Ex vivo Posiew jądra poczwarki Drosophila i pojedyncze torbiele linii zarodkowej samca: rozwarstwienie, obrazowanie i leczenie farmakologiczne

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie kultur ex vivo drosophila, jąder źrenicy i torbieli linii zarodkowej w celu przeprowadzenia badań obrazowych na żywo i leczenia inhibitorami w celu analizy post miotycznej W przypadku miogenezy osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie nienaruszonych jąder z wczesnego puy 24 godziny po utworzeniu purium. Drugim krokiem jest wypreparowanie pojedynczych torbieli linii zarodkowej z tych jąder, a następnie nienaruszone jądra i pojedyncze torbiele linii zarodkowej można wykorzystać do eksperymentów obrazowania na żywo. Alternatywnie, następnym krokiem jest inkubacja nienaruszonych jąder lub torbieli linii zarodkowej za pomocą związków inhibitorowych.

Ostatecznie barwienie immunologiczne dyni, jąder i mikroskopia fluorescencyjna są wykorzystywane do monitorowania efektu leczenia. Główną zaletą tej techniki hodowli ex vivo w porównaniu z istniejącymi metodami genetycznymi jest to, że umożliwia ona dostęp do spermatogenezy dilo w fazach postmiotycznych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mają trudności, ponieważ niektóre doświadczenia wymagały preparowania i obchodzenia się z tkankami źrenicy.

Aby rozpocząć eksperyment, rozprowadź krople 80 mikrolitrów tarcz i pożywki dla trzech owadów San M z płodową surowicą bydlęcą i antybiotykami na 10-centymetrową szalkę Petriego. Następnie, używając szerokiej pary kleszczy, wybierz poczwarkę i przenieś ją do kropli pożywki na talerzu. Następnie przenieś materiał do mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w oświetlacz światłowodowy.

Uważaj, aby nie podgrzewać jąder powyżej temperatury pokojowej podczas sekcji za pomocą kleszczy numer pięć. Chwyć poczwarkę na jej najbardziej tylnym końcu i przytrzymaj ją na miejscu. Chwyć przednie sfery kolejną parą kleszczy i otwórz źrenicę trwałej ondulacji na jej przednim końcu.

Zdejmij obudowę źrenicy, aż przynajmniej część klatki piersiowej zostanie odsłonięta. Kontynuuj utrzymywanie poczwarki w pozycji za jej najbardziej tylny koniec i zwolnij wewnętrzny nacisk poczwarki, wkładając oba ramiona kleszczy w obszar głowy poczwarki. Następnie rozerwij poczwarkę, otwierając kleszcze i przesuwając kleszcze w kierunku przednim i upewnij się, że otwór jest jak największy przy pierwszej próbie.

Unikaj uszkodzenia poczwarki na jej tylnym końcu przed zwolnieniem nacisku. Ponieważ może to spowodować, że jądra zostaną przepchnięte bezpośrednio przez mały otwór i uszkodzone. Po otwarciu poczwarki, uwolnione ciśnienie wewnętrzne poczwarki wypycha kłębki komórek tłuszczowych i tkanek przez duży otwór.

Następnie zwiększ rozmiar otworu za pomocą jednej pary kleszczy i unikaj ściskania poczwarki kleszczami, ponieważ może to uszkodzić jądra. Następnie trzymaj poczwarkę na jej najbardziej tylnym końcu blisko. Druga para kleszczy i delikatnie rozpyla zawartość poczwarki od tyłu do przodu, aby uwolnić jądra z poczwarki.

Sprawdź, czy jądra źrenicy zostały wypchnięte. Nie będą one połączone z żadną inną tkanką. Po 24 godzinach PF zbiera jądra za pomocą wstępnie wyciętej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Przenieś tylko niewielką ilość pożywki, aby zmniejszyć liczbę komórek tłuszczowych przenoszonych z jądrami. Następnie umieść jądra w pożywce w naczyniu ze świeżymi kulturami. Przemyj jądra kilka razy pożywką, aż pozostanie tylko kilka komórek tłuszczowych do obrazowania na żywo.

Przenieś jądra do naczynia hodowlanego ze szklanym dnem z pożywką i użyj odwróconego mikroskopu obrazowego, aby rozpocząć sekcję. Przenieś jedno lub więcej jąder źrenicy do naczynia hodowlanego ze szklanym dnem wypełnionego pożywką. Użyj mikroskopu stereoskopowego z oświetleniem światłowodowym i dwiema igłami ze stali nierdzewnej do preparowania torbieli męskiej linii zarodkowej.

Z jedną igłą ostrożnie przygwożdżoną, jedno jądro na jego przednim lub tylnym końcu i przytrzymaj je na miejscu. Włóż drugą igłę do jądra i rozerwij osłonkę jądra, przesuwając igłę na boki, co spowoduje uwolnienie wielu torbieli. Kontynuuj utrzymywanie jądra w odpowiedniej pozycji za pomocą jednej igły.

Następnie użyj drugiej igły, aby delikatnie usunąć pozostałe torbiele z jądra. Następnie oddzielne zagregowane torbiele. Za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, przenosząc torbiele do świeżego naczynia z kulturą hodowlaną z podłożem.

Następnie przenieś wyhodowaną szalkę do odwróconego mikroskopu obrazowania, aby obrazować na żywo pojedyncze torbiele. W razie potrzeby ponownie rozproszyć torbiele za pomocą igły, zidentyfikować stadium torbieli za pomocą kontrastu fazowego i mikroskopii fluorescencyjnej. Skoncentruj się na torbieli na pożądanym etapie.

Często potwierdzaj ostrość i położenie torbieli. Podczas dłuższych eksperymentów obrazowych torbiele nie przylegają do dna naczynia hodowlanego. Zamierzam unosić się poza ostrością.

Napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej 500 mikrolitrami pożywki na jeden eksperyment z 12 powtórzeniami. Następnie przenieś jedno jądro źrenicy do każdej studzienki za pomocą wstępnie naciętej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Następnie sprawdź obecność protaminy w izolowanych jądrach za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

Jądra powinny być wolne od protaminy, sygnału B-E-G-F-P, co wskazuje, że przejście hisonu na protaminę lub HP nie nastąpiło w żadnej z torbieli. Zastąp jądra, które już wykazują dodatnie torbiele. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki zawierającej kwas endokarynowy, związek hamujący, aby osiągnąć końcowe stężenie 150 mikromolów w jednym mililitrze do każdego z pierwszych 12 dołków.

Pozostałe studzienki należy wykorzystać jako niepoddane działaniu substancji kontrolnej, dodając 500 mikrolitrów pożywki z rozpuszczalnikiem. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pięciu stopni Celsjusza przez 24 godziny w ciemności. Sprawdź ponownie obecność protaminy w inkubowanych jądrach.

Jądra kontrolne powinny teraz wykazywać jedną lub więcej torbieli protaminowych, B-E-G-F-P, co wskazuje na przejście przez przełącznik HP. Następnie za pomocą pipety z końcówką o pojemności 200 mikrolitrów przenieś jądra do szkiełek pokrytych poli L lizyną. Wykonaj preparaty do squasha i wybarwić przeciwciałami fluorescencyjnymi.

Zgodnie z opublikowanymi protokołami, przy użyciu tej metody preparacji uzyskano obrazy z kontrastem fazowym jąder drosophila. Jest to lekko zgniecione całe jądro wierzchowca poczwarki drosophila. Po 24 godzinach od utworzenia PY lub spermatogonii PF są ograniczone do przedniego końca poniżej obszaru piasty.

Pozostałe jądro jest wypełnione spermatocytami, spermatydami w stadium prądu Nevin z okrągłymi jądrami i spermatydami w stadiach wydłużających się z rosnącymi nakładkami wici kontrastu fazowego, uzyskano obrazy fluorescencyjne EGFP i RFP z jąder źrenicy montowanych w domu w celu wykrycia H, dwóch, A-V-D-R-F-P i protaminy B-E-G-F-P w 24 godzinach A PF. Żaden z plemników nie był często poddawany przełączaniu HP. Jądra wycięte na tym etapie zawierają strukturę autofluorescencyjną. Jądro źrenicy jest wycinane przez 36 godzin PF wykazuje pierwszą torbiel protaminową, B-E-G-F-P.

Jądra źrenicy 48 godzin A PF mają kilka torbieli linii zarodkowej z widocznymi jądrami protaminowo-dodatnimi. Można rejestrować poklatkowe obrazy na żywo ex vivo całych jąder rozwijających się w hodowli. Stosując tę metodę, jądro źrenicy było preparowane przez 45 godzin, PF inkubowano w pożywce przez sześć godzin i obrazowano co pięć minut.

W tym czasie kilka torbieli spermatyd wyłania się ze stadium przełącznika HP i wykazuje jasny sygnał protaminowy B-E-G-F-P. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać wczesne jądro źrenicy i pojedynczą torbiel linii zarodkowej w hodowli w celu wykonania obrazowania in vivo lub leczenia inhibitorami.