Kultura zarodka kurczaka ex ovo

Kurczę jest wszechstronnym organizmem modelowym do badania ścieżek rozwojowych, ponieważ większość jego rozwoju odbywa się poza organizmem matki. Niemniej jednak skorupka jaja uniemożliwia dostęp do zarodka w niektórych rodzajach eksperymentów. Na szczęście kurczęta można inkubować poza skorupką, czyli „ex ovo”, wykorzystując powszechnie dostępne materiały laboratoryjne. W tym filmie dowiedzą się Państwo o zasadach hodowli ex ovo, procedurach krok po kroku dla dwóch różnych metod hodowli oraz zastosowaniach tej techniki w badaniach rozwojowych.

Zanim omówimy sposób hodowli piskląt ex ovo, przyjrzyjmy się zasadom tej techniki. Wewnątrz jaja pisklę rozwija się w ścisłym powiązaniu z błoną witelinową otaczającą żółtko. Pozostała objętość wypełniona jest albuminą, czyli białkiem jaja, która chroni embrion i służy jako źródło białka.

Hodowla poza skorupą może być prowadzona jako hodowla całego żółtka, wykorzystująca całą zawartość jaja w prostym pojemniku. Alternatywnie, tkanki embrionalne mogą zostać wycięte i hodowane w kulturze eksplantów ex ovo. Obie te techniki mają wyraźne zalety w stosunku do stosowania jaj z wyciętym okienkiem.

Po pierwsze, tworzenie okienka w embrionach kurzych na późniejszych etapach rozwoju jest skomplikowane ze względu na obecność wielu kluczowych naczyń krwionośnych, które rozwijają się w błonach otaczających pisklę. To sprawia, że metoda ex ovo jest preferowana w pracy z pisklętami na późniejszych etapach.

Po drugie, układy do hodowli ex ovo są łatwiejsze do zastosowania w obrazowaniu o wysokiej rozdzielczości, ponieważ mogą być umieszczone w zestawach do obrazowania.

Ponadto usunięcie embrionów ze skorupy odsłania większą liczbę tkanek, co umożliwia manipulacje eksperymentalne, takie jak mikrochirurgia i mikroiniekcje.

Ponieważ pisklę polega na skorupie jaja w kwestii ochrony i niezbędnych minerałów, przeżycie embrionu bez tej struktury wymaga dodatkowej uwagi. Na przykład inkubator musi być zaprojektowany tak, aby utrzymać sterylne i wilgotne środowisko, a składniki odżywcze muszą być dostarczane w postaci albuminy lub pożywki hodowlanej. Do długoterminowej hodowli wymagana jest również zmielona skorupa jako źródło wapnia. Co więcej, ponieważ napięcie błon podtrzymujących embrion jest istotne dla prawidłowego rozwoju, sukces hodowli ex ovo zależy dodatkowo od zastosowania pojemników, które utrzymują prawidłową morfologię błon.

Po zapoznaniu się z podstawami czas przejść do praktyki z zarodkami kurczęt! Aby przygotować jaja do hodowli całego żółtka ex ovo, należy rozpocząć od ich inkubacji w temperaturze 37,5 °C aż do momentu tuż przed osiągnięciem pożądanego stadium.

W oczekiwaniu na ten moment należy przygotować naczynia hodowlane. Do przechowywania zawartości jaja powszechnie stosuje się szalki Petriego, łódki wagowe lub specjalne „hamaki”. Najpierw należy wysterylizować wszystkie elementy, naświetlając je promieniami UV lub odkażając etanolem.

Dodatkowo należy przygotować zewnętrzną komorę wypełnioną sterylną wodą, aby utrzymać odpowiednią wilgotność podczas inkubacji.

Gdy jaja będą gotowe, należy ułożyć je w pozycji poziomej na kilka minut, aby zarodek wypłynął na powierzchnię. Następnie należy rozbić dno skorupy i ostrożnie przenieść zawartość jaja do naczynia hodowlanego. Na koniec należy przykryć naczynie, aby utrzymać wilgotność, i umieścić cały zestaw w inkubatorze aż do osiągnięcia wieku wymaganego do dalszych etapów procesu.

Alternatywna strategia ex ovo, czyli hodowla eksplantatów, wymaga kilku dodatkowych kroków po usunięciu zarodka ze skorupki.

W tej technice błona żółtkowa jest delikatnie oddzielana od żółtka, co powoduje jednoczesne wyniesienie rozwijającego się zarodka.

Następnie błonę mocuje się w celu utrzymania napięcia, co można osiągnąć poprzez naciągnięcie tkanki wokół szklanego pierścienia lub poprzez proste przyklejenie do papieru filtracyjnego.

Po zamocowaniu dodaje się pożywkę hodowlaną, aby zakryć tkankę, a następnie zarodek umieszcza się w komorze nawilżanej.

Eksplantowane zarodki można teraz przenieść do inkubatora na okres do 24 godzin dalszego rozwoju.

Po zapoznaniu się z zasadami i metodami hodowli ex ovo, jesteśmy gotowi do przejścia do części praktycznej.

Hodowla ex ovo jest szczególnie użyteczna, gdy zachodzi potrzeba zmiany ekspresji genów w starszych embrionach. Jednym z podejść do tego celu jest elektroporacja, w której prąd elektryczny jest wykorzystywany do zwiększenia przepuszczalności błon komórkowych w celu wprowadzenia materiału genetycznego. Ponieważ embriony hodowane metodą ex ovo są bardzo łatwo dostępne dla technik obrazowania, pobranie materiału genetycznego można łatwo zweryfikować za pomocą obrazowania fluorescencyjnego całych embrionów.

Obrazowanie dynamiki komórek w czasie rzeczywistym jest również możliwe dzięki hodowli ex ovo. Ludzkie komórki nowotworowe mogą tworzyć guzy poprzez przejmowanie naczyń krwionośnych błony chorioallantoicznej kurczaka, znanej jako CAM. Po powstaniu guza cząsteczki fluorescencyjne można wstrzyknąć bezpośrednio do krwiobiegu i śledzić w czasie rzeczywistym. Nagromadzenie cząsteczek w tkance nowotworowej może służyć jako wskaźnik angiogenezy, czyli procesu tworzenia nowych naczyń krwionośnych.

Choć całe embriony można hodować przy użyciu technik eksplantacyjnych, niektóre eksperymenty wymagają wypreparowania tkanek embrionalnych przed rozpoczęciem hodowli. Na przykład rozwijającą się tkankę nerwową można wyciąć i hodować na szkiełkach nakrywkowych. Po okresie inkubacji można zaobserwować migrację specyficznej populacji komórek, znanych jako grzebień neuronalny, z dala od tkanki. Następnie można zastosować działanie czynników eksperymentalnych oraz obrazowanie timelapse, aby przetestować czynniki kontrolujące migrację komórek.

Właśnie obejrzeli Państwo przewodnik JoVE po hodowli zarodków kurzych ex ovo. W tym filmie omówiono zasady hodowli ex ovo, podstawy metod z wykorzystaniem całego żółtka oraz eksplantów, a także niektóre sposoby zastosowania tych technik w dzisiejszych laboratoriach. Dziękujemy za oglądanie!