In ovo elektroporacja zarodków kurzych

Elektroporacja jest techniką stosowaną do wprowadzania obcego materiału genetycznego do komórek. Elektroporacja embrionów kurzych wewnątrz jaja, czyli elektroporacja in ovo, stanowi cenne narzędzie dla biologów rozwoju, ponieważ dostarczenie materiału genetycznego może być zlokalizowane w konkretnych tkankach i w określonych punktach czasowych rozwoju. Ten film przedstawi podstawowe zasady elektroporacji in ovo, opisze kluczowe etapy procedury oraz omówi sposób wykorzystania tej techniki do badania procesów biologicznych podczas rozwoju.

Na początek przyjrzyjmy się podstawowym zasadom elektroporacji, aby zrozumieć, w jaki sposób można ją wykorzystać do wprowadzenia DNA do komórki.

Najpierw za pomocą mikroiniekcji dostarcza się DNA w bezpośrednie sąsiedztwo wybranej komórki. Jednak DNA nie może przeniknąć przez błonę plazmatyczną, aby dostać się do wnętrza komórki.

Aby rozwiązać ten problem, przykłada się prąd elektryczny, który zaburza stabilność błony, tworząc pory. Drugim skutkiem działania tego pola elektrycznego jest migracja ujemnie naładowanego DNA w kierunku elektrody dodatniej. W rezultacie tylko komórki znajdujące się po stronie miejsca iniekcji bliższej elektrodzie dodatniej zostają przetransfekowane DNA.

Po zapoznaniu się z podstawowymi zasadami, omówmy sposób przygotowania embrionów do elektroporacji. Jeśli konieczne jest użycie embrionów starszych niż stadium 20 według skali Hamburgera-Hamiltona, najlepiej hodować kurczęta poza skorupą, czyli ex ovo, aby uzyskać lepszy dostęp do tkanek. Niniejszy film koncentruje się na elektroporacjach przeprowadzanych na wczesnych embrionach rozwijających się wewnątrz skorupy, czyli in ovo.

Na początek jaja należy inkubować w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C, aż osiągną pożądany stopień rozwoju. Podczas inkubacji jaj przygotuj narzędzia do iniekcji i elektroporacji. Najpierw wykonaj igły kapilarne, wyciągając pipetę szklaną o średnicy 0,5 mm za pomocą wyciągarki do pipet. Aby otworzyć pipetę, umieść ją pod mikroskopem i odłam niewielki fragment końcówki. Następnie przygotuj roztwór do iniekcji, który powinien zawierać odpowiednie rozcieńczenie konstruktu oraz barwnik ułatwiający wizualizację wstrzykniętego roztworu.

Aby kontrolować przepływ cieczy wewnątrz igły, podłącz ją do pipety ustnej. Alternatywnie igłę można zamontować w mikroinjektorze, który generuje regulowane impulsy powietrza pod ciśnieniem. Napełnij igłę, zanurzając jej końcówkę w roztworze do iniekcji i przykładając podciśnienie.

Oprócz igieł będą potrzebne elektrody. Składają się one z dwóch odsłoniętych przewodów połączonych za pomocą adaptera. Para kabli łączy elektrody z generatorem impulsów elektrycznych, czyli elektroporatorem, który kontroluje czas trwania, częstotliwość i napięcie impulsu. W celu obsługi bez użycia rąk elektroporator może być aktywowany za pomocą pedału.

Gdy jaja będą gotowe, wytnij okienko w skorupie i dodaj kilka kropli fizjologicznego roztworu soli, takiego jak roztwór Hanksa, aby zapobiec wysuszeniu embrionu. Pod mikroskopem ustaw jajo tak, aby badana tkanka była dostępna dla igły. Następnie przebij embrion igłą kapilarną i podaj roztwór, przykładając delikatny nacisk.

Po wstrzyknięciu konstruktu należy przeprowadzić elektroporację. Ustaw elektrody tak, aby były zanurzone w roztworze Hank’a, a badana tkanka znajdowała się centralnie pomiędzy nimi. Aby przyłożyć prąd elektryczny, naciśnij pedał i obserwuj powstawanie pęcherzyków powietrza wokół elektrod.

Po zakończeniu elektroporacji wyjmij elektrody z zarodka i przemyj je 70% etanolem. Dodaj kilka kropli roztworu soli z dodatkiem antybiotyków, aby zapobiec infekcji, a następnie zabezpiecz okienko taśmą. Na koniec umieść jaja z powrotem w inkubatorze w celu kontynuacji rozwoju przed analizą fenotypową.

Po zapoznaniu się z zasadami elektroporacji in ovo, przyjrzyjmy się przykładom zastosowania tej techniki w badaniach nad rozwojem.

Na początek, elektroporację można wykorzystać do blokowania ekspresji genów poprzez dostarczenie konstruktów wyciszających (knockdown). W tym przykładzie komórki rozwijającej się cewy nerwowej poddano elektroporacji konstruktami wyciszającymi geny. Pozwolono embrionom na dalszy rozwój, a następnie porównano przebieg aksonów w próbkach prawidłowych i z wyciszonymi genami, aby ocenić genetyczną kontrolę prowadzenia aksonów.

Z drugiej strony, elektroporacja in ovo może służyć do ekspresji białka w podzbiorze komórek poprzez wprowadzenie plazmidu zawierającego gen kodujący białko oraz promotor: sekwencję, z którą wiąże się polimeraza RNA w celu inicjacji transkrypcji. W tym przypadku naukowcy wprowadzili pojedynczy gen do komórek zarodkowego mózgu. Barwienie tkanek w celu wykrycia zarówno produktu białkowego tego genu, jak i markerów specyficznych podtypów neuronów pokazuje, że wprowadzony gen zmienia rozwój układu nerwowego.

Poprzez elektroporację można również wprowadzić konstrukty DNA kodujące białka fluorescencyjne, aby wizualizować komórki i struktury podczas rozwoju. Umożliwia to obrazowanie na żywo złożonych procesów, takich jak rozwój rdzenia kręgowego, co pozwala zrozumieć dynamikę ruchów komórek w czasie.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do elektroporacji in ovo, użytecznej techniki wprowadzania materiału genetycznego do zarodków kurcząt. W tym filmie omówiono podstawowe zasady elektroporacji, kroki niezbędne do iniekcji i elektroporacji kurcząt oraz zastosowania tej techniki w aktualnych badaniach nad rozwojem. Dziękujemy za oglądanie!