Hodowla i kokultura jajników myszy i pęcherzyków jajnikowych

Ogólnym celem tej procedury jest wyhodowanie jajników noworodków i/lub pojedynczych pęcherzyków jajnikowych in vitro. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie jajników od zimnych samic w odpowiednim wieku. Drugim krokiem jest przygotowanie tkanki, w tym dokładne rozwarstwienie poszczególnych pęcherzyków jajnikowych za pomocą igieł do akupunktury.

Następnie jajniki noworodków lub pojedyncze pęcherzyki przedantralne są hodowane przy regularnym karmieniu, a ostatnim krokiem jest utrwalenie lub zamrożenie tkanki do analizy histologicznej lub molekularnej. Ostatecznie system hodowli wspomaga rozwój w wysoce fizjologiczny sposób i może być wykorzystany do badania regulacji rozwoju pęcherzyków jajnikowych oraz do badania interakcji między pierwotnymi i rosnącymi pęcherzykami jajnikowymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że nienaruszone pęcherzyki jajnikowe są wspierane przez rozwój pęcherzyków, zachowując ich trójwymiarową strukturę bez konieczności stosowania matryc podporowych.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii jajników, a także pomóc w badaniu wpływu toksycznych związków, takich jak chemioterapia, leki, na jajnik, a tym samym na płodność kobiet. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł wspólnej hodowli w różnym wieku, a tym samym etapach pęcherzyków jajnikowych, omawiając sposób badania wpływu rosnących pęcherzyków na spoczynkową pulę pierwotnych pęcherzyków, Demonstrując technikę wraz ze Steph Morgan i Lisą Campbell Vivian Allison, technik z laboratorium i Allison Murray, która przez wiele lat była naukowcem z tytułem doktora w laboratorium. Obaj pomogli opracować kluczowe aspekty techniki: wyciąganie pipet do tego protokołu.

Podgrzej i zegnij szklane pipety nad płomieniem i wykonaj czyste cięcie za pomocą noża do szkła. Następnie sterylizuj zakrzywione szkło w temperaturze 160 stopni Celsjusza przez około 45 minut. Potrzeba praktyki, aby uzyskać odpowiednią krzywą pipety dla swojej techniki.

Zawsze tnij pipetę nożem do szkła, aby nie było postrzępionego szkła. Chcesz również upewnić się, że masz końcówkę o odpowiedniej średnicy dla swojej tkanki Zbudowany do sterylizacji podłoża preparacyjnego wykonanego z pożywki lebowitz L 15 z BSA przez filtr 0,2 mikrona. To 25 milimetrów średnicy zbudowanej w celu sterylizacji kultury jajników noworodka.

Medium przepuszcza się przez kolejne 0,2 mikrona, filtruje o średnicy zaledwie 25 milimetrów i zbiera do sterylnej probówki. Następnie dodaj jeden mililitr pożywki dla noworodków do każdej studzienki 24. Dobrze płytkować i przenieść membranę na powierzchnię pożywki w każdym dołku.

Pożywka do hodowli pęcherzyków jest również sterylizowana filtrem, podobnie jak pożywka do hodowli jajników. Następnie olej silikonowy musi być również wysterylizowany filtrem. Następnie napraw 96-dołkowe płytki hodowlane za pomocą 30 mikrolitrowych kropli pożywki pęcherzykowej wzdłuż górnego rzędu.

Ostrożnie pokryj te studzienki 70 mikrolitrami oleju silikonowego. Alternatywnie, kohodowla mieszków włosowych wymaga 100 mikrolitrów pożywki z nakładką 100 mikrolitrów oleju silikonowego. Następnie przygotuj płytki do kohodowli jajników pęcherzyków z jednym mililitrem pożywki na studzienkę i bardzo starannie umieszczoną wysterylizowaną promieniami UV błoną jądrową po.

Zacznij od przeniesienia jednego mililitra pożywki preparacyjnej do każdej sterylnej szklanej naczynia na zarodki. Po pokolorowaniu szczeniąt jednodniowych w wieku od zera do pięciu po urodzeniu, chwyć skórę pokrywającą ścianę brzucha cienkimi kleszczami i naciąć skórę i ścianę ciała. Otwórz to duże nacięcie odsłaniające brzuch.

Pęcherz moczowy jest zwykle obrzęknięty na tym etapie i można go przebić, aby ułatwić rozwarstwienie. Za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich odsuń wnętrzności na bok. Następnie po obu stronach podążaj za rogami macicy od pęcherza moczowego do nerki.

Jajnik jest strukturą przypominającą chmurę znajdującą się tuż pod nerką w górnej części macicy. Chwyć jajnik delikatnie i nożyczkami. Odetnij go od macicy.

Po wypreparowaniu obu jajników przenieś je do naczyń wypełnionych ciepłą sekcją. Średni. Użyj mikroskopu preparacyjnego ze stolikiem podgrzanym do 37 stopni Celsjusza, aby wypreparować jajniki za pomocą igieł insulinowych. Odetnij worek podstawowy i nadmiar materiału, w tym jajowód, aż pozostanie tylko jajnik.

Następnie przenieś każdy jajnik do dołka przygotowanej płytki za pomocą zakrzywionej pipety. Umieść jeden jajnik na każdej pożywce w kosie, tkanka zmienia połowę pożywki co drugi dzień przez okres do sześciu dni podczas zmiany pożywki Umieść końcówkę pipety na krawędzi dołka pożywki, aby uniknąć naruszenia błony. Po hodowli jajniki mogą być przechowywane zamrożone lub utrwalone lub histologiczne lub immunochemiczne.

Po pobraniu jajników od starszych myszy do naczynia z ciepłym podłożem preparacyjnym, usuń jajnik Basa. Użyj igieł insulinowych, aby przyciąć worek podstawowy i nadmiar materiału, w tym jajowód, aż pozostanie tylko jajnik. Następnie przetnij jajniki na pół za pomocą igieł i ostrożnie przenieś każdą połówkę do indywidualnego szkła zegarka zawierającego jeden mililitr pożywki preparucyjnej.

Przykryj szkiełka zegarkowe szkiełkiem podstawowym i przechowuj je w piekarniku do godziny tak szybko, jak to możliwe. Pracując pod mikroskopem z podgrzewaną sceną w okapie z przepływem blaszki, rozetnij jajniki na duże kawałki za pomocą igieł insulinowych, aby zidentyfikować późne pęcherzyki przedantalne. Pęcherzyki przedantalne zawierają od dwóch do trzech warstw komórek ziarnistości i mają średnicę około 180 do 200 mikrometrów.

Wypreparuj którykolwiek z nich za pomocą wbudowanej igły i igły do akupunktury zabezpieczonej uchwytem na igłę, unikaj uszkodzenia blaszki podstawnej, ale pamiętaj, aby usunąć otaczający zrąb S. To wymaga praktyki. Mieszek włosowy potrzebuje trochę tkanki kałowej, ale nie za dużo.

Ponadto, jeśli proces rozwarstwiania jest zbyt szorstki, mieszek włosowy ulega uszkodzeniu i albo pęka, albo umiera. Podczas hodowli Użytkownik przygotował perpe do ostrożnego przeniesienia mieszków włosowych do nowego szkła zegarkowego wypełnionego podłożem. Utrzymuj mieszki włosowe w cienkiej części ciała za pomocą skalibrowanego okularu zamontowanego na mikroskopie preparacyjnym.

Zmierz mieszki włosowe. Jeśli znajdują się w odległości 10 mikrometrów od średnicy 190 mikrometrów. Można je wykorzystać do hodowli, wyrzucić pozostałe mieszki włosowe z wybranych pęcherzyków.

Wybieraj tylko najzdrowsze do hodowli. Powinny być półprzezroczyste, bez ciemniejszych obszarów retycznych, mieć nienaruszoną laminarną podstawę i trochę przyczepionej tkanki oponowej. Dobry plon to od 10 do 15 pęcherzyków na jajnik.

Teraz, używając przygotowanej zakrzywionej perpy, przenieś te pęcherzyki na przygotowaną 96-dołkową płytkę hodowlaną. Umieść jeden pęcherzyk w każdym dołku poniżej warstwy oleju i kultury. Mieszki włosowe są do sześciu dni każdego dnia.

Przygotuj nowy wiersz z nośnikiem. Godzinę lub więcej później przenieś mieszki włosowe do następnego rzędu świeżych zrównoważonych pożywek lub kultur współkultur mieszków mieszkowych dwóch pęcherzyków obok siebie w jednym. Cóż, zamiast transferów, użyj cienkiej końcówki żelowej, aby zmieniać połowę podłoża co drugi dzień.

W przypadku jajnika pęcherzykowego kokultury przenoszą pęcherzyk do jajnika noworodka umieszczonego na błonie na płytce hodowlanej, ostrożnie umieść pęcherzyk obok jednego bieguna jajnika noworodka, aby można je było następnie przesunąć w kontakt ze sobą. Utrzymuj tę kulturę przez maksymalnie pięć dni. Wymiana 500 mikrolitrów pożywki co drugi dzień.

Pęcherzyki przedantalne często zostają otoczone przez jajniki noworodków. Podczas tej hodowli jajniki noworodków były hodowane przez sześć dni i wystawione na działanie toksycznych substancji reprodukcyjnych. W drugim dniu hodowli tkanki zostały przetworzone w celu określenia liczby i stanu zdrowia różnych etapów pęcherzyków.

Jednym z badanych substancji toksycznych była cisplatyna. Innym badanym substancją toksyczną była doksorubicyna. W innym eksperymencie badano wpływ gonadotropiny, hormonu folikulotropowego i hormonu luteinizującego na wzrost pojedynczych pęcherzyków.

Ale ta analiza wielkości pęcherzyków była okresowo mierzona, aby zmapować ich wzrost. Zbadano kokulturę pęcherzyków pęcherzykowych przy użyciu GFP wyrażającego pęcherzyk i procesów pęcherzykowych typu dzikiego rozciągających się od jednego do drugiego. Przetwarzanie immunohistochemiczne tej kokultury ujawniło, że procesy GFP leżą w dzikich typach.

Warstwa tekalna, jajniki noworodków typu dzikiego były również współhodowlane z pęcherzykiem wyrażającym GFP. W tym scenariuszu procesy GFP migrowały przez śródmiąższowość jajnika. Posiew jajników noworodka jest dość prostą metodą, ale spodziewaj się, że poświęcisz trochę czasu na opanowanie techniki wycinania nieuszkodzonych nienaruszonych pęcherzyków przed-antralnych.

Jest to niezbędne do ich prawidłowego rozwoju. Po hodowli pęcherzyków jajnikowych oocyty mogą być zapłodnione przez zapłodnienie in vitro, po czym zarodki mogą zostać przeniesione do pseudociężarnych samic i żywych uzyskanych młodych.