Pomiar strumieni mineralnych składników odżywczych i substancji toksycznych w roślinach z radioaktywnymi znacznikami

In planta pomiar strumieni składników odżywczych i toksycznych jest niezbędny do badania odżywiania i toksyczności roślin. W tym miejscu omawiamy protokoły radioznacznikowe do oznaczania napływu i odpływu w nienaruszonych korzeniach roślin, używając jako przykładów strumieni potasu (K⁺) i amoniaku/amonu (NH₃/NH₄⁺). Omówiono zalety i ograniczenia takich technik.

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zmierzenie jednokierunkowych przepływów potasu i amoniaku do i z korzeni nienaruszonych siewek jęczmienia oraz scharakteryzowanie funkcjonowania kluczowych systemów transportu składników odżywczych w błonach roślinnych. Osiąga się to poprzez pierwszą uprawę sadzonek przez tydzień w roztworach hydroponicznych o określonym składzie chemicznym, aby zapewnić roślinom stały stan odżywczy. Kultura hydroponiczna umożliwia dostęp do korzeni do eksperymentalnej manipulacji.

W drugim etapie korzenie nienaruszonych roślin zanurza się na różne okresy czasu w roztworach doświadczalnych, w tym w roztworach absorpcyjnych, w których substrat będący przedmiotem zainteresowania jest wzbogacony izotopem promieniotwórczym. Ten krok zostanie wykorzystany do określenia szybkości transportu do i z sadzonek. Następnie rośliny są albo preparowane natychmiast po krótkim okresie pobierania w celu eksperymentów z jednokierunkowym napływem, albo przenoszone do lejka FLX po dłuższym pobieraniu w celu pomiaru uwalniania znacznika.

Korzystając z analizy kompartmentowej za pomocą tracer, flx lub Kate, uzyskuje się wyniki, które mogą ujawnić kluczowe aspekty pojemności, energii, mechanizmów i regulacji systemów transportowych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania związane z fizjologią odżywiania roślin, takie jak to, w jaki sposób mineralne składniki odżywcze i toksyny są transportowane do i z roślin? W jaki sposób takie strumienie reagują na zmieniające się środowisko i jak wpływają na podział substratów komórkowych i tkankowych?

I wreszcie, w jaki sposób stresy abiotyczne, które zagrażają środowisku ekologicznemu w rolnictwie, takie jak zasolenie, susza i toksyczność metali ciężkich, wpływają na przepływy składników odżywczych roślin i dynamikę. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak testy zubożenia lub akumulacji substratu lub pomiary selektywnych elektrod wibracyjnych żelaza, jest to, że jesteśmy w stanie mierzyć strumienie jednokierunkowe, w przeciwieństwie do wygięć netto, co stanowi różnicę między napływem a eFlex. W ten sposób jesteśmy w stanie uzyskać cenny wgląd w wydolność energetyczną, mechanizmy i regulację systemów transportu składników odżywczych i środków odurzających roślin.

Modelowy gatunek jęczmienia zostanie wykorzystany w tym eksperymencie, hoduj sadzonki jęczmienia hydroponicznie przez siedem dni w kontrolowanej klimatycznie komorze wzrostu na dzień przed eksperymentem, zgrupuj kilka sadzonek razem, aby uzyskać jedną replikę. Owiń dwucentymetrowy kawałek rurki tigon wokół podstawowej części zsypów i zabezpiecz rurkę taśmą, aby utworzyć kołnierz. Użyć trzech roślin na wiązkę do bezpośredniego napływu lub testu DI i sześciu roślin na wiązkę do analizy kompartmentowej za pomocą testu znacznikowego, flx lub Kate na dzień przed eksperymentem.

Przygotuj następujące materiały i roztwory do DI, zbierz roztwory do wstępnego etykietowania, etykietowania i DESORPCJI, probówki wirujące i fiolki z próbkami, napowietrzaj i mieszaj wszystkie roztwory dla Kate. Zbierz dobrze następujące elementy. Mieszane napowietrzone roztwory do etykietowania i elucji, lejki wypływowe, probówki wirówkowe i fiolki na próbki.

Przygotuj radioznaczniki w dniu eksperymentu, przestrzegając wszystkich wymagań licencji na materiały promieniotwórcze wydanej przez instytucję. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny i dozymetry oraz stosować odpowiednie osłony do przygotowania radioaktywnego izotopu potasu. Potas 42.

Umieść czystą, suchą zlewkę na wadze i wyzeruj wagę. Wyjąć fiolkę ze znacznikiem z opakowania i wsypać proszek do zlewki. Zwróć uwagę na pipetę masową, 19,93 mililitra wody destylowanej do zlewki, a następnie 0,07 mililitra kwasu siarkowego.

Następnie oblicza się stężenie radioaktywnego roztworu podstawowego. Biorąc pod uwagę masę i masę cząsteczkową węglanu potasu oraz objętość roztworu, należy użyć licznika Geigera Muellera do rutynowego monitorowania zanieczyszczenia. Radioaktywny izotop azotu 13 jest wytwarzany w cyklotronie i dociera w postaci cieczy do pomiarów DI.

Używając pipety do potasu 42, ilość radioaktywnego roztworu podstawowego wymagana do osiągnięcia pożądanego końcowego stężenia potasu w roztworze do etykietowania W przypadku pomiarów DI przy użyciu azotu 13 odpipetować niewielką ilość mniejszą niż 0,5 mililitra znacznika radiowego do roztworu do etykietowania. Poczekaj, aż roztwór do etykietowania dokładnie wymiesza się poprzez napowietrzanie. Następnie odpipetować jednomililitrową podpróbkę roztworu do etykietowania do każdej z czterech fiolek z próbkami.

Zmierzyć aktywność radiową w fiolkach za pomocą licznika gamma. Upewnij się, że licznik jest zaprogramowany w taki sposób, aby zliczenia na minutę lub odczyty CPM były korygowane. W przypadku rozpadu izotopowego, który jest szczególnie ważny w przypadku krótkożyciowych znaczników, należy obliczyć aktywność właściwą roztworu do znakowania S, która nie jest wyrażona w liczbie na minutę na mikromol, uśredniając liczbę czterech próbek i dzieląc przez stężenie substratu w roztworze, zanurzyć korzenie jęczmienia w nieradioaktywnym roztworze do wstępnego znakowania na pięć minut w celu wstępnego zrównoważenia roślin w warunkach badania.

Następnie zanurz korzenie w radioaktywnym roztworze znakującym na pięć minut. Przenieś korzenie do roztworu DESORPCYJNEGO na pięć sekund, aby usunąć większość przylegającej do powierzchni aktywności radiowej. Następnie przenieś korzenie do drugiej zlewki z roztworem desorpcyjnym na pięć minut.

Aby dodatkowo oczyścić korzenie ze śladu zewnątrzkomórkowego, wypreparuj i oddziel pędy, pędy podstawowe i korzenie. Umieść korzenie w probówkach wirówkowych i wiruj próbki przez 30 sekund w wirówce o niskiej prędkości klinicznej. Aby usunąć wodę powierzchniową i śródmiąższową, zważ korzenie, aby uzyskać świeżą masę.

Zmierz radioaktywność w próbkach roślinnych za pomocą licznika gamma, oblicz napływ do rośliny za pomocą tego wzoru. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania roztworu do etykietowania i zmierzenia węzła S, jak pokazano wcześniej. Po zmierzeniu s dodaj 19 mililitrów wody do każdej próbki, tak aby końcowa objętość była równa objętości EIT wynoszącej 20 mililitrów.

Policz aktywność radiową w każdej próbce o pojemności 20 mililitrów. Zanurz korzenie w roztworze do etykietowania na godzinę. Po godzinie wyjmij rośliny z roztworu do etykietowania i przenieś je do lejka FLX, upewniając się, że cały materiał korzeniowy znajduje się w lejku.

Delikatnie przymocuj rośliny do boku lejka wypływowego, nakładając mały pasek taśmy na plastikowy kołnierz Delikatnie wlej pierwszy elu do lejka. Uruchom minutnik, aby odliczyć w kilka sekund, a po 15 sekundach otwórz kurek i zbierz EIT do fiolki z próbką. Zamknij kurek delikatnie wlej kolejny EIT do lejka.

W ten sposób należy zebrać EIT za pozostałą część serii Elucian za łączny okres UE wynoszący 29,5 minuty. Po zakończeniu protokołu UE należy zebrać rośliny, jak pokazano wcześniej, policzyć aktywność promieniotwórczą w EIT i próbkach roślin za pomocą licznika gamma, mnożąc odczyt dla każdego EIT przez wykres współczynnika rozcieńczenia, uwalnianie znacznika w funkcji czasu elucji dla warunków stanu ustalonego, przeprowadzić regresje liniowe i obliczenia strumieni. Połowa wielkości wymiany i puli.

Przedstawiono tutaj reprezentatywne izotermy dla napływu amoniaku w funkcji różnych zewnętrznych stężeń amoniaku. W nienaruszonych korzeniach siewek jęczmienia uprawianych przy wysokiej zawartości amoniaku lub amonu oraz o niskiej lub wysokiej zawartości amoniaku potasu strumienie amoniaku były znacznie wyższe przy niskiej zawartości potasu McKayla. Analizy izoterm przeprowadzone przez Menina wykazały, że wysoka zawartość potasu ma stosunkowo niewielki wpływ na powinowactwo do substratu transporterów pobierania amoniaku, ale znacznie zmniejsza zdolność transportową.

Kolejny wynik podkreśla szybką plastyczność systemu pobierania potasu. W korzeniach nienaruszonych siewek jęczmienia uprawianych przy umiarkowanym potasie i wysokim poziomie amonu. Prawie 350% wzrost napływu potasu zaobserwowano w ciągu pięciu minut od wycofania amonu z roztworu zewnętrznego.

Ten efekt wycofania amonu był wrażliwy na blokery kanału potasowego, bar tetraetyloamoniowy, cez. Wykresy te pokazują stan stacjonarny potasu 42 efl w korzeniach nienaruszonych siewek jęczmienia uprawianych przy niskim poziomie potasu i umiarkowanym poziomie azotanów oraz natychmiastowy wpływ 10-milimolowego chlorku cezu, pięciomilimolowego siarczanu potasu i pięciomilimolowego siarczanu amonu na flx potas flx był hamowany przez cez lub potas, ale stymulowany przez amon. Cate może być również używany do szacowania stężeń i czasów obrotu substratu w przedziałach subkomórkowych.

Analiza regresji powoli zmieniającej się fazy uwalniania znacznika wraz z zatrzymywaniem znacznika w tkankach roślinnych może ujawnić ważne informacje na temat wielkości puli i okresu półtrwania wymiany składników subkomórkowych, takich jak ściana komórkowa, cytoplazma i va. Poniższa tabela przedstawia parametry przylądka wyekstrahowane z pomiarów potasu 42 flx w stanie ustalonym w siewkach jęczmienia uprawianych z jednym milimolowym azotanem lub 10 milimolowym amonem. To ostatnie stanowi toksyczny scenariusz.

Wysoki poziom amonu powoduje zahamowanie wszystkich strumieni potasu i znaczne zmniejszenie wielkości basenu. Po opanowaniu, skuteczność metodologii DI można poprawić, rozkładając zabiegi w odstępie 30 sekund. W ten sposób możemy zbadać do 10 warunków w jednym eksperymencie.

Podobnie, kilka biegów Kate może być przeprowadzonych jednocześnie, jeśli jest wystarczająco dużo czasu między biegami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć strumienie składników odżywczych i środków odurzających w nienaruszonych roślinach za pomocą radioaktywnych znaczników.