Name: Ex vivo Odpowiedź na leczenie guzów pierwotnych i/lub związanych z nimi przerzutów w przedklinicznym i klinicznym rozwoju terapii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj technikę ex vivo do oceny odpowiedzi na leczenie guzów pierwotnych i przerzutów w kontekście mikrośrodowiska nowotworowego. Metoda umożliwia precyzyjną analizę skuteczności terapii, mechanizmów oporności i efektów ubocznych, wspierając rozwój leków w badaniach przedklinicznych i klinicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Zespołowi ds. Pozyskiwania Tkanek MSKCC (TPS), a w szczególności Marii Corazon Mariano, Priscilli McNeil, Anasowi Idelbi, Danielowi Navarrete i Katrinie Allen, we wszystkich ich wysiłkach na rzecz pomyślnej realizacji tego projektu i finansowania z następujących źródeł: 5 R21 CA158609-02 oraz Fundacji Conquer Cancer i Fundacji Badań nad Rakiem Piersi. Ponadto autorzy pragną podziękować dr Ericowi Cottingtonowi, wiceprezesowi Biura Badań i Administracji Projektów, Biura Rozwoju Technologii, Badań Informacyjnych i Zgodności oraz Wsparcia Systemów Informatycznych RTM, za wsparcie w złożeniu tego manuskryptu.

UWAGA: Pobieranie tkanek od pacjentów zostało zatwierdzone przez instytucję rewizyjną (IRB) za pomocą zatwierdzonych przez instytucję Biospecimen i Protokołów Klinicznych (numery protokołów odpowiednio 09-121 i 11-041) w Memorial Sloan Kettering Cancer Center.
1. Pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Pobranie pierwotnego guza/przerzutu u pacjenta 
	UWAGA: Do tej pory protokół ten wykonywano w przypadku chirurgicznie usuniętych typów guzów trzustki, żołądka i piersi, a także przerzutów do chłoniaka.
	<ol>
		<li>Poinstruuj zespół chirurgiczny, aby dostarczył próbkę kurierem lub systemem rurek pneumatycznych na oddział patologii w szczelnie zamkniętej i sterylnej, szczelnej plastikowej torbie na próbki w sterylnym pojemniku odpornym na rozlanie. Poinstruuj zespół chirurgiczny, aby przetransportował próbkę w stanie świeżym, bez formaliny lub utrwalacza.</li>
		<li>Poinstruuj patologa lub asystenta patologa, aby zebrał świeżą próbkę przy użyciu sterylnej techniki, która obejmuje użycie sterylnych rękawiczek i narzędzi pod kapturem z przepływem laminarnym.</li>
		<li>Należy zapisać czas pobierania pobranej próbki, który jest rygorystycznie przechowywany poniżej 30 minut od zakończenia zabiegu chirurgicznego. Biorąc pod uwagę skutki zimnego niedokrwienia, nie należy pobierać próbek z wyciętych próbek, których czas niedokrwienia na zimno wynosi > 30 min18.</li>
		<li>Poinstruuj personel Oddziału Patologii, aby usunął pierwotną próbkę guza o wielkości około 0,5 cmod 3 do 1,0 cm3 w okapie z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylne środowisko. Jeśli to możliwe, należy wybrać tkankę nowotworową z obrzeża zmiany wskaźnikowej, aby uniknąć potencjalnej martwicy ośrodkowej (śmierci komórki). 
		UWAGA: Tkanka martwicza może być ogólnie rozpoznawalna na podstawie któregokolwiek z następujących kryteriów: utrata koloru lub bladość tkanki; utrata siły, w której tkanka martwicza jest miękka i krucha; wyraźne rozgraniczenie między tkanką martwiczą a żywotną.</li>
		<li>Poinstruuj patologa lub asystenta patologa, aby dostarczył tkankę obwodową, której jest nadmiar (odrzucenie chirurgiczne) po natychmiastowym pobraniu próbki guza w celu oceny diagnostycznej. Umieścić próbkę w sterylnej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej około 5 ml minimalnej ilości pożywki niezbędnej (MEM) zawierającej 1% antybiotyków (penicyliny i streptomycyny).</li>
		<li>Jeśli jest to możliwe (np. węzeł chłonny ogona pachowego próbki po mastektomii), należy pobrać rażąco dodatni wycinek węzłów chłonnych o tej samej wielkości (0,5 cm3 do 1,0 cm3) i porównać z reakcją na lek guza pierwotnego. Podobnie jak pierwotną próbkę guza, umieść powiązaną próbkę węzłów chłonnych w 15 ml sterylnej stożkowej probówce wirówkowej zawierającej około 5 ml minimalnej ilości niezbędnych pożywek (MEM) zawierających 1% antybiotyków (penicyliny i streptomycyny).</li>
		<li>Jeśli pozwala na to wielkość próbki chirurgicznej (np. wycinek po mastektomii), należy usunąć (z dala od guza pierwotnego) próbkę normalnej tkanki (tj. normalnego gęstego/włóknistego miąższu piersi) i umieścić w sterylnej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej około 5 ml minimalnej ilości niezbędnej pożywki (MEM) zawierającej 1% antybiotyków wyłącznie do celów przenoszenia. Po przeniesieniu do laboratoriów należy przenieść "normalną" próbkę do kriowialu, zamrozić "błyskawicznie" i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C do przyszłych analiz molekularnych.</li>
		<li>Umieścić wszystkie próbki na mokrym lodzie i natychmiast przetransportować do pomieszczenia laboratoryjnego w celu przeprowadzenia sekcji świeżych tkanek ex vivo. Nie należy kroić normalnej próbki, ale przechowywać ją w zamrażarce o temperaturze -80 °C do przyszłych analiz molekularnych. Przenieś część guza pierwotnego i związanych z nim przerzutów do kriowialnego, "błyskawicznego" zamrożenia i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C do przyszłych analiz molekularnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie tkanek z badań klinicznych (np. opcjonalne biopsje gruboigłowe (CNB)) 
	UWAGA: Uzyskujemy tkanki nowotworowe od pacjentów włączonych do protokołów klinicznych, którzy wyrażają zgodę na poddanie się CNB dostępnego przerzutu guza przed rozpoczęciem terapii. Do tej pory CNB wykonywano u pacjentek z chłoniakiem piersi, chłoniakiem strefy brzeżnej, chłoniakiem z komórek płaszcza, przerzutowym przyzwojakiem, szyjką macicy (płaskonabłonkowym) i rakiem jajnika.
	<ol>
		<li>Zlecić personelowi klinicznemu z radiologii interwencyjnej lub odpowiedniego oddziału wykonanie biopsji gruboigłowej przed leczeniem i umieszczenie próbki w sterylnej stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej około 5 ml minimalnej ilości niezbędnych pożywek (MEM) zawierających 1% antybiotyków (penicyliny i streptomycyny).</li>
		<li>Umieść próbkę biopsji na mokrym lodzie i natychmiast przetransportuj do przestrzeni laboratoryjnej w celu przeprowadzenia sekcji świeżych tkanek ex vivo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie materiałów do cięcia i ustawień wibratomu
<ol>
	<li>Przygotowanie materiałów do przekroju
	<ol>
		<li>Przygotować 4% roztwór agarozy, dodając 4 g agarozy do 100 ml PBS. Autoklaw (ustawienia cyklu: ciecz, 121 °C, 30 min, 15 funtów na cal kwadratowy) roztwór przed pierwszym użyciem. W przypadku kolejnych zastosowań, umieść 4% agarozę w kuchence mikrofalowej w celu skroplenia (wysoka temperatura w odstępach 30 sekund) przed każdym użyciem i odpowiednio schłodzić do ~ 25 °C (tj. ciepłej w dotyku), pamiętając, że agaroza krzepnie w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Agarozę 4% należy stosować jako nietrwałe podłoże do zatapiania tkanek. Gdy 4% agaroza wystarczająco ostygnie i nadal jest w stanie ciekłym, za pomocą sterylnych kleszczy umieść próbkę tkanki w formie do zatapiania i wlej 4% agarozy.</li>
		<li>Umieść próbkę tkanki blisko (odległość ~ 2 mm), ale nie bezpośrednio na ściance powierzchni tnącej formy do zatapiania. 4% agaroza zacznie szybko krzepnąć, dlatego należy szybko odpowiednio ustawić próbkę tkanki. Podczas dzielenia na sekcje należy przechowywać 4% agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C, aby utrzymać ją w roztworze.</li>
		<li>Do 24-dołkowej płytki do analizy skrawków dodać 1 ml kompletnej pożywki (tj. MEM + 10% płodowej surowicy bydlęcej + 1% antybiotyków) do każdej studzienki. Utrzymywać 24-dołkową płytkę w temperaturze wilgotnej temperatury (~25 °C) przez cały czas trwania sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie ustawień wibratomu
	<ol>
		<li>Za pomocą mikrotomu wibracyjnego ustaw prędkość, z jaką ostrze zbliża się do próbki [0 (0,00 mm/s) na 10 (2,5 mm/s)] oraz częstotliwość ostrza [0 (0 Hz) na 10 (100 Hz)]. Dostosuj ustawienia do tekstury tkanki (tj. gęstości/jędrności).</li>
		<li>W przypadku pierwotnego guza piersi inwazyjnego raka przewodowego dostosuj ustawienia odpowiednio do 6 i 3, prędkości i częstotliwości. W przypadku mniej gęstej/twardej tkanki nowotworowej należy odpowiednio zmniejszyć prędkość i zwiększyć częstotliwość.</li>
		<li>Ustaw grubość przekroju w granicach przyrządu (1 – 999 μm). W przypadku tych analiz należy ustawić grubość przekroju na 200 μm.</li>
		<li>Zamontuj próbkę zanurzoną w agarozie za pomocą cienkiej warstwy płynnego kleju na krążku próbki, który jest zanurzony w zbiorniku pożywki otoczonej mokrym lodem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Cięcie tkanek, leczenie i analizy
<ol>
	<li>Natychmiast po pokrojeniu za pomocą sterylnych kleszczy usunąć precyzyjnie pokrojone skrawki i umieścić na płytce wielodołkowej z 1 ml kompletnego podłoża. Po uzyskaniu wystarczającej liczby skrawków do analizy odpowiedzi i korelacji, należy umieścić płytkę wielodołkową w celu uzyskania odpowiedzi na leczenie w inkubatorze do hodowli tkankowej ustawionym w standardowych warunkach hodowli tkankowej.</li>
	<li>Weź wiele sekcji kontrolnych, które zamykają leczone sekcje, aby potwierdzić odpowiedź zależną od dawki, w przeciwieństwie do hodowanych artefaktów. Wykonaj szybkie cięcie tkanek (~30 – 40 min), dobrze w przypadku negatywnego wpływu zimnego niedokrwienia (~2 – 4 godziny)18. Leczenie skrawków należy wykonywać dopiero po 1-godzinnym okresie aklimatyzacji.</li>
	<li>Po 1-godzinnym okresie aklimatyzacji należy dodawać coraz większe dawki (istotne terapeutycznie; np. stężenia 0 – 10 μM) leku do skrawków i pomieszczenia w standardowych warunkach hodowli tkankowej przez okres leczenia. W tym badaniu należy zastosować 24 i/lub 48-godzinne okresy oceny. Jednak kontrolne skrawki tkanek (tylko nośnik) pozostaną żywotne, jak przetestowano w tym badaniu, przez okresy do 96 godzin włącznie.</li>
	<li>Po leczeniu usunąć wszystkie skrawki w sterylnych warunkach i utrwalić formalinę, umieszczając wycinek tkanki w probówce zawierającej 10% buforowanej formaliny i umieścić w temperaturze RT O/N lub w probówce zawierającej 4% paraformaldehydu (rozcieńczyć 16% paraformaldehydu z fiolki z PBS do końcowego stężenia 4%) i umieścić w RT na 2 godziny.
	<ol>
		<li>Utrwal większe skrawki tkanki (np. ~6 mm x 4 mm) o grubości 200 μm w 10% buforowanej formalinie O/N w RT. Utrwal mniejsze odcinki (np. 1 mm x 1 mm) o grubości 200 μm w 4% paraformaldehydzie przez 2 godziny w RT. 
		UWAGA: Aby skutecznie penetrować utrwalacz, objętość utrwalacza powinna być 20x większa od objętości tkanki. Biorąc pod uwagę, że protokół ten skutkuje bardzo małymi rozmiarami tkanek (np. 6mm3 tkanka = 6 μl objętości), w celu zapewnienia prawidłowego utrwalenia należy użyć 1 ml utrwalacza dla wszystkich rozmiarów tkanek.</li>
		<li>Po utrwaleniu próbki tkanek mają zatopione w parafinie przez personel Oddziału Patologii. Próbki należy przeciąć bloki parafiny na naładowane szkiełka, aby wybarwić hematoksylinę i eozynę, a następnie ocenić immunohistochemicznie (np. apoptoza).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Abercrombie, M., Ambrose, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+Microscope+Studies+of+Cell+Contacts+in+Tissue+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Interference Microscope Studies of Cell Contacts in Tissue Culture.</a> Experimental Cell Research. 15 (58), 332-345 (1958).</li>
<li>Coriell, L. L., McAllister, R. M., Wagner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Criteria+for+Determining+Malignancy+in+Tissue-Culture+Cell+Lines+in+the+Albino+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22New+York+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Criteria for Determining Malignancy in Tissue-Culture Cell Lines in the Albino Rat.</a> New York Academy of Science. 5, 351-355 (1957).</li>
<li>Paul, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cancer+Cell+in+Vitro%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The Cancer Cell in Vitro: A Review.</a> Cancer Research. 22, 431-440 (1962).</li>
<li>Dean, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+response+to+CDK4%2F6+inhibition+in+breast+cancer+defined+by+ex+vivo+analysis+of+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Therapeutic response to CDK4/6 inhibition in breast cancer defined by ex vivo analysis of human tumors.</a> Cell Cycle. 11 (14), 2756-2761 (2012).</li>
<li>Bray, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+Modulation+to+Activate+Apoptosis+in+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 Modulation to Activate Apoptosis in Prostate Cancer.</a> Molecular Cancer Research. 7 (9), 1487-1496 (2009).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Tumor-Stroma+Interactions+during+Chemotherapy+Reveals+Contributions+of+the+Microenvironment+to+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging Tumor-Stroma Interactions during Chemotherapy Reveals Contributions of the Microenvironment to Resistance.</a> Cancer Cell. 21, 488-503 (1016).</li>
<li>Shi, Y., Hogue, J., Dixit, D., Koh, J., Olson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+genetic+studies+of+isolated+cells+from+parathyroid+tumors+reveal+the+complex+pathogenesis+of+parathyroid+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Functional and genetic studies of isolated cells from parathyroid tumors reveal the complex pathogenesis of parathyroid neoplasia.</a> PNAS. 111 (8), 3092-3097 (2014).</li>
<li>Vidal, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cancer+stem+cells+from+human+prostate+cancer+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of cancer stem cells from human prostate cancer samples.</a> J. Vis. Exp. (85), e51332(2014).</li>
<li>Wanping, X., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Molecular+Chaperone+Heat+Shock+Protein+90+Provides+a+Multifaceted+Effect+on+Diverse+Cell+Signaling+of+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting the Molecular Chaperone Heat Shock Protein 90 Provides a Multifaceted Effect on Diverse Cell Signaling of Cancer Cells.</a> Clinical Cancer Research. 13, 1625-1629 (2007).</li>
<li>Moulick, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-based+proteomics+reveal+cancer-specific+networks+coordinated+by+Hsp90%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Affinity-based proteomics reveal cancer-specific networks coordinated by Hsp90.</a> Nature Chemical Biology. 7 (11), 818-826 (1038).</li>
<li>Alpaugh, M. L., Tomlinson, J. S., Ye, Y., Barsky, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+sialyl-Lewis%28x%2Fa%29+underexpression+and+E-cadherin+overexpression+in+the+lymphovascular+embolus+of+inflammatory+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Relationship of sialyl-Lewis(x/a) underexpression and E-cadherin overexpression in the lymphovascular embolus of inflammatory breast cancer.</a> American Journal of Pathology. 161 (2), 619-628 (2002).</li>
<li>Chu, K., Boley, K. M., Moraes, R., Barsky, S. H., Robertson, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paradox+of+E-cadherin%3A+role+in+response+to+hypoxia+in+the+tumor+microenvironment+and+regulation+of+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The paradox of E-cadherin: role in response to hypoxia in the tumor microenvironment and regulation of energy metabolism.</a> Oncotarget. 4 (3), 446-462 (2013).</li>
<li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> PNAS. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li>
<li>Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+human+prostate+tissue+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development.</a> Nature Reviews Urology. 10, 483-487 (2013).</li>
<li>Jhaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+90+inhibitors+in+the+treatment+of+cancer%3A+current+status+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Investigational+Drugs%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 90 inhibitors in the treatment of cancer: current status and future directions.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 5, 611-628 (2014).</li>
<li>Gerecitano, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+124-PU-H71PET+imaging+to+predict+intratumoral+concentration+in+patients+on+a+phase+I+trial+of+PU-H71%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Using 124-PU-H71PET imaging to predict intratumoral concentration in patients on a phase I trial of PU-H71.</a> Journal of Clinical Oncology. 31, Suppl . 11076-11 (2013).</li>
<li>Yildiz-Aktas, I., Dabbs, D. J., Bhargava, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cold+ischemic+time+on+the+immunohistochemical+evaluation+of+estrogen+receptor%2C+progesterone+receptor%2C+and+HER2+expression+in+invasive+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">The effect of cold ischemic time on the immunohistochemical evaluation of estrogen receptor, progesterone receptor, and HER2 expression in invasive breast carcinoma.</a> Modern Pathology. 25, 1098-1105 (2012).</li>
</ol>

Nie ujawniono żadnych konfliktów interesów.

Biolodzy zajmujący się nowotworami stoją przed poważnymi wyzwaniami, próbując opracować skuteczne strategie terapeutyczne. Testowanie leków w fazie rozwoju na ustalonych liniach komórek nowotworowych nie może dokładnie odzwierciedlić odpowiedzi in vivo , a eksperymenty in vivo na modelach PDX są pracochłonne i bardzo kosztowne. Biorąc pod uwagę powyższe, zastosowanie technik ex vivo pierwotnych nowotworówpacjenta 14, 15 jest obecnie umieszczane obok analizy molekularnej ustalonych li...

Opracowanie skutecznych metod leczenia raka okazało się niezwykle trudne. Linie komórek rakowych i eksplantaty nowotworów - a także ksenoprzeszczepy są wykorzystywane w badaniach nad rakiem od ponad pół wieku1,2,3. Do tej pory niezbędna jest analiza molekularna wrażliwości i oporności na leki zarówno w ustalonych liniach komórek nowotworowych, jak i ksenoprzeszczepach pobranych od pacjentów (PDX). Jednak testowanie związków w ustalonych liniach komórek nowotworowych często nie pozwala przewidzieć skuteczności in vivo, a odpowiednie badania in vivo na zwierzętach, zwłaszcza w modelach PDX, są bardzo kosztowne i czasochłonne. Ograniczenia tych systemów modelowych, a mianowicie brak możliwości informowania o wpływie natywnego mikrośrodowiska na progresję guza i odpowiedź na strategie terapeutyczne, skłoniły naukowców do opracowania dodatkowych metod uzupełniających te analizy. Ostatnio coraz większą uwagę zwraca się na analizę ex vivo eksplantatów guza u pacjenta 4, 5 ze względu na lepsze zrozumienie, że odpowiedź terapeutyczna raka nie zależy wyłącznie od nieodłącznego składu molekularnego komórek rakowych, ale raczej duży wpływ ma mikrośrodowisko komórek nowotworowych 6, 7 cecha, której nie można podsumować za pomocą tradycyjnych metod hodowli i / lub PDX. Analiza ex vivo w powyższym kontekście (tj. wpływ sąsiedniego otaczającego mikrośrodowiska komórek nowotworowych) zakłada ocenę żywotnych pierwotnych odcinków guza/przerzutów, a nie analizę ex vivo izolatów komórkowych 8, 9.
Informujemy tutaj o technice ex vivo (tj. precyzyjnie cięte świeże skrawki tkanek) zarówno pierwotnych guzów pacjenta, jak i związanych z nimi przerzutów (tj. węzłów chłonnych), która wiernie informuje o odpowiedzi (IC50), efektach off-target i pozwala na molekularną analizę mechanizmów oporu i sprzężenia zwrotnego. Ponadto można przeprowadzić analizę korelacyjną wrażliwości/oporności terapeutycznej w porównaniu z biomarkerem i profilem ekspresji genów w celu zidentyfikowania pacjentów, którzy z większym prawdopodobieństwem zareagują na eksperymentalny lek będący przedmiotem zainteresowania (tj. wysoka odpowiedź na lek odpowiada pacjentowi o określonym profilu biologicznym). Zastosowanie techniki ex vivo i oceny w sposób wieloparametrowy jest krokiem w kierunku selekcji pacjentów i ogólnej poprawy wyników klinicznych.
Analiza odpowiedzi na leczenie ex vivo może stać się standardowym narzędziem w przedklinicznym i klinicznym rozwoju terapii przeciwnowotworowych i jest postrzegana jako krok w kierunku spersonalizowanego podejścia medycznego w strategiach rozwoju terapeutycznego.

<table><tbody><tr><td>Vibratome Leica VT1000s</td><td>Leica</td><td>14047235613</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure</td><td>agaroza Invitrogen</td><td>16500500</td><td>Przygotuj 4% i 6% przed użyciem</td></tr><tr><td>Ostrze wtryskiwacza</td><td>Ted Pella</td><td>121-4</td><td></td></tr><tr><td>MEM z penicyliną&nbsp; + Streptomycyna</td><td>Media Core Facilities (MSKCC)</td><td></td><td>Pożywka jest przygotowywana w Memorial Sloan Kettering Cancer Center&nbsp;</td></tr><tr><td>Skalpel nr 10</td><td>Thermo Scientific</td><td>31-200-32</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe kleszcze</td><td>Cole-Parmer</td><td>84011182</td><td></td></tr><tr><td>Forma do zatapiania</td><td>Mikroskopia elektronowa Science</td><td>70181</td><td></td></tr><tr><td>FBS (inaktywowana termicznie)</td><td>Płytki</td><td></td> 24-dołkowe Gemini 100106 <td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Formalina (10%)</td><td>Sigma Diagnostics</td><td>SDHT501128&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>16% roztwór formaldehydu</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Osadzanie mikrosetów</td><td>Simport</td><td>M503-2</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A405P-4</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2SQ</td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>General Electric</td><td>ModelJES2051DNBB</td><td></td></tr><tr><td>Klej (etylowy Cyjanoakryl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1505-5G</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia 10 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>probówki 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo odpowiedź na leczenie guzów pierwotnych i/lub związanych z nimi przerzutów w przedklinicznym i klinicznym rozwoju terapii

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Analiza molekularna uznanych linii komórek rakowych była podstawą badań nad rakiem przez ostatnie kilkadziesiąt lat. Hodowla komórkowa zapewnia zarówno bezpośrednią, jak i szybką analizę wrażliwości i oporności terapeutycznej. Jednak najnowsze dowody sugerują, że odpowiedź terapeutyczna nie zależy wyłącznie od nieodłącznego składu molekularnego komórek nowotworowych, ale raczej duży wpływ ma mikrośrodowisko komórek nowotworowych, cecha, której nie można podsumować tradycyjnymi metodami hodowli. Nawet wdrożenie ksenoprzeszczepów nowotworowych, choć dostarcza wielu informacji na temat dostarczania / skuteczności leków, nie jest w stanie uchwycić wzajemnych oddziaływań komórek nowotworowych / mikrośrodowiska (tj. czynników rozpuszczalnych), które występują w ludzkich nowotworach i znacznie wpływają na odpowiedź guza. W tym zakresie opracowaliśmy technikę ex vivo (cięcie świeżych tkanek), która pozwala na bezpośrednią ocenę odpowiedzi na leczenie w celu opracowania terapii przedklinicznych i klinicznych. Technika ta utrzymuje integralność tkanek i architekturę komórkową w kontekście komórki nowotworowej/mikrośrodowiska przez cały czas odpowiedzi na leczenie, zapewniając bardziej precyzyjne środki oceny skuteczności leku.

W niniejszym badaniu zastosowano technikę ex vivo w analizie korelacyjnej wrażliwości/oporności terapeutycznej na inhibitor białka szoku cieplnego 90 (Hsp90i). W ocenie przedklinicznej tego związku Hsp90i, pierwotny guz raka piersi, czyli ER-dodatni inwazyjny rak przewodowy (IDC), oraz towarzyszące mu przerzuty do węzłów chłonnych poddano analizie ex vivo w celu oceny odpowiedzi na leczenie (Rycina 1). Liczne seryjne skrawki o grubości 200 μm traktowano samym nośnikiem...

Uznane linie komórek rakowych i ksenoprzeszczepy były podstawą badań nad rakiem przez ostatnie kilkadziesiąt lat. Jednak najnowsze dowody sugerują, że na odpowiedź terapeutyczną duży wpływ ma mikrośrodowisko komórek nowotworowych. W związku z tym opracowaliśmy analizę ex vivo pierwotnych próbek guzów w celu opracowania leków.

Ex vivo Odpowiedź na leczenie guzów pierwotnych i/lub związanych z nimi przerzutów w przedklinicznym i klinicznym rozwoju terapii

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

Celem poniższej techniki odpowiedzi ex vivo na lek jest wdrożenie jej w przedklinicznym i klinicznym rozwoju leków w celu informowania o skutkach odpowiedzi lub IC 50 poza celem oraz umożliwienia analizy molekularnej mechanizmów oporności i sprzężenia zwrotnego. Osiąga się to poprzez szybkie pozyskanie żywej próbki guza, która jest natychmiast transportowana do laboratorium w celu sekcji. Następnie tkanka jest osadzana w agros, dzielona na sekcje i traktowana lekiem będącym przedmiotem zainteresowania w terapeutycznie odpowiednich dawkach przez różny czas.Na koniec skrawki są usuwane z dołków, pozostawiając wszelkie niereagujące wyrostki guza, a tkanka jest utrwalana formułą i zatapiana w parafinie przed przygotowaniem jednego szkiełka H i e każdego leczonego odcinka. Wyniki wskazują na leczenie farmakologiczne, odpowiedź guza i/lub przerzuty w oparciu o zmiany morfologiczne jąder wskazujące na apoptozę. Oceniane jest IC 50 oznaczanie odpowiedzi na lek, tożsamość efektów off-target oraz analiza molekularna oporności i mechanizmów sprzężenia zwrotnego niereagującego na wzrost guza.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ocena odpowiedzi na lek w ustalonych

ex-vivo-treatment-response-primary-tumors-andor-associated-metastases

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano wydajny protokół ekspansji ex vivo limfocytów T reaktywnych przeciwko nowotworowi, izolowanych z węzłów chłonnych drenujących guz lub innych wtórnych tkanek limfatycznych organizmów z nowotworem. Protokół ten pozwala na selektywną ekspansję swoistych dla nowotworu limfocytów T do zastosowania w adoptywnej immunoterapii raka piersi.

Ex vivo ekspansja limfocytów T reaktywnych przeciwko nowotworowi za pomocą bryostatyny 1/ionomycyny oraz formulacji cytokin wspólnego łańcucha gamma

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Tutaj, monitorowanie metabolizmu komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym, w połączeniu z modelem przerzutów in vivo błony kosmówkowo-omocznikowej (CAM) zarodka kurczaka, są wykorzystywane do oceny nowych celów/środków przeciwnowotworowych pod kątem ich zdolności do uwrażliwiania komórek nowotworowych na chemoterapeutyki uszkadzające DNA.

Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

Opisujemy stosunkowo prostą metodę obrazowania na żywo ex vivo interakcji komórka nowotworowa - zrąb w obrębie przerzutów do płuc, wykorzystując fluorescencyjne reportery u myszy. Wykorzystując mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, technika ta umożliwia wizualizację żywych komórek przez co najmniej 4 godziny i może być dostosowana do badania innych stanów zapalnych płuc.

Ex vivo Obrazowanie na żywo przerzutów do płuc i ich mikrośrodowiska

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) oraz genetycznie modyfikowane modele myszy do przeszczepu wiernie odwzorowują ludzką chorobę i są preferowanymi modelami do podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem piersi. W tym miejscu opisano metodę ortotopowego przeszczepiania fragmentów guza piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka w celu zbadania biologii guza i oceny odpowiedzi na lek.

Ortotopowe przeszczepy guzów piersi jako modele przedkliniczne raka piersi

Ten artykuł opisuje metody generowania, leczenia lekami i analizy eksplantatów pochodzących od pacjentów do oceny reakcji na leki nowotworowe w żywym, istotnym dla pacjenta, przedklinicznym systemie modelowym.

Eksplantaty nowotworów pochodzące od pacjentów jako "żywa" platforma przedkliniczna do przewidywania oporności na leki u pacjentów

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Poznaj technikę ex vivo do oceny odpowiedzi na leczenie guzów pierwotnych i przerzutów w kontekście mikrośrodowiska nowotworowego. Metoda umożliwia precyzyjną analizę skuteczności terapii, mechanizmów oporności i efektów ubocznych, wspierając rozwój leków w badaniach przedklinicznych i klinicznych.

Ex vivo Odpowiedź na leczenie guzów pierwotnych i/lub związanych z nimi przerzutów w przedklinicznym i klinicznym rozwoju terapii (Wideo) | JoVE Journal

Ex vivo Odpowiedź na leczenie guzów pierwotnych i/lub związanych z nimi przerzutów w przedklinicznym i klinicznym rozwoju terapii

Przeglądaj więcej filmów