Model uszkodzenia rdzenia kręgowego indukowany laserem ex vivo do oceny mechanizmów zwyrodnienia aksonów w czasie rzeczywistym
25 listopada 2014
Prezentujemy protokół wykorzystujący mikroskopię poklatkową z wzbudzeniem dwufotonowym do jednoczesnej wizualizacji dynamiki uszkodzeń aksonów i mielin w czasie rzeczywistym. Ten proponowany protokół pozwala na badanie zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych czynników, które mogą wpływać na los centralnego mielinizowanego aksonu po urazie i przyczyniać się do trwałej niepełnosprawności klinicznej.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena mechanizmów ostrej degeneracji aksonów w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez izolację jednej tkanki nerwowej i rdzenia kręgowego YFP dodatniej w udzie, przy jednoczesnym ciągłym perfuzji tkanki z natlenionym, sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym o niskiej zawartości wapnia. Następnie tkanka rdzenia kręgowego jest wyrównywana pod obiektywem mikroskopu dwufotonowego przy zachowaniu warunków fizjologicznych, a mielina jest barwiona lipofilowym barwnikiem fluorescencyjnym czerwienią nilową.
Następnie na grzbietowej powierzchni kolumny grzbietowej tworzy się zmianę o wielkości mikros poprzez regulację mocy lasera w celu transekcji mielinizowanych aksonów w obrębie kolumn. Wyniki pokazują retrakcję uszkodzonych aksonów, okołoaksonalny, obrzęk mieliny i inne odpowiedzi komórkowe na podstawie ilościowych pomiarów obrazów. Tak więc główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że wykorzystujemy cały rdzeń kręgowy w odcinku szyjnym, a zatem włókna kolumny grzbietowej pozostają nienaruszone.
W ten sposób unika się uszkodzenia leżących pod spodem centralnych włókien mielinizowanych, co często występuje podczas przygotowywania pasków istoty białej. Zademonstruje tę procedurę dr Starlin ada, doktor habilitowany w moim laboratorium, który naprawdę był mistrzem tej techniki, aby przygotować się do perfuzji wewnątrzsercowej. Wykonaj sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy o niskiej zawartości wapnia lub płyn mózgowo-rdzeniowy z dwukrotnie stężonymi roztworami BNC do obfitości rdzenia kręgowego ex vivo.
Podczas obrazowania należy przygotować normalny płyn mózgowo-rdzeniowy A z dwukrotnymi roztworami podstawowymi A i B w szklanej butelce. Podawaj te roztwory do pH 7,4. Utrzymuj płyn mózgowo-rdzeniowy o niskiej zawartości wapnia A w chłodzie w pobliżu obszaru rozwarstwiania i utrzymuj normalny płyn mózgowo-rdzeniowy A w temperaturze pokojowej w pobliżu mikroskopu.
Oba roztwory należy myć samochodem i gazem przez pół godziny przed użyciem i w sposób ciągły bąbelkować podczas użytkowania. Następnie przygotuj otwartą komorę perfuzyjną kąpieli do obrazowania. Najpierw podłącz metalowe wyjście grzałek liniowych do komory.
Następnie przyklej komorę obrazowania do komory rozlania dużą ilością lepkiego materiału, tak aby istniała możliwość nieznacznego dostosowania położenia komory obrazowania. Zamocuj sondę temperatury sprzężenia zwrotnego grzałek liniowych w pobliżu wlotu płynu i przymocuj rurkę ssącą ze stali nierdzewnej do przewodu próżniowego na wylocie komory. Teraz włącz pompę próżniową i pompę perfuzyjną.
Gdy komora wypełni się płynem mózgowo-rdzeniowym, zmniejsz pompę do 1.5 do dwóch mililitrów na minutę. Następnie kontroluj objętość A CF w komorze za pomocą położenia przewodu próżniowego. Aby dostosować eutanazję sześcio- do 10-tygodniowego TH, jedną transgeniczną mysz YFP.
Najpierw upewnij się, że nie ma odruchowej reakcji na szczypanie palców. Następnie ogol obszar obejmujący rdzeń kręgowy i mózg. Po goleniu przetrzyj odsłoniętą skórę betadiną i 70% etanolem.
Teraz spryskaj klatkę piersiową i okolice brzucha 70% etanolem i przelej zwierzę trans Cardi za pomocą bąbelkowego płynu mózgowo-rdzeniowego o niskiej zawartości wapnia A. Kiedy wątroba zacznie blednąć, przymocuj igłę perfuzyjną do serca za pomocą klipsa. Następnie odwróć zwierzę i przetrzyj stronę skóry grzbietowej 70% etanolem.
Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej od nosa do biodra, aby odsłonić czapkę czaszki i tkankę powyżej kręgów. Użyj szpilek, aby odciągnąć skórę i zabezpieczyć zwierzę przy nosie i haun. Teraz przenieś preparat do mikroskopu preparacyjnego z nożyczkami mocno naciętymi w poprzek grzbietowej powierzchni czaszki na poziomie opuszki węchowej.
Włóż końcówkę nożyczek do nowo wykonanego nacięcia i przeciąć wzdłuż obu krawędzi czapki czaszki, aby odsłonić móżdżek. Nie wycinaj całkowicie czapki czaszki. Podnieś czapkę czaszki odsłaniającą mózg i ostrożnie odetnij lewą i prawą krawędź kości międzyciemieniowej nad móżdżkiem.
Teraz, delikatnie pociągając za pokrywę czaszki i powierzchnię grzbietowego kręgosłupa, wykonaj nacięcia tuż poniżej tylnych korzeni nerwowych, aby jeszcze bardziej odsłonić rdzeń kręgowy. Następnie za pomocą nożyczek z cienką końcówką ostrożnie przetnij kręgi obustronnie. Pod kątem 45 stopni ważne jest, aby uniknąć uszkodzenia kolumn grzbietowych.
Te jasne białe włókna łatwo ulegają uszkodzeniu bez zachowania ostrożności, kontynuując delikatne odciąganie wyciętej kości i mięśni podczas przecinania kręgów. Wytnij od jednego do dwóch centymetrów, aby wyizolować segment tkanki rdzenia kręgowego szyjki macicy odpowiedni do obrazowania. Następnie za pomocą nożyczek przeciąć tkankę i kość równolegle do kręgosłupa.
Oczyść również tkankę znajdującą się pod kolumną. Wykonaj te cięcia tak poziomo, jak to możliwe, ponieważ bardzo ważne jest, aby tkanka leżała płasko na poziomie komory do obrazowania. Na koniec użyj skalpela numer 11, aby przeciąć pień mózgu poza zakończeniem włókien trawy ulu i na górnym poziomie klatki piersiowej.
Następnie użyj nożyczek, aby przeciąć tkankę i kość w tych dwóch punktach. Wyizolowana tkanka powinna zawierać dwie trzecie kręgosłupa obejmującego rdzeń rdzeniowy pnia mózgu, powiększenie szyjki macicy i górną część rdzenia kręgowego w odcinku piersiowym. Przenieś izolowany kręgosłup do komory obrazowania ex vivo i stopniowo zwiększaj temperaturę perfuzji do 36 do 37 stopni Celsjusza w ciągu następnej godziny.
Utrzymuj tę temperaturę podczas obrazowania. Jednym z krytycznych aspektów tego protokołu jest zapewnienie izolacji rdzenia kręgowego bez uszkadzania włókien kolumny grzbietowej. Drugim najbardziej krytycznym aspektem tego protokołu jest zapewnienie, że rdzeń kręgowy jest stale perfundowany natlenionym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym.
Za pomocą zmodyfikowanego uchwytu na szkiełko tkankowe ostrożnie zabezpiecz kręgosłup w komorze. Ważne jest, aby unikać dotykania odsłoniętego rdzenia kręgowego, kolumn grzbietowych lub wywierania na nie nacisku za pomocą nici podobnych gwintów. Teraz, aby zabarwić mielinę, na krótko zatrzymaj przepływ roztworu i usuń przewód próżniowy.
Dodaj pięć do 10 mikrolitrów pięciomilimolowego czerwonego barwnika nilowego w pobliżu końca rdzenia kręgowego. Następnie delikatnie wymieszaj roztwór w całej komorze obrazowania i pozwól tkance inkubować przez minutę lub dwie. Po zabarwieniu przywróć przepływ natlenionego A CSF do poziomu od 1,5 do dwóch mililitrów na minutę i wymień przewód próżniowy za pomocą dwóch mikroskopów fotograficznych.
Zobrazuj rdzeń kręgowy za pomocą obiektywu do zanurzenia w wodzie. Powoli opuść obiektyw do powierzchni płynu mózgowo-rdzeniowego A, a następnie ustaw ostrość rdzenia kręgowego w świetle fluorescencyjnym AF. Teraz przełącz się na tryb skanowania, aby uzyskać obrazowanie linii bazowej wznoszącej się trawy.
Włókna mielinizowane Oculus. Aby wzbudzić YFP i czerwień nilową, ustaw wzbudzenie na 950 nanometrów i wyizoluj emisje fluorescencyjne za pomocą filtrów przewlekłych DI i filtrów przepustowych. Jeśli w ciągu godziny od obrazowania zauważysz, że ponad 3% aksonów ma sterydy, oznacza to, że rdzeń kręgowy został uszkodzony podczas izolacji.
Teraz najlepiej wyrzucić preparat Aby uszkodzić tkankę za pomocą lasera. Najpierw zlokalizuj obszar tkanki, który wydaje się być równy. Następnie zwiększ powiększenie obszaru oglądania do 30,3 x.
Dostrój laser do 800 nanometrów i zwiększ jego moc do około 110 miliwatów. Teraz wykonaj pięć skanów laserowych pola widzenia. Wynikiem powinna być pełna ablacja o średnicy 20 mikronów.
Sprawdź uraz przy standardowych ustawieniach obrazowania za pomocą lasera o mocy 17 miliwatów i powiększeniu 20,08x. Jeśli włókna aksonalne podczas ablacji nie są całkowicie przecięte, należy wyrzucić preparat. Teraz użyj ustawień poklatkowych z ujęciami Z, aby tworzyć dynamiczne nagrania reakcji na kontuzje.
Preparat można obrazować przez okres do 24 godzin. Odcinek rdzenia kręgowego wyizolowano i ustawiono zgodnie z opisem na początku badania T-P-L-S-M. Nagranie pokazuje mielinizowane trawy stawowe Saksonów jako równolegle ustawione aksony dodatnie YFP w pochewce, dinarnej czerwonej mielinie z kilkoma steroidami aksonalnymi lub innymi morfologicznymi objawami zwyrodnienia aksonów.
Można dostrzec drobne szczegóły, takie jak nos ROM VA podświetlony grotami strzałek. 40 minut później po indukowanym laserowo urazie rdzenia kręgowego. Większość przeciętych aksonów tworzy charakterystyczne aksonalne opuszki końcowe i wycofuje się z miejsca urazu, aksony sąsiadujące z miejscem urazu ulegają wtórnemu zwyrodnieniu, a obrzęk aksonów staje się bardziej widoczny.
W przeciwieństwie do cofających się co kwartał włókien, większość cofających się aksonalnych opuszków końcowych położonych dystalnie od zmiany i sterydów była silnie oznaczona czerwienią nilową, co sugeruje zmianę środowiska w obrębie aksonu. Po siedmiu godzinach aksony nadal wycofywały się z miejsca uszkodzenia. Jest to jednak bardziej widoczne w opuszkach końcowych położonych dystalnie lub rostralnie od zmiany niż w opuszkach końcowych położonych proksymalnie lub sercowo do zmiany.
Ostatecznie aksony, które początkowo zostały oszczędzone, stopniowo ulegały opóźnionej wtórnej degeneracji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak odizolować nerw i rdzeń kręgowy oraz wykonać laserowe uszkodzenie rdzenia kręgowego. Dzięki temu będziesz mógł badać dynamiczne aspekty zarówno pierwotnego, jak i wtórnego zwyrodnienia aksonów w czasie rzeczywistym.
Informacje uzyskane dzięki zastosowaniu tego systemu modelowego mogą prowadzić do ważnego zrozumienia mechanistycznego uszkodzeń zarówno aksonów, jak i mieliny po urazie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół wykorzystujący mikroskopię czasu rzeczywistego z dwufotonową ekscytacją do wizualizacji uszkodzeń aksonów i mieliny w czasie rzeczywistym. Metoda ta umożliwia ocenę czynników wewnętrznych i zewnętrznych wpływających na losy zmielinowanych aksonów po urazie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Mikroskopia
- Degeneracja aksonalna
Wstęp
- Zrozumienie mechanizmów degeneracji aksonalnej jest kluczowe dla przeciwdziałania niepełnosprawności klinicznej.
- Mikroskopia dwufotonowa zapewnia unikalne podejście do badania tej dynamiki.
- Wizualizacja w czasie rzeczywistym może pogłębić nasze rozumienie odpowiedzi na uraz.
- Rola mieliny w zachowaniu zdrowia aksonów jest istotna w kontekście urazów.
Cel badania
- Ocena mechanizmów ostrej degeneracji aksonalnej w czasie rzeczywistym.
- Wizualizacja dynamiki uszkodzeń aksonów i mieliny.
- Badanie czynników wpływających na losy aksonów po urazie.
Zastosowane metody
- Izolacja tkanek nerwowych i rdzenia kręgowego wykazujących dodatnią ekspresję YFP.
- Perfuzja natlenionym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym o niskiej zawartości wapnia.
- Ustawienie tkanki rdzenia kręgowego pod mikroskopem dwufotonowym.
- Barwienie mieliny barwnikiem Nile red.
Główne wyniki
- Obserwacja retrakcji uszkodzonych aksonów.
- Wykrywanie obrzęku mieliny okołoaksonalnej.
- Ilościowe pomiary odpowiedzi komórkowych.
- Zachowanie włókien słupów tylnych podczas eksperymentu.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia kompleksowe badanie dynamiki uszkodzeń aksonalnych.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym pozwala na poznanie odpowiedzi komórkowych na uszkodzenie.
- Metoda ta posiada przewagę nad istniejącymi technikami dzięki zachowaniu integralności tkanki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten model ex vivo urazu rdzenia kręgowego umożliwia wizualizację mechanizmów degeneracji aksonalnej w czasie rzeczywistym, zapewniając kontrolowany system do analizy pierwotnych i wtórnych szlaków uszkodzenia. Dzięki zachowaniu integralności sznurów tylnych oraz możliwości precyzyjnej manipulacji środowiskowej, model ten wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego podczas walidacji celów neuroterapeutycznych. Podejście to posiada wartość prognostyczną w badaniach przesiewowych związków modulujących retrakcję aksonów, integralność mieliny lub procesy degeneracji wtórnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez rozróżnienie pierwotnego przerwania aksonu od mechanizmów degeneracji wtórnej w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną platformę do walidacji celów funkcjonalnych z wykorzystaniem ilościowego obrazowania retrakcji aksonalnej i obrzęku mieliny.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych poprzez identyfikację związków, które opóźniają tworzenie się końcówek aksonalnych lub redukują degenerację okołoaksonalną.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Generuje zestandaryzowane, mierzalne odczyty integralności aksonalnej i dynamiki mieliny na potrzeby kampanii przesiewowych związków chemicznych.
- Powtarzalność: Kontrolowane uszkodzenie laserowe oraz system perfuzji zapewniają spójne parametry zmiany w powtórzeniach.
- Skalowalność: Zgodność z obrazowaniem time-lapse i perfuzją farmakologiczną umożliwia mechanistyczne badania przesiewowe o średniej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modeluje klinicznie istotne patologie aksonalne, w tym tworzenie się sferoidów, retrakcję oraz degenerację mieliny obserwowane w urazach rdzenia kręgowego.
- Ciągłość translacyjna: Łączy mechanizmy odkrywcze z walidacją przedkliniczną, umożliwiając ocenę kandydatów neuroprotekcyjnych lub remielinizujących w czasie rzeczywistym.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Wspiera kryteria go/no-go w oparciu o hamowanie wtórnej degeneracji aksonalnej lub zachowanie integralności mieliny.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności, w szczególności w odniesieniu do strategii neuroprotekcyjnych i oszczędzających aksony.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków degeneracji aksonalnej oraz wyjaśnianie mechanizmów odpowiedzi na urazy.
- Przesiewanie: Umożliwia opracowanie testów z ilościowymi punktami końcowymi, takimi jak prędkość retrakcji aksonów i utrata integralności mieliny.
- Analityka: Dostarcza danych z obrazowania wysokotreściowego do statystycznego porównania efektów terapii w zakresie dynamiki aksonów i mieliny.
- Badania translacyjne: Łączy ostre reakcje aksonalne z procesami opóźnionej degeneracji istotnymi dla przewlekłej neurodegeneracji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę obrazowania dla wielu programów neuroterapeutycznych ukierunkowanych na stabilność aksonalną.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelach uszkodzeń aksonalnych poprzez oddzielenie pierwotnych zdarzeń degeneracyjnych od wtórnych.
- Wartość operacyjna: Zstandaryzowany protokół perfuzji i indukowania uszkodzeń zapewnia powtarzalność wyników pomiędzy laboratoriami oraz różnymi punktami czasowymi.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając wczesnych, opartych na mechanizmach sygnałów dotyczących skuteczności ochrony aksonów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, wykazując ich zdolność do ochrony przed retrakcją aksonalną lub uszkodzeniem mieliny w czasie rzeczywistym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Do pomyślnej implementacji wymagane jest doświadczenie w zakresie mikroskopii dwufotonowej oraz obrazowania żywych tkanek.
- Instrumentacja obejmuje laser z regulowaną długością fali, obiektyw imersyjny wodny oraz system perfuzyjny zdolny do utrzymania temperatury fizjologicznej i przepływu.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w odniesieniu do parametrów urazu, protokołów barwienia barwnikami oraz potoków ilościowej analizy obrazu.
- Adaptacja do modeli chorobowych wymaga walidacji reporterów transgenicznych oraz istotności urazu w konkretnych kontekstach patofizjologicznych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują 24-godzinne okno obrazowania oraz konieczność utrzymania żywotności tkanki ex vivo przez cały czas trwania eksperymentów.
