Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Ogólnym celem tej procedury jest sekwencjonowanie 16 S-R-R-N-A. Geny amplifikowane z próbek środowiskowych za pomocą stacjonarnej maszyny do sekwencjonowania. Osiąga się to poprzez amplifikację genu 16 S-R-R-N-A za pomocą zmodyfikowanych starterów.

Drugim krokiem jest oczyszczenie produktów amplifikacji, ilościowe ich określenie i połączenie. Następnie pula amplikonów jest przyłączana do kulek sekwencjonowania amplifikowanych klonalnie podczas emulsji PCR i sekwencjonowana na sekwenatorze laboratoryjnym. Ostatnim krokiem jest analiza wynikowych zestawów danych sekwencji.

Ostatecznie 16 S-R-R-N-A. Sekwencjonowanie amplikonów genów służy do określania składu i różnorodności społeczności drobnoustrojów w próbce środowiskowej. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak DGG czy sekwencjonowanie klonowania, jest to, że daje głębszą i jaśniejszą perspektywę na skład i różnorodność społeczności drobnoustrojów.

Ta metoda może pomóc Ci odpowiedzieć na jedno z kluczowych pytań w ekologii drobnoustrojów, kto tam jest, aby rozpocząć startery do przodu i do tyłu? Dwa X hot start tac plus master mix i próbki, sekwencja starterów do przodu i do tyłu pasują do pokazanego szablonu. Sekwencja zawiera adaptery specyficzne dla torrentów jonowych.

Klucz sekwencjonowania do kalibracji natężenia sygnału na początku sekwencjonowania. Uruchom starter specyficzny dla szablonu i kod kreskowy z 10 parami podstawowymi. Następnie dokładnie wymieszaj podkłady i próbki przed użyciem.

Przygotuj reakcję PCR. Wymieszać 20 mikrolitrów na reakcję zawierającą 0,5 mikromola odwróconego startera, 0,4 miligrama na mililitr BSA i jedną X hot start tac plus master mix. Następnie odpipetować 18,5 mikrolitra mieszanki wzorcowej do każdej probówki PCR, dodać 0,5 mikrolitra 20-milimolowego roztworu podstawowego startera zawierającego inny kod kreskowy do każdej z próbek, które zostaną zsekwencjonowane razem.

Następnie na zewnątrz kaptura PCR dodaj jeden mikrolitr próbki o stężeniu od jednego do 10 nanogramów na mikrolitr do probówki PCR. Ustaw program z początkową denaturacją 95 stopni Celsjusza na pięć minut. Następnie 25 cykli w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 30 sekund.

55 stopni Celsjusza przez 30 sekund i 72 stopnie Celsjusza przez 45 sekund. Końcowe wydłużenie powinno wynosić 72 stopnie Celsjusza przez 10 minut. Umieść probówki w maszynie do PCR i uruchom program.

Końcowe produkty PCR można umieszczać w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub ujemnych 20 stopni Celsjusza do momentu użycia. Przygotuj żel 2%aros za pomocą największych dostępnych grzebieni. Następnie wymieszaj pięć mikrolitrów sześciu x barwnika ładującego żel z każdą reakcją PCR i załaduj próbki na żel, oddzielając każdą próbkę pustą.

Dobrze uruchom żel pod napięciem 70 woltów przez 50 minut. Po uruchomieniu żelu zrób zdjęcie żelu i odetnij pasma za pomocą skalpela. Oczekuje się, że każde pasmo będzie miało około 250 par zasad, co zawiera 190 par zasad z 63 parami zasad, które tworzą adaptery i kody kreskowe.

Następnie zważ wycięte prążki i przystąp do ekstrakcji żelu i oczyszczania produktów PCR. Korzystając z zestawu, takiego jak zestaw do szybkiej ekstrakcji żelu Kayak, oznacz ilościowo każdy produkt PCR za pomocą pico green i rozcieńcz, aby uzyskać roztwór podstawowy pięć razy 10 do dziewiątych cząsteczek na mikrolitr, czyli około jednego nanograma na mikrolitr. Jeśli niektóre próbki wykazują niższą amplifikację, w razie potrzeby dostosuj stężenie, ale nie schodź poniżej 1,57 razy 10 do siódmej cząsteczki na mikrolitr.

Zebrać 10 mikrolitrów każdego rozcieńczonego produktu PCR Aby uzyskać równą pulę molową próbek, przygotować jedną oddzielną pulę dla każdej z planowanych serii sekwencjonowania. Zebrane w pulę produkty PCR można przechowywać w zamrażarce do czasu wykorzystania do wykonania emulsji. PCR najpierw rozcieńczyć połączone produkty PCR do 26 pikamolów w objętości 25 mikrolitrów i pobrać odczynniki z zestawu matryc jonowych PGM.

Następnie pracuj w kapturze do PCR i przygotuj emulsję PCR. Wymieszaj połączone produkty PCR, a cząsteczki kuli można dodać podczas pracy na stole. Dokładnie wymieszaj roztwór, a następnie włóż mieszaninę do wkładu filtracyjnego i ostrożnie uzupełnij olejem emulsyjnym.

Następnie powoli odwróć wkład filtra i załaduj wkład do automatycznego aparatu do emulsyjnego PCR. Następnie wybierz odpowiedni program i rozpocznij procedurę. Po zakończeniu automatycznego PCR emulsji należy usunąć supernatant z probówek zbiorczych i pobrać cząstki kuli znajdujące się na dnie probówek. Resus.

Zawiesić kulki w 100 mikrolitrach roztworu do płukania i pobrać podwielokrotność dwóch mikrolitrów do ilościowego określenia biblioteki. Aby zsekwencjonować produkty PCR, przygotuj plan sekwencjonowania, który określa szczegóły sekwencjonowania. Następnie otwórz urządzenie, kliknij inicjalizację, a po wyświetleniu monitu zainstaluj roztwór myjący numer dwa, roztwór płuczący numer jeden i roztwór buforowy automatycznego pH w przyrządzie do sekwencjonowania.

Następnie kontynuuj procedurę inicjalizacji i po wyświetleniu monitu dodaj nukleotydy D-A-T-P-D-G-T-P-D-C-T-P i DTTP i DTTP do odpowiednich 50-mililitrowych probówek. Następnie przykręć rurki do maszyny sekwencjonującej i kontynuuj procedurę inicjalizacji. Po zakończeniu procedury inicjalizacji natychmiast rozpocznij procedurę ładowania próbki, aby przygotować próbki do sekwencjonowania.

Odwirować wzbogacone kulki z emulsji PCR w temperaturze 15 500 razy G przez 1,5 minuty, aby zebrać kulki na dnie probówki. Następnie usuń S natin i pozostaw dokładnie trzy mikrolitry w probówce. Następnie dodaj trzy mikrolitry startera do sekwencjonowania do probówki i pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić cząstki i dokładnie wymieszać roztwór.

Inkubować probówkę przez dwie minuty w temperaturze 95 stopni Celsjusza, a następnie przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zakończeniu inkubacji dodaj jeden mikrolitr polimerazy i dobrze wymieszaj, a następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Podczas inkubacji mieszaniny załaduj chip sekwencjonujący do sekwencjonera i przeprowadź kontrolę jakości chipa.

Następnie usuń płyn z chipa za pomocą szybkiego odwirowania i mikrowirówki. Załaduj próbkę do chipa, powoli pipetując siedem mikrolitrów mieszanki kulek enzymatycznych i unikając wprowadzania pęcherzyków do chipa. Po załadowaniu próbki do chipa umieść chip w urządzeniu i rozpocznij sekwencjonowanie.

Aby rozpocząć analizę danych, połącz się z serwerem danych sekwencjonowania i pobierz szybki plik Q. Następnie utwórz plik z zakładkami, rozdzielany oligonukleotydami zawierający informacje o starterze i kodzie kreskowym. Następnie pobierz pliki referencyjne Green Genes ze strony matki, uruchom mother i przeprowadź analizę.

Przekonwertuj pliki FASTQ na plik o szybkiej jakości za pomocą polecenia pokazanego u dołu ekranu. Określ przynależność do grupy każdej sekwencji i przytnij sekwencje. Za pomocą tego polecenia sklasyfikuj sekwencje w taksonomii Zielonych Genów.

Korzystając z tego polecenia, średnia moc wyjściowa podczas sekwencjonowania przy użyciu statku three 14 na potoku jonowym PGM wynosi około 0,3 do 0,5 miliona. Dobrej jakości odczyty po przefiltrowaniu wyników w matce. Oto typowy podział liczby odczytów po każdym kroku tej procedury sekwencjonowania nowej generacji, pokazany poniżej średni skład społeczności na poziomie klasy typu wszystkich 36 multipleksowanych próbek środowiskowych, które zostały amplifikowane starterami ukierunkowanymi na region V od trzech do czterech rybosomu 16 s i analizowane przy użyciu wzorca matki One.

Tę technikę można wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak sekwencjonować 16 kandydatów na rybosomalne RNA za pomocą maszyny do sekwencjonowania stacjonarnego.