (a) oraz histogram (b) fluktuacji koralika przytwierdzonego do DNA po precyzyjnym ustawieniu względnej pozycji magnesu i wiązania w FOMT. W tych warunkach histogram wykazuje w zasadzie równomierne pokrycie pozycji na okręgu. (c) Fluktuacje obrotowe koralika wyznaczone z pozycji (x,y). (d) Histogram fluktuacji obrotowych. Czerwona linia to dopasowanie Gaussa z σθ = 223°. (e) Profil energetyczny wynikający z gęstości fluktuacji obrotowych z (c) i (d). Różnica między profilem energetycznym wynikającym z fluktuacji obrotowych a przybliżeniem harmonicznym (przy kθ = kBT / σθ2 = 0.27 pN-nm/rad) jest znacznie mniejsza niż energia termiczna kBT w obrębie kilku obrotów. Dane zostały przesunięte dla przejrzystości tak, aby θ0 = 0. Szerokość fluktuacji może być wykorzystana do wyznaczenia sztywności skrętnej DNA, patrz tekst główny. Pomiar został przeprowadzony w buforze PBS przy sile rozciągania ~1 pN. Dane zostały zaadaptowane z Lipfert et al21.
<img alt="Schemat ruchu pęsety optycznej; wykresy przedstawiają wydłużenie i kąt w funkcji czasu w skali mikrometrycznej." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51503/51503fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Wiązanie białka RAD51 z DNA mierzone za pomocą FOMT. (a) Montaż białka RAD51 na przytwierdzonej cząsteczce dsDNA o długości 7,9 kbp monitorowany przy sile 3,5 pN. Przedstawiono trajektorię (x,y,z) wykonaną przez koralik magnetyczny (średnica 1,0 mm) podczas pierwszych 200 s montażu, gdzie czas jest zakodowany kolorami od niebieskiego do czerwonego. (b) Wydłużenie dsDNA wywnioskowane z komponentu z trajektorii koralika z (a) jako funkcja czasu. (c) Kąt obrotu wokół osi przytwierdzenia dsDNA wywnioskowany z komponentów x,y trajektorii koralika z (a) jako funkcja czasu.
<img alt="Naprężenie torsyjne DNA; schematy, wykresy; analiza rotacji, moment obrotowy, zmienność kąta, układ mikroskopowy." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51503/51503fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Pomiary momentu obrotowego pojedynczej nici DNA w MTT. (a) Schemat przedstawiający zasadę pomiaru momentu obrotowego. Po nad- (lub niedo-) skręceniu nici DNA o N obrotów, DNA wywiera przywracający moment obrotowy na kuleczkę, co prowadzi do przesunięcia równoważnej pozycji kątowej z θ0 do θN. (b) Przykład przebiegów kątowych użytych do pomiaru momentu obrotowego: fluktuacje kątowe kuleczki przytwierdzonej do torsyjnie zrelaksowanej cząsteczki DNA o długości 7,9 kbp przed (niebieski) i po wprowadzeniu 40 obrotów (ciemnoczerwony). (c-f) Pomiar momentu obrotowego cząsteczki DNA 7,9 kbp w buforze PBS przy sile rozciągającej ok. 3 pN z zastosowaniem protokołu śledzenia kątowego opartego na kuleczce z markerem referencyjnym. Fluktuacje kątowe pokazane w (b) rejestrowano jako funkcję liczby przyłożonych obrotów. (c) Odchylenie standardowe fluktuacji kątowych jako funkcja przyłożonych obrotów. Szerokość fluktuacji jest w przybliżeniu stała, co wskazuje na stałą sztywność kątową pułapki. (d) Przesunięcie średniego kąta rotacji jako funkcja przyłożonych obrotów. Widoczne są systematyczne przesunięcia średniego kąta przy nad- i niedoskręcaniu. (e) Jednocześnie monitorowana elongacja nici DNA jako funkcja przyłożonych obrotów. (f) Moment obrotowy wywierany przez nić DNA wyznaczony ze średniego kąta pokazanego w (d), patrz tekst główny. Nad- i niedoskręcanie wokół zera obrotów prowadzi do liniowej odpowiedzi momentu obrotowego w funkcji obrotów nici DNA (szare dopasowane zbocza w (d) i (f)), co może być wykorzystane do wyznaczenia efektywnej długości persystencji torsyjnej (~77 nm dla tego zestawu danych). Dalsze nadskręcanie prowadzi do wyboczenia i tworzenia plectonemicznych superhelis (pokazane schematycznie na wstawkach), co odpowiada plateau momentu obrotowego (czarna linia przy dodatnich obrotach w (f) przy ok. 26 pN·nm) i liniowemu spadkowi elongacji nici wraz z liczbą obrotów (czarne zbocze w (e)). Odskręcanie poza reżim liniowy powoduje lokalne topnienie DNA (pokazane na wstawkach po lewej), zaznaczone plateau momentu obrotowego równym momentowi topnienia (czarna linia przy ujemnych obrotach w (f) przy ok. -11 pN·nm).

Pęseta magnetyczna, potężna technika manipulacji pojedynczymi cząsteczkami, może być dostosowana do bezpośrednich pomiarów skrętu (przy użyciu konfiguracji zwanej pęsetą magnetyczną swobodnie orbitującą) i momentu obrotowego (przy użyciu konfiguracji określanej jako pęseta magnetyczna) w makrocząsteczkach biologicznych. Podano wytyczne dotyczące wykonywania takich pomiarów, w tym zastosowania do badania DNA i związanych z nim włókien nukleotywo-białkowych.

Pęseta magnetyczna do pomiaru skrętu i momentu obrotowego

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest bezpośredni pomiar naprężeń skrętnych lub zmian w skręcie dwuniciowych cząsteczek DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Jest to realizowane za pomocą dwóch analiz; w pierwszej z nich, zwanej swobodnie obracającymi się pęsetami magnetycznymi (ang. freely orbiting magnetic tweezers lub thumped), pojedyncza funkcjonalizowana cząsteczka DNA jest przytwierdzona pomiędzy koralikiem magnetycznym a szklaną powierzchnią.Podczas gdy magnes o kształcie cylindrycznym wywiera siłę rozciągającą DNA w tej konfiguracji, pozycja kątowa kuleczki jest ograniczona jedynie przez przywiązane DNA, a nie przez magnes, co pozwala na rotację kuleczki, pokazaną przez czerwoną strzałkę, w celu raportowania zmian w skręceniu DNA. Rotacyjne fluktuacje termiczne kuleczki powodują, że jej pozycja XY znajduje się na pierścieniu kołowym lub kształcie pączka. Przeliczenie tej pozycji XY na kąt obrotu umożliwia monitorowanie zmian w skręceniu przywiązanego DNA w drugim powiązanym teście zwanym magnetyczną pęsetą skrętną (MTTA), w którym do głównego magnesu cylindrycznego dodaje się magnes boczny w celu ograniczenia ruchu kątowego kuleczki.Dzięki tej konfiguracji magnesów, zewnętrzne momenty obrotowe mogą być przykładane do przytwierdzonej cząsteczki DNA poprzez prosty obrót zespołu magnesów. Pomiary odchylenia pozycji kątowej kulek po wykonaniu określonej liczby obrotów w porównaniu do ich początkowej konfiguracji zrelaksowanej torsyjnie, wraz z kalibracją sztywności pułapki magnetycznej ograniczającej ruch kątowy kulek, umożliwiają ilościowe określenie narastania momentu obrotowego w DNA. Główną zaletą stosowania font i MTT w porównaniu do konwencjonalnych pęset magnetycznych jest możliwość bezpośredniego pomiaru momentu obrotowego oraz zmian w skręceniu kwasów nukleinowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące mechaniki DNA i RNA, pozwalając nam na zmapowanie ich reakcji na zewnętrzne siły i momenty obrotowe.Zastosowania tej techniki obejmują badanie oddziaływań DNA z białkami. Przykładem mogą być białka odpowiedzialne za naprawę DNA, jego magazynowanie lub transkrypcję. Wizualna demonstracja tej metody ilustruje, jak łatwo można zmodyfikować konwencjonalny układ pęsety magnetycznej, aby nadać mu nowe możliwości. Układ wykorzystany w poniższych eksperymentach opiera się na standardowej konfiguracji pęsety magnetycznej.W jego centrum znajduje się komora przepływowa, oświetlana od góry przez diodę LED i obrazowana od dołu za pomocą obiektywu mikroskopowego i kamery CCD. Nad komorą przepływową znajduje się głowica magnetyczna, którą można przesuwać w górę i w dół oraz obracać za pomocą sterowanych komputerowo silników. Obrazy z kamery CCD są analizowane w czasie rzeczywistym przez specjalistyczne oprogramowanie LabVIEW w celu określenia pozycji X, Y i Z koralików z przywiązanym DNA.Niestandardowe oprogramowanie do wizualizacji laboratoryjnej jest dostępne u autorów na zapytanie. Po przygotowaniu komory przepływowej z koralikami magnetycznymi z przytwierdzonym DNA, zamocowaniu jej w konwencjonalnych pęsetach magnetycznych oraz wybraniu zarówno koralika referencyjnego unieruchomionego na powierzchni, jak i koralika, do którego przytwierdzona jest pojedyncza cząsteczka DNA o odpowiedniej długości, układ można przełączyć w tryb font.Zacznij od ręcznego odkręcenia całej głowicy magnetycznej, która utrzymuje magnes dla konwencjonalnej konfiguracji pęsety. Zastąp ją głowicą magnetyczną z magnesem cylindrycznym przeznaczonym do funkcji font. Podczas umieszczania magnesu cylindrycznego używanego do F w głowicy magnetycznej, upewnij się, że wybrany fragment DNA (tether) pozostaje w polu widzenia.Najtrudniejszym elementem tej procedury jest prawidłowe ustawienie magnesów względem geometrii formy. Odpowiednie wyrównanie osiąga się poprzez systematyczne przesuwanie magnesów i sprawdzanie ich położenia po każdym kroku, co zostanie przez nas zaprezentowane. Teraz należy wykonać wstępne wyrównanie magnesu w formie, korzystając z elementów pozycjonujących do ręcznego przesuwania magnesów w oprogramowaniu LabVIEW.Kliknij przycisk rejestracji, aby zmierzyć fluktuacje lub odchylenia pozycji XY. Nagrane ślady są wyświetlane na ekranie w czasie rzeczywistym i zapisywane jako pliki tekstowe zawierające informacje o pozycji X, Y, Z. Jeśli odchylenia XY tworzą łuk, jak pokazano tutaj, oznacza to, że magnes cylindryczny nie jest odpowiednio wyrównany; należy kontynuować przesuwanie magnesa cylindrycznego w odpowiednim kierunku i wykonywać pomiary do momentu, aż fluktuacje XY utworzą pełny wzór kołowy, co wskazuje na uzyskanie właściwego wyrównania. Dalej.Jeśli jest to wymagane do dalszych eksperymentów, przeprowadź precyzyjne wyrównanie w czcionce, wykorzystując zautomatyzowany stolik o wysokiej rozdzielczości do przesuwania celi przepływowej, aby ustawić cylindryczny magnes w odległości około 10 micronów od kuleczki. Następnie, tak jak wcześniej, zarejestruj odchylenia w osiach XY. Kontynuuj przesuwanie stolika i rejestrowanie odchyleń do momentu, gdy fluktuacje na pierścieniu kołowym staną się niemal jednolite.Aby zweryfikować końcowe wyrównanie, należy użyć skryptu MATLAB, dostępnego u autorów na żądanie, w celu wykreślenia fluktuacji na histogramie lub termogramie i sprawdzenia ich jednorodności. Aby zmierzyć moment obrotowy DNA, należy usunąć magnes cylindryczny używany do ustawienia początkowego i zastąpić go magnesem cylindrycznym oraz stałym magnesem bocznym. W przypadku MTT należy upewnić się, że wybrana wiązka DNA pozostaje w polu widzenia.Wprowadź liczbę i częstotliwość obrotów magnesów w odpowiednim panelu sterującego oprogramowania LabVIEW. Tutaj liczba obrotów została ustawiona na pięć, a częstotliwość na 0,1 hertz. Spowoduje to powolny obrót magnesów podczas pomiaru.Następnie w programie matlab należy użyć skryptu do śledzenia kątowego opartego na monitorowaniu pozycji XY, który jest dostępny u autora na żądanie. Pojawi się wykres przedstawiający fluktuacje kątowe w funkcji czasu, theta T. Po skonfigurowaniu wszystkich ustawień w programie lab view, należy kliknąć przycisk nagrywania.Ślady będą pojawiać się w czasie rzeczywistym, tak jak poprzednio. W programie matlab należy użyć skryptu MATLAB, aby wyświetlić na ekranie wykresy kąta theta T oraz wysokości kuleczki Z śladu T wraz z dopasowaniem Gaussa do sygnału kątowego w celu wyznaczenia odchylenia standardowego fluktuacji kątowych. Sigma theta.Ten skrypt bezpośrednio wyznacza sztywność pułapki torsyjnej na podstawie wariancji fluktuacji kątowych. Sigma theta kwadrat w radianach. Korzystając z przedstawionego tutaj wzoru, należy zauważyć, że w MTT typowo osiąga się sztywność pułapki rotacyjnej od 10 do 1000 pN·nm na radian, co jest wartością znacznie niższą niż w przypadku konwencjonalnych pęset magnetycznych.Tutaj, na przykład, określiliśmy sztywność pułapki rotacyjnej na około 52 pN·nm na radian. Sztywność pułapki rotacyjnej w magnetycznych pęsetach momentowych (MTT) w porównaniu do konwencjonalnych pęset magnetycznych sprawia, że nadają się one do pomiarów momentu obrotowego pojedynczych cząsteczek, ale oznacza to również, że maksymalny moment obrotowy, jaki można wywrzeć, jest zredukowany. Implikuje to, że MTT nie może zrównoważyć momentów oporu wywołanych szybką rotacją.Należy zatem uważać, aby nie obracać zbyt szybko. Zazwyczaj stosujemy prędkość obrotową wynoszącą około 0.1 hertz. Następnie, poprzez powolne obracanie magnesów o określoną liczbę obrotów, doprowadza się do nadmiernego rozciągnięcia wiązania DNA; po zarejestrowaniu kolejnego przebiegu fluktuacji kątowych, liczba i prędkość obrotów magnesów zostają ponownie wprowadzone do odpowiedniego panelu w sterującym oprogramowaniu LabVIEW.W tym przypadku liczba obrotów jest ustawiona na 40, a częstotliwość na 0,1 hertz. Spowoduje to powolną rotację magnesów podczas pomiaru w celu określenia momentu obrotowego nagromadzonego w uwięzi kwasu nukleinowego. Po N obrotach stosujemy przedstawiony tutaj wzór, w którym nawiasy kątowe oznaczają średnią, a theta zero.Zmienna theta N reprezentuje kąt przy zerowej liczbie obrotów, odpowiadający wiązaniu rozluźnionemu skrętnie, oraz liczbę obrotów. Powtórz etapy obracania magnesów i zarejestruj plateau fluktuacji kątowych w razie potrzeby, aby w pełni określić odpowiedź momentu obrotowego cząsteczki w jednym cyklu pomiarowym. Celem jest zmierzenie zmian w skręcie DNA wywołanych przez białko naprawcze RAD 51, którego wiązanie z dwuniciowym DNA powoduje zarówno jego wydłużenie, jak i rozplecenie.DNA rad 51 dodano do cząsteczki DNA przymocowanej z przodu. Jak widać, kuleczka porusza się po trajektorii spiralnej. Ruch ten można rozłożyć na składowe opisujące, w jaki sposób DNA wydłuża się i rozplata w czasie.Aby zmierzyć moment obrotowy zmagazynowany w DNA przy użyciu MTT, zmierzono cząsteczkę poddaną systematycznemu nadowijaniu i niedowijaniu oraz fluktuacje kątowe dla każdej liczby przyłożonych obrotów. Odchylenie standardowe fluktuacji kątowych, które informuje o sztywności pułapki kątowej, powinno być niezależne od liczby przyłożonych obrotów. W tym przypadku odchylenie standardowe wynosi około dziewięciu stopni, co pokazano tutaj.Średnia wartości pozycji kątowych zmienia się systematycznie wraz z liczbą wykonanych obrotów przy stałej sztywności kątowej pułapki. Zmiany średniego kąta są przeliczane na moment obrotowy, co pozwala wyznaczyć moment obrotowy zmagazynowany w DNA w zależności od liczby wykonanych obrotów. Jednoczesna rejestracja pozycji Z koralików pozwala wyznaczyć długość DNA w zależności od liczby wykonanych obrotów.Te dwie krzywe łącznie obrazują pełną odpowiedź mechaniczną DNA na nadkręcanie i rozkręcanie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre zrozumienie sposobu pomiaru skręcenia i momentu obrotowego w cząsteczkach biologicznych przy użyciu swobodnie orbitujących pęset magnetycznych oraz pęset z magnetycznym momentem obrotowym, a także nowych testów z pojedynczymi cząsteczkami, do których można łatwo dostosować konwencjonalne pęsety magnetyczne. Rozwój tych technik toruje drogę do badań w dziedzinie biofizyki, na przykład do badania właściwości torsyjnych DNA lub RNA oraz obserwacji procesów takich jak kondensacja i naprawa DNA. Techniki pęset magnetycznych i MTT można usprawnić za pomocą innych metod, takich jak detekcja fluorescencyjna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. określić dokładną lokalizację białka na przywiązanym DNA.

magnetic-tweezers-for-the-measurement-of-twist-and-torque

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Magnetyczne pinceta do pomiaru skrętu i momentu obrotowego

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób wysoce równoległy.

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

Opracowaliśmy urządzenie (Twister) do badania regulacji tonicznej aktywności mięśniowej podczas aktywnego utrzymywania postawy. Twister mierzy opór skrętny i odpowiedzi mięśniowe u osób stojących podczas skręcania osi ciała. Urządzenie można elastycznie konfigurować w celu badania różnych aspektów kontroli tonicznej w obrębie szyi, tułowia i/lub bioder.

Metoda pomiaru napięcia mięśni osiowych i proksymalnych

Zgłoszono platformę jednocząsteczkowych pęsety magnetycznej do manipulowania G-quadruplexami, która pozwala na badanie stabilności i regulacji G4 przez różne białka.

Manipulacja pojedynczymi cząsteczkami G-kwadrupleksów za pomocą pęsety magnetycznej

Tutaj opisujemy szybki zestaw pęsety magnetycznej, który wykonuje nanomechaniczne pomiary na wrażliwych na siłę biomolekułach z maksymalną szybkością 1,2 kHz. Wprowadzamy jego zastosowanie do spinek do włosów DNA i kompleksów SNARE jako układów modelowych, ale będzie on miał również zastosowanie do innych cząsteczek biorących udział w zdarzeniach mechanobiologicznych.

Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

Ten protokół demonstruje użycie pęsety magnetycznej do badania interakcji między telomerowymi białkami wiążącymi DNA (Telomer Repeat-binding Factor 1 [TRF1] i TRF2) a długimi telomerami ekstrahowanymi z komórek ludzkich. Opisano w nim etapy przygotowawcze do telomerów i telomerowych czynników wiążących powtórzenia, wykonywanie eksperymentów na pojedynczych cząsteczkach oraz metody gromadzenia i analizy danych.

Analiza telomerowych oddziaływań białko-DNA za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej

Fluorescencyjne nanocząsteczki wytwarzane w naszym laboratorium są wykorzystywane do obrazowania stężeń jonów i strumieni jonowych w systemach biologicznych, takich jak komórki podczas sygnalizacji oraz płyn śródmiąższowy podczas homeostazy fizjologicznej.

Nanocząstki fluorescencyjne do pomiaru stężenia jonów w systemach biologicznych

Ilustrujemy zastosowanie osiowych pęset optycznych o stałej sile do badania właściwości mechanicznych krótkich cząsteczek DNA. Poprzez rozciąganie DNA wzdłuż osi minimalizujemy zawady steryczne oraz artefakty występujące w konwencjonalnej manipulacji bocznej, co pozwala nam badać cząsteczki DNA o długości nawet ~100 nm.

Rozciąganie krótkich sekwencji DNA za pomocą osiowych pęset optycznych o stałej sile

Procedura demonstruje metodologię elastografii rezonansu magnetycznego w celu monitorowania wyników inżynierii tkankowej konstruktów adypogennych i osteogennych poprzez nieinwazyjną lokalną ocenę właściwości mechanicznych z wykorzystaniem mikroskopowej elastografii rezonansu magnetycznego (μMRE).

Metodologia elastografii rezonansu magnetycznego w ocenie wzrostu konstruktów inżynierii tkankowej

Pęsety optyczne były używane do badania fałdowania RNA poprzez rozciąganie pojedynczych cząsteczek od ich końców 5' i 3'. Tutaj opisano typowe procedury syntezy cząsteczek RNA do pęsety, kalibracji instrumentu i metod manipulowania pojedynczymi cząsteczkami.

Nanomanipulacja pojedynczymi cząsteczkami RNA za pomocą pęsety optycznej

Ten artykuł omawia procedury przygotowania próbek i czujników oraz protokoły korzystania z platformy testowej, szczególnie do dynamicznego obrazowania domeny z pomiarami BH in situ w celu osiągnięcia optymalnej jakości wzorca domeny i dokładnych pomiarów BH.

Zoptymalizowana konfiguracja i protokół obrazowania w domenie magnetycznej z pomiarem histerezy in situ

Poznaj techniki pęset magnetycznych do pomiaru skrętu i momentu obrotowego DNA na poziomie pojedynczych cząsteczek. Metoda ta umożliwia badanie mechaniki DNA i interakcji z białkami w biologii molekularnej.

Pęseta magnetyczna do pomiaru skrętu i momentu obrotowego

Przeglądaj więcej filmów