Name: In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Poznaj metodę obrazowania aktywności neuronów i gleju jelitowego układu nerwowego w preparatach całych jelit przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Fundacji Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) (dla B. Gulbransena), National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women's Health) grant K12 HD065879 (B. Gulbransen) oraz fundusze start-up z Michigan State University (B. Gulbransen).

UWAGA: Następujące procedury z wykorzystaniem tkanek pochodzących od zwierząt laboratoryjnych są zgodne z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt 2013 i zostały wcześniej zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Stanowego Michigan.
1. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Znieczulenie zwierzęcia badawczego w komorze zawierającej 2,5% izofluranu w tlenie lub poprzez umieszczenie 3-5 ml ciekłego izofluranu na materiale chłonnym na podłodze komory, upewniając się, że fizyczna bariera zapobiega bezpośredniemu kontaktowi zwierząt z izofluranem. Sprawdź głębokość znieczulenia, ściskając podnóżek. 
	UWAGA: Głębokość znieczulenia jest uważana za odpowiednią, gdy nie ma odruchu wycofania kończyny tylnej. Po odpowiednim znieczuleniu należy poddać mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy</li>
	<li>Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i oczyść skórę brzucha 70% etanolem. Użyj kleszczy, aby uszczypnąć skórę brzucha w linii środkowej i użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać 6-centymetrowe nacięcie przyśrodkowe wzdłuż kresy białej, aby odsłonić wewnętrzne narządy trawienne.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby zlokalizować i odsłonić jelito kręte wewnątrz otrzewnej. Przetnij krezkę jelita krętego/okrężnicy nożyczkami i zacznij rozplątywać jelito.</li>
	<li>Gdy długość jelita zostanie odpowiednio rozplątana, przeciąć jelito dystalnie do żołądka i proksymalnie do jelita ślepego w celu przygotowania jelita krętego. W celu przygotowania jelita grubego należy przeciąć okrężnicę dystalnie do jelita ślepego i proksymalnie do odbytnicy.</li>
	<li>Szybko usunąć odcinek jelita i umieścić go w zlewce z pożywką DMEM/F12 uzupełnioną 3 μM chlorowodorkiem nikardypiny i 1 μM chlorowodorkiem skopolaminy (zwanymi dalej "pożywką") na lodzie. Dodatek tych inhibitorów ułatwia mikrodysekcję i późniejsze obrazowanie poprzez paraliż mięśni gładkich jelit.</li>
	<li>Wytnij interesujący Cię segment (np. jelito czcze, jelito kręte, dystalną lub proksymalną okrężnicę) na podstawie ustalonych markerów anatomicznych. Zazwyczaj wykorzystuje się tkankę z dystalnego odcinka jelita krętego lub dystalnej okrężnicy. Należy jednak użyć tej samej podstawowej procedury, aby wyizolować, załadować i zobrazować neurony mięśniowo-jelitowe i glej we wszystkich regionach jelitowych.</li>
	<li>Usuń mały segment (4-6 cm) pożądanego odcinka jelita i umieść na szalce Petriego pokrytej Sylgardem wypełnionej schłodzonym podłożem.</li>
	<li>Zabezpiecz proksymalne i dystalne końce odcinka jelitowego za pomocą szpilek przeciw owadom i otwórz rurkę jelitową, wykonując proste, wzdłużne cięcie wzdłuż granicy krezki.</li>
	<li>Przypnij tkankę płasko pod lekkim napięciem błoną śluzową do góry i ostrożnie wypreparuj warstwę błony śluzowej za pomocą cienkich kleszczyków (najlepiej sprawdzają się #5 i #5/45) i bardzo cienkich nożyczek sprężynowych. 
	UWAGA: Usunięcie błony śluzowej może być dość traumatyczne dla ENS, jeśli nie zostanie wykonane prawidłowo. W przypadku preparatów wysokiej jakości należy pamiętać o ograniczeniu nagłego usuwania błony śluzowej przez złuszczanie lub skrobanie. Najlepszą praktyką jest uniesienie błony śluzowej i przecięcie pod spodem cienkimi nożyczkami.</li>
	<li>Pokrój tkankę na mniejsze preparaty (około 0,5cm2) i włóż do naczyń obrazowych (4 rogi z okrężną warstwą mięśni skierowaną do góry) umieszczonych na lodzie ze świeżą pożywką.</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj mięsień okrężny, rozsuwając go drobną pęsetą, aby odsłonić splot mięśniowo-jelitowy. Unikaj nadmiernego rozciągania.</li>
	<li>Umieść naczynie do obrazowania z powrotem na lodzie i zmień roztwór na świeże podłoże.</li>
	<li>Przygotuj 2 ml mieszanki enzymów na naczynie [Dżupa 1 j./ml (4,48 mg/8 ml), kolagenaza typu II 150 j./ml (5,45 mg/8 ml) w pożywce].</li>
	<li>Wyjmij naczynia z lodu i dodaj mieszankę enzymów z kroku 1.13.</li>
	<li>Inkubować naczynia w temperaturze pokojowej przez 15 minut z 5% CO2 / 95% powietrzem.</li>
	<li>Umyj preparaty chusteczek higienicznych pożywką 3 razy i ponownie przypnij rogi.</li>
</ol>
2. Ładowanie barwnika Fluo-4
UWAGA: Unikaj fotowybielania, pracując przy ograniczonym oświetleniu podczas pracy z barwnikami fluorescencyjnymi i tkankami wypełnionymi barwnikami wskaźnikowymi.
<ol>
	<li>Przygotować 4 μM roztwór ładujący Fluo-4.
	<ol>
		<li>Dodać 1,5 ml pożywki i 1,2 μl 250 mM wywaru probenecydowego do 1,5 μl podwielokrotności 4 mM bulionu Fluo-4. 4 mM bulionu Fluo-4 przygotowuje się przez dodanie 11,4 μl pluronu F-127 (20% w DMSO; uzupełniony 0,25% kremafor-EL) do 50 μg Fluo-4, AM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparaty do inkubacji w roztworze ładującym Fluo-4 należy inkubować przez 45 minut w ciemnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wyjąć z inkubatora i przemyć preparaty pożywką 3 razy.</li>
	<li>Zamianę pożywki na pożywki zawierające 200 μM probenecydu i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C przed obrazowaniem. 
	UWAGA: Probenecyd jest lekiem, który hamuje transportery oporności wielolekowej w neuronach. Dodanie tego leku hamuje zdolność neuronów do wytłaczania barwników i zwiększa znakowanie neuronów. Ładowanie masowe barwników wskaźnikowych Ca2+ przy braku probenecydu powoduje głównie obciążenie komórek glejowych. Dodatek probenecydu pozwala na wizualizację odpowiedzi neuronalnych i glejowych.</li>
	<li>Przygotuj zmodyfikowany bufor Krebsa.
	<ol>
		<li>Sporządzić zmodyfikowany bufor Krebsa w taki sposób, aby końcowe stężenia (w mM) składników były następujące: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgCl2, 1,2 NaH2PO4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO3, 1 kwas pirogronowy i 8 glukozy (pH dostosowane do 7,4 z NaOH). Dodaj 3 μM nikardypiny i 1 μM skopolaminy, aby zahamować skurcze mięśni podczas obrazowania Ca2+ i rozwarstwiania całego mocowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie i analiza
UWAGA: Użyj przynajmniej podstawowego urządzenia do obrazowania z fluorescencyjnym źródłem światła, mikroskopem, wysokiej jakości kamerą CCD i odpowiednim oprogramowaniem do akwizycji. Różnicuj dodawanie innych składników w zależności od źródła światła i konkretnego zastosowania. Koło filtrowe i przesłona muszą być używane z tradycyjnym ksenonowym źródłem światła łukowego. Jednak źródła światła LED i systemy oświetleniowe nie wymagają tych komponentów.
<ol>
	<li>Umieścić komorę rejestracyjną pod mikroskopem i za pomocą systemu perfuzji grawitacyjnej z wieloma podgrzewanymi zbiornikami strzykawkowymi ustalić ciągłą szybkość perfuzji 2–3 ml/min buforu Krebsa o temperaturze 37 °C. Upewnij się, że nie dopuścić do tworzenia się pęcherzyków powietrza zarówno w przewodzie wejściowym, jak i ssawnym podłączonym do odwadniacza.</li>
	<li>Ustaw ostrość żądanego splotu w jasnym oświetleniu pola. Unikaj prześwietlania tkanki, co może prowadzić do wybielania zdjęć.</li>
	<li>Zbadaj obciążenie Fluo-4 w zwojach i wybierz zdrowe zwoje do obrazowania. Niezdrowe/uszkodzone zwoje będą wykazywać morfologię autofluorescencji lub punktową i nie powinny być używane do obrazowania.</li>
	<li>Po wybraniu ganglionu przekieruj ścieżkę światła do kamery i uzyskaj obraz na żywo za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu. Upewnij się, że ganglion jest ostry i ustaw szybkość akwizycji obrazu oraz czasy ekspozycji. 
	UWAGA: Szybkość i czas pozyskiwania obrazów będą się różnić w zależności od zdarzeń, które badacze chcą rejestrować. W przypadku większości eksperymentów obrazy są tradycyjnie uzyskiwane przy 0,5-1 Hz dla komórek glejowych i do 2-10 Hz dla neuronów, ponieważ odpowiedzi glejowe Ca2 + nie są tak szybkie, jak stany przejściowe Ca2 + w neuronach.</li>
	<li>Rozpocznij eksperyment i ustal podstawową aktywność na 30 sekund.</li>
	<li>Zastosować wstępnie podgrzane leki, takie jak agoniści receptorów i antagoniści, za pomocą systemu perfuzji grawitacyjnej z szybkością 2-3 ml/min. Po zastosowaniu agonistów/antagonistów należy powrócić do perfuzji normalnego buforu i odczekać okres płukania/rekonwalescencji wynoszący co najmniej 10 minut 
	UWAGA: Czas stosowania leku będzie się różnić w zależności od indywidualnego związku i projektu eksperymentalnego. Ogólnie rzecz biorąc, 20-30 sekundowe zastosowanie agonisty jest wystarczające do aktywacji receptorów sprzężonych z białkiem G w neuronach i komórkach glejowych. Jednak kanały jonowe bramkowane ligandem (takie jak nikotynowe receptory acetylocholiny) wymagają czasu aplikacji nie dłuższego niż 5-10 sekund. Dalsze ekspozycje spowodują szybkie odczulanie kanałów jonowych bramkowanych ligandami. Antagoniści powinni być aplikowani przez około 3-15 minut, aby zapewnić całkowitą blokadę szlaków receptorowych. Jest to jednak duże uogólnienie i badacze powinni zawsze optymalizować każdy eksperymentalny lek w swoim konkretnym paradygmacie.</li>
	<li>Zatrzymaj nagrywanie i wyświetl film poklatkowy z eksperymentu. Starannie wybierz obszary zainteresowania (ROI) za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do normalizacji i porównania intensywności fluorescencji ROI z początkową bazową wartością fluorescencyjną. Zmiany znormalizowanej fluorescencji są wprost proporcjonalne do zmian [Ca2+].
	<ol>
		<li>W celu poprawy dokładności oceny należy zastosować modyfikację opisanej wcześniej metody 26 przy użyciu ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)background, gdzie F1 jest fluorescencją w dowolnym punkcie, a F0 jest fluorescencją wyjściową. Modyfikacja ta pomaga w redukcji szumów spowodowanych zmianami fluorescencji w preparatach tkankowych, które wykazują ruch warstwy mięśniowej leżącej pod splotem mięśniowo-jelitowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+neurons+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Autonomic+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Types of neurons in the enteric nervous system.</a> Journal of the Autonomic Nervous System. 81 (1-3), 87-96 (2000).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+the+autonomic+nervous+system%3A+peripheral+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The organization of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Neuroscience. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li>
<li>Pham, T. D., Gershon, M. D., Rothman, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+of+origin+of+neurons+in+the+murine+enteric+nervous+system%3A+sequence+in+relation+to+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Time of origin of neurons in the murine enteric nervous system: sequence in relation to phenotype.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 789-798 (1991).</li>
<li>Nasser, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+enteric+glia+in+intestinal+physiology%3A+effects+of+the+gliotoxin+fluorocitrate+on+motor+and+secretory+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of enteric glia in intestinal physiology: effects of the gliotoxin fluorocitrate on motor and secretory function.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291, G912-927 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+%26+Motility%22%5BJournal%5D)">Glial cells in the gut.</a> Neurogastroenterology & Motility. 17 (6), 777-790 (2005).</li>
<li>Broadhead, M. J., Bayguinov, P. O., Okamoto, T., Heredia, D. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+transients+in+myenteric+glial+cells+during+the+colonic+migrating+motor+complex+in+the+isolated+murine+large+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ transients in myenteric glial cells during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine.</a> J. Physiol. 590, 335-350 (2012).</li>
<li>Gulbransen, B. D., Bains, J. S., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia+are+targets+of+the+sympathetic+innervation+of+the+myenteric+plexus+in+the+guinea+pig+distal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enteric glia are targets of the sympathetic innervation of the myenteric plexus in the guinea pig distal colon.</a> J. Neurosci. 30, 6801-6809 (2010).</li>
<li>McClain, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+Responses+in+Enteric+Glia+Are+Mediated+by+Connexin-43+Hemichannels+and+Modulate+Colonic+Transit+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Ca2+ Responses in Enteric Glia Are Mediated by Connexin-43 Hemichannels and Modulate Colonic Transit in Mice.</a> Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).</li>
<li>Chandrasekharan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonic+motor+dysfunction+in+human+diabetes+is+associated+with+enteric+neuronal+loss+and+increased+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+%26+Motility%22%5BJournal%5D)">Colonic motor dysfunction in human diabetes is associated with enteric neuronal loss and increased oxidative stress.</a> Neurogastroenterology & Motility. 23 (2), e131-e126 (2011).</li>
<li>Abdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glial+cells+protect+neurons+from+oxidative+stress+in+part+via+reduced+glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione.</a> FASEB J. 24, 1082-1092 (2010).</li>
<li>Aube, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+enteric+neurone+phenotype+and+intestinal+functions+in+a+transgenic+mouse+model+of+enteric+glia+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption.</a> Gut. 55, 630-637 (2006).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Gulbransen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+neuronal+P2X7+receptor-pannexin-1+mediates+death+of+enteric+neurons+during+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of neuronal P2X7 receptor-pannexin-1 mediates death of enteric neurons during colitis.</a> Nat Med. 18, 600-604 (2012).</li>
<li>Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+activity+in+different+classes+of+myenteric+neurons+underlying+the+migrating+motor+complex+in+the+murine+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium activity in different classes of myenteric neurons underlying the migrating motor complex in the murine colon.</a> J Physiol. 588, 399-421 (2010).</li>
<li>Okamoto, T., Bayguinov, P. O., Broadhead, M. J., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+transients+in+submucous+neurons+during+the+colonic+migrating+motor+complex+in+the+isolated+murine+large+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) transients in submucous neurons during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine.</a> Neurogastroenterol Motil. 24 (8), 769-778 (2012).</li>
<li>Kunze, W. A., Clerc, N., Furness, J. B., Gola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soma+and+neurites+of+primary+afferent+neurons+in+the+guinea-pig+intestine+respond+differentially+to+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The soma and neurites of primary afferent neurons in the guinea-pig intestine respond differentially to deformation.</a> J Physiol. 526, 375-385 (2000).</li>
<li>Schemann, M., Michel, K., Peters, S., Bischoff, S. C., Neunlist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+the+gastrointestinal+tract%3A+mapping+the+human+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging and the gastrointestinal tract: mapping the human enteric nervous system.</a> Am J Physiol. 282, G919-G925 (2002).</li>
<li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+spread+of+pacemaker+activity+in+through+ICC+in+guinea-pig+antrum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastro+Motil%22%5BJournal%5D)">Visualization of spread of pacemaker activity in through ICC in guinea-pig antrum.</a> Neurogastro Motil. 14, 575(2001).</li>
<li>Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+organization+of+Ca2%2B+waves+by+enteric+neural+reflexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction and organization of Ca2+ waves by enteric neural reflexes.</a> Nature. 399, 62-66 (1999).</li>
<li>Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+and+neural+regulation+of+calcium+waves+in+longitudinal+and+circular+muscle+layers+of+guinea-pig+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Propagation and neural regulation of calcium waves in longitudinal and circular muscle layers of guinea-pig small intestine.</a> Gastroenterology. 118, 982-984 (2000).</li>
<li>Jessen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-like+glia+in+the+peripheral+nervous+system%3A+an+immunohistochemical+study+of+enteric+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-like glia in the peripheral nervous system: an immunohistochemical study of enteric glia.</a> Journal of Neuroscience. 3 (11), 2206-2218 (1983).</li>
<li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 625-632 (2012).</li>
<li>Gomes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+paracrine+communication+between+enteric+neurons+and+glia+in+a+primary+cell+culture+derived+from+embryonic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterology+%26+Motility%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent paracrine communication between enteric neurons and glia in a primary cell culture derived from embryonic mice.</a> Neurogastroenterology & Motility. 21 (8), e870-e862 (2009).</li>
<li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+neuron-to-glia+signaling+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Purinergic neuron-to-glia signaling in the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 136, 1349-1358 (2009).</li>
<li>Ren, J., Bertrand, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptors+and+synaptic+transmission+in+enteric+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptors and synaptic transmission in enteric neurons.</a> Purinergic Signal. 4, 255-266 (2008).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiol Rev. 79, 1089-1125 (1999).</li>
<li>Dongcheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+regionalisation+for+enteric+nervous+system+formation%3A+implications+for+Hirschsprung%27s+disease+and+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest regionalisation for enteric nervous system formation: implications for Hirschsprung's disease and stem cell therapy.</a> Developmental Biology. 339 (2), 280-294 (2010).</li>
<li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behind+an+enteric+neuron+there+may+lie+a+glial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Behind an enteric neuron there may lie a glial cell.</a> J Clin Invest. 121, 3386-3389 (2011).</li>
<li>Boesmans, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuron-glia+interactions+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging neuron-glia interactions in the enteric nervous system.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metodologie opisane w tym manuskrypcie zapewniają spójne podejście do skutecznego badania neuronów i gleju jelitowego w ENS. Chociaż obrazowanie neuronów i gleju jelitowego w hodowli dostarczyło wielu informacji na temat funkcji poszczególnych komórek, badanie tych komórek w ich natywnym, wielokomórkowym środowisku ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich fizjologii i patofizjologii. Mikroskopia fluorescencyjna jest kluczową techniką oceny wielokierunkowych oddziaływań komórek w ENS. Ładowanie komórek ENS selektywnymi markerami fluorescencyjnymi i akwizycja obrazu za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości pozwala na ilościowe obserwacje aktywności komórkowej w ENS. Obrazowanie żywych próbek tkanek ENS jest wykonywane stosunkowo szybko i generuje duże ilości pogłębionych danych funkcjonalnych i przestrzennych. Preparaty na mięśnie myszki i sploty podśluzówkowe stosowane w tych eksperymentach pozwalają na manipulacje molekularne i genetyczne. ObrazowanieCa2+ w preparatach typu whole-mount stanowi użyteczne narzędzie do oceny interakcji neuron-glej.
W zaawansowanych paradygmatach eksperymentalnych można połączyć kilka sond w celu uzyskania informacji o różnych zdarzeniach w komórkach. Mikroskopia fluorescencyjna może rejestrować obrazy ze zwiększonym kontrastem określonych cząsteczek, jeśli zastosuje się odpowiednią etykietę fluorescencyjną. Fluo-4 został wybrany, ponieważ posiada duży zakres dynamiki. Wystarczający czas inkubacji ma kluczowe znaczenie w przypadku stosowania barwników AM w ENS. Aby osiągnąć najlepsze wyniki, może być konieczne dostosowanie stężenia barwnika i metody ładowania. Idealne preparaty powinny być obciążone wystarczającą ilością barwnika, aby uwidocznić zmiany we fluorescencji, ale nie na tyle, aby barwnik chelatował jony docelowe i zakłócał sygnalizację wewnątrzkomórkową. Ekspozycja na światło fluorescencyjne powinna być ograniczona, aby zapobiec fototoksyczności w komórkach i fotowybielaniu barwników. 
Badacze muszą być ostrożni z kilkoma etapami tego eksperymentu, zwłaszcza z przygotowaniem roztworu i tkanki. Szczególną ostrożność należy zachować podczas przetwarzania i preparowania tkanki ENS w celu utrzymania funkcji komórkowych. Przewód pokarmowy składa się z kilku warstw i odmian tkanek, co stanowi wyzwanie dla jakości sekcji i obrazowania w tych preparatach typu whole mount 27. Ponadto łączące się szlaki światłowodowe MP są szersze, a zwoje są większe niż w SMP 2. Gęstość neuronów splotu mięśniowo-jelitowego jest wyższa w porównaniu ze splotem podśluzówkowym 28. Powolne i nieprecyzyjne sekcje będą miały szkodliwy wpływ na jakość preparatów splotu, a tym samym na ogólny sukces eksperymentów. Dlatego czyste/nieuszkodzone narzędzia, praktyka i zręczność manualna mają kluczowe znaczenie dla tej procedury. 
W przypadku preparatów tkanek typu full-mount należy zwrócić szczególną uwagę na rysowanie obszarów zainteresowania (ROI), aby prawidłowo ocenić kinetykę i stopień obserwowanej zmiany intensywności fluorescencji pożądanego typu komórki. Ponieważ zwoje znajdują się na kurczliwej warstwie mięśniowej, artefakty ruchowe spowodowane ruchliwością jelit są głównym problemem podczas obrazowania in situ . Tak więc tłumienie tych zaburzeń ruchowych poprzez ponowne pinowanie preparatów tkankowych po inkubacji z enzymami i dodanie hamowania farmakologicznego (nikardypina/skopolamina) do umożliwia wyraźne i wiarygodne pozyskiwanie obrazu. Oprócz farmakologii i mechanicznych podejść do zapobiegania ruchom tkanek, ostatnie badania ilustrują zastosowanie zaawansowanych metodologii oprogramowania i charakterystyki odpowiedzi typu komórki w celu skorygowania ruchu tkanki resztkowej w zapisach i poprawy dokładności analizy 29. Pomijając te przeszkody techniczne, metoda ta zapewnia fizjologicznie istotne warunki do oceny morfologicznych i ilościowych cech neuronów i gleju jelitowego w ENS.

Jelitowy układ nerwowy (ENS) jest zorganizowany w dwa zwojowe sploty osadzone w ścianie przewodu pokarmowego 1. Te wewnątrzmięśniowe obwody nerwowe, splot mięśniowo-jelitowy (MP) i splot podśluzówkowy (SMP), składają się z neuronów i gleju jelitowego (ryc. 1) 2. MP i SMP regulują funkcje przewodu pokarmowego (GI), takie jak odpowiednio motoryka jelit oraz wchłanianie i wydzielanie nabłonka 3. Glej jelitowy znajduje się w bliskim sąsiedztwie neuronów w zwojach, ale populacje gleju jelitowego istnieją również w łączących się drogach włóknistych i pozazwojowych częściach ściany jelita 3,4. Pierwotnie uważano, że glej jelitowy zapewnia neuronom jedynie wsparcie odżywcze. Jednak ostatnie badania zdecydowanie sugerują, że interakcje neuron-glej są niezbędne dla funkcji ENS 5,6. Na przykład dane pokazują, że glej jelitowy "słucha" aktywności neuronalnej 7 i moduluje obwody neuronalne 6,8, chroni neurony jelitowe przed stresem oksydacyjnym 9 i jest zdolny do generowania nowych neuronów jelitowych w odpowiedzi na uraz 10,11. Protokół przedstawiony w niniejszym przeglądzie technicznym zapewnia prostą i solidną metodę badania złożonych interakcji między neuronami a glejem jelitowym przy użyciu wewnątrzkomórkowego obrazowania Ca2 + in situ.
Ca2+ jest wszechobecną cząsteczką sygnałową w pobudliwych komórkach i odgrywa istotną rolę w sygnalizacji synaptycznej w układzie nerwowym 12. Pobudzenie neuronów lub gleju jelitowego powoduje wzrost cytoplazmatycznego stężenia Ca2 + poprzez napływ przez kanały przepuszczalne Ca2 + lub uwalnianie Ca2 + z wewnątrzkomórkowych magazynów wapnia. Obrazowanie stanów przejściowych Ca2+ w neuronach i gleju za pomocą barwników fluorescencyjnych jest uznaną i szeroko stosowaną techniką do badania funkcjonalnej organizacji i dynamiki ENS 13-17. Wykazano, że obrazowanie Ca2 + jest ważnym narzędziem w badaniu nienaruszonych segmentów tkanki przewodu pokarmowego w celu wyjaśnienia rozprzestrzeniania się pobudliwości przez sieci rozruszników ICC 18 i mięśnie gładkie jelit 19,20. Umożliwia naukowcom badanie szerokiego spektrum parametrów fizjologicznych i dostarcza informacji zarówno o ich rozmieszczeniu przestrzennym, jak i dynamice czasowej. Komórki mogą być skutecznie barwione w minimalnie inwazyjny sposób przy użyciu przepuszczalnych dla błony wskaźników fluorescencyjnych i zoptymalizowanych protokołów barwienia 21. Daje to możliwość monitorowania dużej liczby neuronów i gleju jelitowego w funkcjonalnie zachowanych preparatach 14-16,22, a także in vivo 23. Preparaty tkankowe typu całomocowanego są masowo obciążone barwnikiem wskaźnikowym Ca2 + o wysokim powinowactwie, takim jak Fluo-4, który zwiększa jego fluorescencję po związaniu z Ca2+. Zmiany fluorescencji są rejestrowane przez kamerę CCD i analizowane cyfrowo 6. Pojawienie sięCa2+ dało możliwość monitorowania interakcji neuronów i komórek glejowych, reakcji na różne bodźce oraz udziału tych typów komórek w procesach żołądkowo-jelitowych w czasie rzeczywistym.
Obrazowanie in situ Ca2+ dostarczyło ogromnego wglądu w mechanizmy sygnalizacji neuronów jelitowych i gleju i posiada kilka wyraźnych zalet w porównaniu z modelami hodowli komórkowych 6,24. Po pierwsze, preparaty in situ utrzymują natywne środowisko macierzy neuronów i gleju oraz pozostawiają nienaruszoną większość ich połączeń z tkanką docelową. Po drugie, genetyka i morfologia hodowanego gleju jelitowego są znacznie zmienione w porównaniu z in vivo 6,24. Po trzecie, wiele interakcji heterotypowych jest traconych w pierwotnej hodowli komórkowej, co ogranicza ocenę interakcji komórka-komórka. Chociaż hodowane komórki dobrze nadają się do badania podstawowych właściwości, ich przydatność do badania złożonych interakcji między glejem jelitowym a neuronami jest ograniczona. Badanie interakcji neuron-glej przy użyciu podejścia in situ jest bardziej istotne z fizjologicznego punktu widzenia, ponieważ szlaki synaptyczne pozostają nienaruszone 25. W porównaniu z metodami opartymi na hodowlach komórkowych, podejście in situ zapewnia lepsze warunki do systematycznego zrozumienia skomplikowanych interakcji między neuronami a glejem jelitowym. Co więcej, płaska organizacja splotu zwojowego w preparatach do pełnego montażu jest idealna do obrazowania fluorescencyjnego wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych Ca2 +, a technika ta zapewnia proste podejście do oceny aktywności neuronów glejowych w ENS.

<table><tbody><tr><td>Podgrzewacz strzykawkowy BubbleStop&nbsp;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza, Typ II, proszek</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dyspaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia preparacyjne</td><td>Roboz&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stałostolikowy</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM barwnik</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki do owadów</td><td>Narzędzia do nauki Drobne</td><td>szpilki Minutien Oprogramowanie</td><td></td></tr><tr><td>do obrazowania żywych komórek iQ</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo kamera sCMOS</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Komora</td> <td>perfuzyjnaNiestandardowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pompa perystaltyczna</td><td>Aparat Harvard</td><td>Model 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Probenecydowe</td><td>sondy molekularne</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>Skopolamina</td><td>Sigma</td><td>S1013&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&nbsp;</td><td>Regulator temperatury Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Warner</td><td>Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ ca2+ obrazowanie jelitowego układu nerwowego

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Zachowania odruchowe jelita są kontrolowane przez jelitowy układ nerwowy (ENS). ENS to integracyjna sieć neuronów i komórek glejowych w dwóch splotach zwojowych umieszczonych w ścianie jelita. Neurony jelitowe i glej jelitowy są jedynymi typami komórek w zwojach jelitowych. Aktywność neuronów jelitowych i gleju jest odpowiedzialna za koordynację funkcji jelit. Protokół ten opisuje metody obserwacji aktywności neuronów i gleju w nienaruszonym ENS poprzez obrazowanie wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych wapnia (Ca2+) za pomocą fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych. Nasza dyskusja techniczna koncentruje się na metodach obrazowaniaCa2+ w preparatach do pełnego montażu splotu mięśniowo-jelitowego z jelita gryzonia. Masowe ładowanie całych mocowań ENS ze wskaźnikiem Ca2+ o wysokim powinowactwie, takim jak Fluo-4, pozwala na pomiary odpowiedzi Ca2+ w pojedynczych neuronach lub komórkach glejowych. Reakcje te mogą być wywoływane wielokrotnie i niezawodnie, co pozwala na badania ilościowe z wykorzystaniem narzędzi farmakologicznych. Odpowiedzi Ca2+ w komórkach ENS są rejestrowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w chłodzoną kamerę ze sprzężeniem ładunkowym (CCD). Pomiary fluorescencji uzyskane za pomocą obrazowania Ca2 + w preparatach do montażu całego oferują prosty sposób na scharakteryzowanie mechanizmów i potencjalnych konsekwencji funkcjonalnych odpowiedzi Ca2 + w neuronach jelitowych i komórkach glejowych.

Prawidłowe zastosowanie tej techniki pozwala badaczom na dokładny pomiar przejściowych zmian stężenia wewnątrzkomórkowego Ca2+ [Ca2+]i w neuronach i gleju jelitowym w preparatach tkankowych typu whole-mount. Reprezentatywny przykład odpowiedzi Ca2+ wywołanej agonistą w gleju w obrębie zwoju splotu mięszyjączkowego jelita grubego myszy pokazano w Video 1. Poniższe wyniki mają na celu zilustrowanie reprezentatywnych rezultatów uzyskanych za pomocą tej metody. Po pierwsze, Figure 2 przedstawia wyniki eksperymentu mierzącego zmiany [Ca2+]i w gleju jelitowym w odpowiedzi na stymulację ATP w preparatach podłużnego splotu mięszyjączkowego (LMMP) jelita grubego świnki morskiej. W szczególności rycina ta pokazuje metodę właściwej analizy opisanego powyżej protokołu eksperymentalnego, w tym obrys analizowanego zwoju mięszyjączkowego oraz gwiazdki oznaczające położenie neuronów jelitowych. Wyniki te ilustrują również optymalną dawkę ATP o stężeniu stu mikromoli na mobilizację [Ca2+]i w gleju mięszyjączkowym świnki morskiej. Odpowiedź ta może być wykorzystana do kalibracji stymulacji gleju jelitowego i normalizacji odpowiedzi na bodźce testowe. Następnie, Figure 3 wyjaśnia, jak prawidłowo wybierać obszary zainteresowania (ROI) otaczające komórki glejowe, zaznaczone żółtymi okręgami. Wyniki te pokazują również pożądane zmiany fluorescencji w warunkach podstawowych oraz w odpowiedzi na bodźce farmakologiczne. Na koniec, Figure 4 demonstruje kwestie przestrzenne przy wyborze gleju i neuronów jelitowych do pomiaru odpowiedzi [Ca2+]i w preparatach whole-mount.
<img alt="Schemat szlaków neuronalnych z zwojami, komórkami glejowymi i neuronami; warstwy splotu mięśnieniowego i podśluzówkowego." src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Organizacja ENS. ENS zawiera dwa główne sploty zwojowe. Splot mięśnieniowy znajduje się pomiędzy podłużnymi a okrężnymi warstwami mięśni. Splot podśluzówkowy zlokalizowany jest pomiędzy błoną śluzową a okrężną warstwą mięśni. ENS składa się wyłącznie z neuronów i gleju jelitowego. Zwoje są połączone wiązkami włókien nerwowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna sieci neuronalnych wykazująca odpowiedź na ATP; dołączono wykres zmiany intensywności." src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Glej enteryczny w splotowym splotcie mięszykowym jelita grubego świnki morskiej reaguje na ATP in situ. (A) Fluorescencja Fluo-4 w zwoju mięszykowym (obrysowanym przerywaną linią) w warunkach spoczynkowych. Strzałki wskazują grube międzzwojowe pęczki włókien. (B) Po stymulacji 100 μmol/L ATP komórki glejowe, ale nie neurony, szybko zwiększają fluorescencję Fluo-4, co wskazuje na wzrost [Ca2+]i. Zauważmy, że reagujące komórki są małe i otaczają znacznie większe neurony (ciemne przestrzenie oznaczone gwiazdkami). (C) Glej enteryczny reaguje na ATP w sposób zależny od dawki, przy czym 1 mmol/L wywołuje odpowiedzi maksymalne 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna i wykres przedstawiający indukowaną przez ATP odpowiedź komórkową, analiza za pomocą czytnika mikropłytek." src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Mysie komórki S-100-GFP+ w splotowym splocie mięśniowym jelita grubego reagują na ATP in situ. (A) Glejowe komórki S-100-GFP+ (zielone) w mysim zwoju splotowym jelita grubego (obrysowanym przerywaną linią). Sześć obszarów zainteresowania (ROI) otaczających komórki glejowe w obrębie zwojów przedstawiono jako żółte okręgi. Strzałki wskazują grube wiązki włókien prowadzące do zwoju. Gwiazdki oznaczają położenie 2 neuronów jelitowych. (B) Ten sam zwój wykazujący fluorescencję Rhod-2 w warunkach bazowych. (C) Po stymulacji 100 μmol/L ATP komórki glejowe reagują zwiększeniem [Ca2+]i, co objawia się wzrostem fluorescencji Rhod-2. (D) Krzywe przebiegu odpowiadające każdemu ROI przedstawionemu na rys. A–C. (E) Uśredniona odpowiedź (średnia ± SEM) z 6 ROI przedstawionych na rys. D 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Aktywność neuronalna w czasie; obrazowanie fluorescencyjne, interakcja neuron-glej, wykresy odpowiedzi wapniowej." src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. In situ obrazowanie komunikacji między neuronami a glejem jelitowym. (A) Reprezentatywne obrazy (pseudokolorowe) z eksperymentu obrazowania Ca2+, w którym preparat całego splotu mięsieniowego poddano działaniu BzATP (100 μM, 30 s), będącego agonistą neuronalnego receptora P2X7. Zauważalny jest wzrost fluorescencji Fluo4 w neuronie (A’) przed otaczającymi go komórkami glejowymi jelit (A”). (B) Analiza zmiany fluorescencji w czasie w gleju (kolor niebieski) i neuronach (kolor czerwony) po zastosowaniu neuronalnego agonisty BzATP. (C) Odpowiedzi neuronalne i glejowe na BzATP w zwykłym buforze (linie ciągłe) oraz w buforze o niskiej zawartości Ca2+ i Mg2+ (linie przerywane) w celu potencjacji neuronalnych receptorów P2X7 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wideo 1. Odpowiedź Ca2+ wywołana agonistą w gleju jelitowym in situ. Ten film przedstawia zwoj myentericzną z dystalnej części okrężnicy myszy, załadowaną wskaźnikiem Ca2+ Fluo-4. Agonista komórek glejowych, ADP, jest dodawany do kąpieli w wskazanym momencie. ADP wywołuje wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ w gleju jelitowym, co obserwuje się jako przejściowy wzrost fluorescencji Fluo-4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">Aby obejrzeć ten film, kliknij tutaj.</a>

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie aktywności neuronów i gleju jelitowego w żywych preparatach całych fragmentów jelita z wykorzystaniem fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych wapnia. Cel ten osiąga się poprzez wycięcie fragmentu jelita z organizmu zwierzęcia i umieszczenie go w uprzednio ogrzanym medium. W drugim kroku jelito należy rozciąć wzdłuż krawędzi krezkowej i przypiąć na płasko pod lekkim napięciem, tak aby powierzchnia śluzowa była skierowana ku górze.Preparaty całych splotów mięśniowych są przygotowywane za pomocą mikrodyssekcji i umieszczane w naczyniach do obrazowania. Następnie preparaty całych splotów są ładowane fluorescencyjnym barwnikiem wskaźnikowym flu oh four w inkubatorze. W końcowych etapach naładowane preparaty są obrazowane przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu wyposażonego w kamerę o wysokiej rozdzielczości, sterowaną przez oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazu, w celu zarejestrowania aktywności podstawowej.Następnie dodaje się badane leki i rejestruje transienty wapniowe w neuronach i gleju. Ostatecznie obrazowanie wapniowe układu nerwowego jelit in situ służy do badania, w jaki sposób aktywność komórkowa neuronów i gleju przyczynia się do regulacji fizjologicznych funkcji jelit oraz do dysfunkcji układu nerwowego jelit w patofizjologii jelit.Zastosowanie tej techniki przyczynia się do lepszego zrozumienia fizjologii i patofizjologii czynnościowych zaburzeń jelit oraz nieswoistych zapalnych chorób jelit poprzez wykorzystanie prostej i niezawodnej metody badania złożonych oddziaływań między neuronami a glejem enterycznym przy użyciu obrazowania wapnia w komórkach NC; procedurę tę zaprezentują naukowcy z mojego laboratorium. Poniższe procedury z wykorzystaniem tkanek zwierząt laboratoryjnych są zgodne z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt z 2013 roku i zostały wcześniej zatwierdzone przez I-A-C-U-C Uniwersytetu Stanowego Michigan. Po eutanazji zwierzęcia zgodnie z zatwierdzonymi procedurami, ułóż zwierzę w pozycji na plecach i oczyść skórę nad brzuchem 70% ethanol. Używając pęsety, uchwyć skórę brzucha w linii środkowej, a następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj sześcio-centymetrowe cięcie w linii pośrodkowej wzdłuż linii białej w celu odsłonięcia wewnętrznych organów układu pokarmowego.Następnie za pomocą pęsety tępowej zlokalizuj i odsłoń okrężnicę wewnątrz otrzewnej. Przetnij nożyczkami krezkę jelita grubego i zacznij rozwijać jelita. Po odpowiednim rozwinięciu długości jelit, przetnij okrężnicę dystalnie w stosunku do kątnicy oraz proksymalnie w stosunku do odbytnicy, aby przygotować jelito grube, co zostanie zaprezentowane w tym filmie.Następnie szybko wyjmij odcinek jelita i umieść go w zlewce zawierającej podłoże DM EMF 12 uzupełnione o 3 µM nikardypiny chlorowodorku oraz 1 µM skopolaminy chlorowodorku, w temperaturze lodu. Dodatek tych inhibitorów ułatwia mikrodyssekcję i późniejsze obrazowanie poprzez sparaliżowanie mięśni gładkich jelita. Wytnij niewielki odcinek o długości od 4 do 6 cm z wybranego fragmentu jelita i umieść go w naczyniu Petri powlekanym syl guardem, wypełnionym schłodzonym uzupełnionym podłożem.Następnie zabezpiecz końce proksymalny i dystalny segmentu jelita za pomocą szpilek entomologicznych i otwórz rurkę jelitową, wykonując proste cięcie wzdłużne wzdłuż brzegu krezowego. Teraz przypnij tkankę na płasko pod lekkim napięciem stroną błony śluzowej do góry i ostrożnie oddziel warstwę śluzową, podnosząc błonę śluzową za pomocą cienkich pęsety nr 5 i wycinając ją od spodu bardzo cienkimi nożyczkami sprężynowymi. Podziel tkankę na mniejsze preparaty o powierzchni około 0,5 centymetra kwadratowego, umieść każdy fragment w naczyniu do obrazowania wypełnionym suplementowaną pożywką i odstaw na lód.Przypnij każdy preparat w czterech narożnikach, tak aby okrężna warstwa mięśniowa była skierowana do góry. Ostrożnie wypreparuj mięśnie okrężne, oddzielając je za pomocą precyzyjnych pincet. Aby odsłonić splot domięśniowy, unikaj nadmiernego rozciągania, umieść naczynia do obrazowania z powrotem na lodzie i wymień roztwór w każdym naczyniu na świeżą pożywkę z dodatkami.Następnie wyjmij naczynia z lodu, dodaj do każdego z nich 2 mL mieszaniny enzymów i inkubuj w temperaturze pokojowej w atmosferze 5% CO₂ i 95% powietrza przez 15 minut. Na koniec trzykrotnie przemyj preparaty tkankowe medium, a następnie, pracując w warunkach ograniczonego światła w celu uniknięcia fotoblaknięcia, do 1,5 mL suplementowanego medium i 1,2 µL 250 mM roztwoku probit dodaj 1,5 µL 4 mM roztwoku Fluro four, a następnie dodaj około 1,5 mL roztworu ładującego Fluro four do naczyń obrazowych i inkubuj w ciemnym inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 45 minut. Po wyjęciu naczyń z inkubatora trzykrotnie przemyj preparaty medium.Następnie należy dodać świeżą pożywkę zawierającą 200 micromolar prop acid w celu wzmocnienia znakowania neuronów i inkubować jak poprzednio przez 15 minut. Podczas inkubacji należy przygotować zmodyfikowany bufor Krebsa zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu, a następnie dodać trzy micromolar nicardipine oraz jeden micromolar scopolamine w celu zahamowania skurczów mięśni. Podczas obrazowania jonów calcium two plus i sekcji całego preparatu należy umieścić komorę rejestracyjną pod mikroskopem fluorescencyjnym, korzystając z grawitacyjnego systemu perfuzji z wieloma podgrzewanymi zbiornikami ze strzykawkami.Ustanów ciągły przepływ perfuzyjny buforu Krebsa o temperaturze 37 °C w tempie od dwóch do trzech mililitrów na minutę. Upewnij się, że zapobieżono tworzeniu się pęcherzyków powietrza zarówno w linii doprowadzającej, jak i w linii ssącej podłączonej do pułapki próżniowej. Ustaw ostrość na wybrany splot w oświetleniu w polu jasnym.Należy unikać nadmiernej ekspozycji tkanki, co mogłoby doprowadzić do fotoblaknięcia. Należy sprawdzić stopień załadowania flu oh four w zwojach i wybrać zdrowe zwoje do obrazowania. Uszkodzone, niezdrowe zwoje będą wykazywać autofluorescencję lub morfologię punktową i nie powinny być wykorzystywane do obrazowania.Po wybraniu zwoju należy przekierować drogę światła do kamery i uzyskać obraz na żywo. Za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu upewnij się, że zwój znajduje się w ostrości, a następnie ustaw częstotliwość akwizycji obrazów oraz czasy ekspozycji. Częstotliwości i czasy akwizycji obrazów będą się różnić w zależności od zdarzeń, które badacze chcą zarejestrować. W większości eksperymentów obrazy są tradycyjnie pozyskiwane z częstotliwością od 0,5 do 1 Hz dla komórek glejowych i do 2–10 Hz.W przypadku neuronów, ponieważ przejściowe wzrosty poziomu wapnia w gleju nie są tak szybkie jak w neuronach, należy rozpocząć rejestrację i ustalić podstawową aktywność fizjologiczną wybranego zwoju w obecności bodźców eksperymentalnych przez 30 sekund. Następnie należy podać podgrzane do odpowiedniej temperatury badane substancje, takie jak agoniści i antagoniści receptorów, wykorzystując grawitacyjny system perfuzji z przepływem od dwóch do trzech mililitrów na minutę, zgodnie z zoptymalizowanym protokołem dla danej substancji. Następnie należy zatrzymać rejestrację i przejrzeć film poklatkowy z eksperymentu.Starannie wybierz obszary zainteresowania (ROI), korzystając z odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu. Na koniec użyj odpowiedniego oprogramowania do obrazowania, aby znormalizować i porównać intensywność fluorescencji obszarów zainteresowania względem ich początkowej wartości bazowej. Zmiany w znormalizowanej fluorescencji są bezpośrednio proporcjonalne do zmian poziomu wapnia. Trzy poniższe obrazy demonstrują, że glej jelitowy u świnki morskiej reaguje na TP in situ.W warunkach podstawowych widoczna jest niska fluorescencja fluoro-4, zaznaczona linią przerywaną. Strzałki wskazują grube wiązki włókien międzyzrazikowych po stymulacji 100 µM ATP; komórki glejowe, a nie neurony, wykazują szybki wzrost fluorescencji fluoro-4, co wskazuje na wzrost poziomu wapnia. Należy zauważyć, że reagujące komórki są małe i otaczają znacznie większe neurony, wskazane ciemnymi obszarami oznaczonymi gwiazdkami.Ten histogram pokazuje, że glej jelitowy reaguje na TP w sposób zależny od dawki, przy czym stężenie jednego milimola na litr wywołuje maksymalną odpowiedź. Ten film przedstawia zwoje mięsny z dystalnej części okrężnicy myszy, załadowany wskaźnikiem jonów wapnia dwa plus fluoh4. Agonista komórek glejowych a DP jest dodawany do kąpieli w wskazanym momencie.DP wywołuje wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia w gleju jelitowym, co obserwuje się jako przejściowy wzrost fluorescencji fluo-4. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak dokładnie badać złożone interakcje między neuronami a glejem jelitowym przy użyciu obrazowania wapniowego. Charakterystyka mechanizmów i potencjalnych konsekwencji funkcjonalnych odpowiedzi wapniowych w preparatach całych narządów wymaga precyzyjnej dysekcji w celu uzyskania optymalnej jakości obrazowania.Zastosowanie znakowania fluorescencyjnego oraz stymulacji farmakologicznej w tej technice mikroskopowej umożliwia dokładniejszą ocenę tych komórek w ich naturalnym środowisku wielokomórkowym.

in-situ-ca2-imaging-of-the-enteric-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In Situ obrazowanie Ca2+ układu nerwowego jelit

Niniejszy protokół ilustruje, w jaki sposób barwniki napięciowo-wrażliwe umożliwiają optyczną rejestrację aktywności elektrycznej z nienaruszonych sieci neuronalnych, takich jak sploty jelitowego układu nerwowego świnki morskiej, z regulowaną rozdzielczością obejmującą zakres od pojedynczych komórek po obwody wieloganglionarne.

Optyczny zapis aktywności elektrycznej w sieciach jelitowych świnki morskiej z użyciem barwników napięcioczułych

Ten film demonstruje metodę izolowania komórek glejowych jelit od błony podśluzowej i blaszki właściwej jelita myszy. Przedstawiono w nim etapy ekstrakcji tkanki podśluzówkowej i blaszki właściwej, izolowania z nich komórek glejowych jelitowych i hodowli komórek na powlekanej płytce studzienkowej w celu ustanowienia hodowli komórek glejowych jelitowych.

Izolowanie komórek glejowych jelitowych z błony podśluzowej i blaszki właściwej myszy

Ten film demonstruje barwienie immunologiczne embrionalnego mysiego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji i analizy rozmieszczenia populacji neuronów za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii konfokalnej.

Barwienie immunofluorescencyjne populacji neuronów w embrionalnym mysim przewodzie pokarmowym

Źródło: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego. J. Vis. Exp.Exp. (2015)Ten film pokazuje wapń obrazowanie w celu wizualizacji i analizy aktywności neuronów jelitowych i gleju w preparatach splotu mięśniowo-mięśniowego okrężnicy myszy.

Obrazowanie wapnia aktywności neuronów jelitowych i gleju w splocie mięśniowym okrężnicy myszy

Źródło: Doser, R., et al. Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo subkomórkowego strumienia wapnia w neuronach brzusznego rdzenia nerwowego transgenicznych szczepów Caenorhabditis elegans. Stosowane są dwa różne wskaźniki wapnia: wskaźnik cytoplazmatyczny w jednym szczepie i wskaźnik mitochondrialny w innym. Neurony obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu monitorowania zmian intensywności fluorescencji w...

Obrazowanie subkomórkowej dynamiki wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans

Prezentujemy protokół hodowli komórkowej do bezpośredniego badania neuronalnych i glejowych składników jelitowego układu nerwowego. Mieszana hodowla neuronów i glejów na szkiełkach nakrywkowych jest przygotowywana ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy, co daje możliwość zbadania funkcji poszczególnych neuronów i gleju za pomocą elektrofizjologii, immunohistochemii itp.

Preparat in vitro izolowanych neuronów jelitowych i gleju ze splotu mięśniowo-jelitowego dorosłej myszy

Jelitowy układ nerwowy tworzą komórki grzebienia nerwowego, które namnażają się, migrują i kolonizują jelita. Komórki grzebienia nerwowego różnicują się w neurony z markerami specyficznymi dla ich fenotypu neuroprzekaźnika. Protokół ten opisuje technikę preparowania, utrwalania i barwienia immunologicznego mysiego embrionalnego przewodu pokarmowego w celu wizualizacji ekspresji neuroprzekaźników jelitowego układu nerwowego.

Barwienie immunologiczne w celu wizualizacji rozwoju mysiego jelitowego układu nerwowego

Ten artykuł opisuje technikę obrazowania wideo i mapowanie czasoprzestrzenne o wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji zmian w neuronalnej regulacji ruchliwości okrężnicy u dorosłych myszy. Subtelny wpływ na czynność przewodu pokarmowego (GI) można wykryć przy użyciu tego podejścia w izolowanych preparatach tkankowych, aby pogłębić naszą wiedzę na temat chorób przewodu pokarmowego.

Obrazowanie wideo i mapy czasoprzestrzenne do analizy motoryki przewodu pokarmowego u myszy

Nerwy doprowadzające krezkowe przekazują informacje z przewodu pokarmowego w kierunku mózgu dotyczące normalnej homeostazy, jak również patofizjologii. Aktywność nerwów doprowadzających przewodu pokarmowego można ocenić, montując izolowane segmenty jelita z przyczepionymi nerwami doprowadzającymi do kąpieli narządowej, izolując nerw i oceniając aktywność podstawową i stymulowaną.

In vitro Rejestracja aktywności nerwu doprowadzającego krezki w odcinkach jejunalnych i okrężnicy myszy

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia bezznacznikowe obrazowanie biomolekuł na podstawie ich wewnętrznej wibracji określonych wiązań chemicznych. W tym protokole opisano instrumentalną konfigurację zintegrowanego mikroskopu SRS i dwufotonowego mikroskopu fluorescencyjnego w celu wizualizacji struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym żywych myszy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek biologicznych za pomocą połączonej mikroskopii fluorescencji dwufotonowej i wymuszonego rozpraszania Ramana

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Poznaj metodę obrazowania aktywności neuronów i gleju jelitowego układu nerwowego w preparatach całych jelit przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In Situ Ca²⁺ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Przeglądaj więcej filmów