In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach jelita grubego z całego wierzchowca przy użyciu fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych wapnia. Osiąga się to poprzez najpierw wycięcie części jelita ze zwierzęcia i umieszczenie jej w podgrzanym podłożu. Drugim krokiem jest otwarcie jelita wzdłuż granicy krezki i przygwożdżenie go płasko pod lekkim napięciem z powierzchnią błony śluzowej skierowaną do góry.

Całe preparaty wierzchowe splotu mięśniowo-jelitowego są przygotowywane przez mikrodysekcję i umieszczane w naczyniach do obrazowania. Następnie całe preparaty mount są ładowane fluorescencyjnym wskaźnikiem barwnika grypy oh four w inkubatorze. W końcowych etapach załadowane preparaty są obrazowane za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu obrazowego wyposażonego w kamerę o wysokiej rozdzielczości sterowaną przez oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazu w celu zarejestrowania podstawowej aktywności.

Następnie dodaje się badane leki i rejestruje się stany przejściowe wapnia w neuronach i gleju. Ostatecznie in situ. Obrazowanie wapniowe jelitowego układu nerwowego służy do badania, w jaki sposób aktywność komórkowa neuronów i gleju przyczynia się do regulacji fizjologicznych funkcji jelit i dysfunkcji jelitowego układu nerwowego w patofizjologii jelit.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku ustalenia zrozumienia fizjologii i patofizjologii funkcjonalnych zaburzeń jelit i nieswoistych zapaleń jelit poprzez zastosowanie prostej i solidnej metody badania złożonych interakcji między neuronami a glejem jelitowym za pomocą obrazowania NC two wapnia wykazującego, że ta procedura będzie wolna dla naukowców z mojego laboratorium. Poniższe procedury z udziałem tkanek pochodzących od zwierząt laboratoryjnych są zgodne z wytycznymi VMA A dotyczącymi eutanazji zwierząt z 2013 r. i zostały wcześniej zatwierdzone przez Uniwersytet Stanowy Michigan I-A-C-U-C Po eutanazji zwierzęcia zgodnie z zatwierdzonymi procedurami, ułóż zwierzę w pozycji leżącej i oczyść skórę na brzuchu 70% etanolem. Użyj kleszczy, aby uszczypnąć skórę brzucha w linii środkowej, a następnie użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać sześciocentymetrowe nacięcie przyśrodkowe wzdłuż liniowego łokcia, aby odsłonić wewnętrzne narządy trawienne.

Następnie użyj kleszczy, aby zlokalizować i odsłonić okrężnicę wewnątrz otrzewnej. Przetnij krezkę jelita krętego nożyczkami i zacznij rozplątywać jelito. Gdy długość jelita zostanie odpowiednio rozplątana, przetnij okrężnicę dystalnie do jelita ślepego i proksymalnie do odbytnicy w celu przygotowania jelita grubego, co zostanie pokazane w tym filmie.

Następnie szybko usuń odcinek jelita i umieść go w zlewce zawierającej pożywkę DM EMF 12 uzupełnioną trzema mikromolowymi chlorowodorkami nikardypiny i jednym mikromolowym chlorowodorkiem S skopolaminy na lodzie. Dodatek tych inhibitorów ułatwia mikrodysekcję i późniejsze obrazowanie poprzez paraliż mięśni gładkich jelit. Usuń mały cztero- do sześciocentymetrowy fragment pożądanego odcinka jelita i umieść na pokrytej osłoną syl szalce Petriego wypełnionej schłodzoną pożywką uzupełnioną.

Następnie zabezpiecz bliższe i dalsze końce odcinka jelitowego za pomocą szpilek przeciw owadom i otwórz rurkę jelitową, wykonując proste cięcie wzdłuż granicy krezki. Teraz przypnij tkankę płasko pod lekkim napięciem błoną śluzową do góry i ostrożnie wypreparuj warstwę błony śluzowej, podnosząc błonę śluzową za pomocą cienkich kleszczyków numer pięć i przecinając pod spodem bardzo cienkimi nożyczkami sprężynowymi. Pokrój tkankę na mniejsze preparaty o powierzchni około 0,5 centymetra kwadratowego i umieść każdy kawałek w naczyniu do obrazowania wypełnionym dodatkami i umieść na lodzie.

Przypnij każdy preparat w czterech rogach z okrężną warstwą mięśni skierowaną do góry. Ostrożnie wypreparuj mięsień okrężny, rozsuwając go delikatną pęsetą. Aby odsłonić splot mięśniowo-jelitowy, unikaj nadmiernego rozciągania, umieść naczynia do obrazowania z powrotem na lodzie i zastąp roztwór w każdym naczyniu świeżym, uzupełnionym podłożem.

Następnie wyjmij naczynia z lodu i dodaj dwa mililitry mieszanki enzymatycznej do każdego naczynia i inkubuj w temperaturze pokojowej z 5% dwutlenkiem węgla i 95% powietrzem przez 15 minut. Na koniec umyj preparaty tkankowe trzykrotnie pożywką i ogranicz rogi podczas pracy w warunkach ograniczonego światła, aby uniknąć fotowybielania w 1,5 mililitra uzupełnionej pożywki i 1,2 mikrolitra 250-milimolowego materiału probit do 1,5 mikrolitra Eloqua z czterema milimolowymi Fluro cztery w około 1,5 mililitra grypy oh cztery roztwór ładujący do naczyń obrazowania i inkubować w ciemnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 protokół. Po wyjęciu naczyń z inkubatora należy trzykrotnie umyć preparaty pożywką.

Następnie dodaj świeżą pożywkę zawierającą 200 mikromolowy kwas propowy, aby poprawić znakowanie neuronów nerwowych i inkubować jak poprzednio przez 15 minut. Podczas inkubacji należy sporządzić zmodyfikowany bufor Krebsa zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu i dodać trzy mikromolowe nikardypiny i jedną mikromolową skopolaminę w celu zahamowania skurczów mięśni. Podczas obrazowania calcium two plus i sekcji całego montażu umieść komorę zapisu pod mikroskopem fluorescencyjnym i za pomocą systemu perfuzji grawitacyjnej z wieloma podgrzewanymi zbiornikami strzykawkowymi.

Ustal ciągłą szybkość perfuzji od dwóch do trzech mililitrów na minutę buforu Krebsa o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Upewnij się, że nie dopuścić do tworzenia się pęcherzyków powietrza zarówno na wejściu, jak i w przewodzie ssawnym podłączonym do odwadniacza. Ustaw ostrość żądanego splotu w jasnym oświetleniu pola.

Unikaj prześwietlania tkanki, co może prowadzić do fotowybielania. Zbadaj obciążenie grypy w obrębie zwojów nerwowych i wybierz zdrowe zwoje do obrazowania. Niezdrowe uszkodzone zwoje będą wykazywać morfologię autofluorescencji lub punktową i nie powinny być używane do obrazowania.

Po wybraniu ganglionu przekieruj ścieżkę światła do kamery i uzyskaj obraz na żywo. Za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu upewnij się, że ganglion jest ostry i ustaw szybkość akwizycji obrazu oraz czasy ekspozycji Szybkość i czas akwizycji obrazu będą się różnić w zależności od zdarzeń, które badacze chcą zarejestrować. W przypadku większości eksperymentów obrazy są tradycyjnie uzyskiwane z częstotliwością od 0,5 do jednego herca dla komórek glejowych i od dwóch do 10 herców.

W przypadku neuronów, ponieważ przejściowe nerwy glejowe nie są tak szybkie jak neurony przejściowe wapnia, rozpocznij zapis i ustal wyjściową aktywność fizjologiczną wybranego zwoju przy braku bodźców eksperymentalnych przez 30 sekund. Następnie zastosuj interesujące Cię leki wstępne, takie jak agoniści receptorów i antagoniści, korzystając z systemu perfuzji grawitacyjnej w tempie od dwóch do trzech mililitrów na minutę, zgodnie ze zoptymalizowanym protokołem dla twojego leku. Zatrzymaj nagrywanie i wyświetl film poklatkowy z eksperymentu.

Starannie wybierz obszary zainteresowania lub zwrot z inwestycji za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu. Na koniec użyj odpowiedniego oprogramowania do obrazowania, aby znormalizować i porównać intensywność fluorescencji obszarów zainteresowania z początkową linią bazową Zmiany wartości w znormalizowanej fluorescencji są wprost proporcjonalne do zmian wapnia. Poniższe trzy obrazy pokazują, że glej jelitowy u świnki morskiej reaguje na TP in situ.

W warunkach podstawowych widoczna jest fluorescencja fluoru czwartego o niskim poziomie, zaznaczona linią przerywaną. Strzałki wskazują na grube drogi włókien międzyzwojowych po stymulacji komórkami glejowymi 100 mikro mo na litr A TP, ale nie neurony szybko zwiększają fluorescencję 4, co wskazuje na wzrost wapnia. Zauważ, że reagujące komórki są małe i otaczają znacznie większe neurony wskazane ciemnymi przestrzeniami oznaczonymi gwiazdką.

Ten histogram pokazuje, że glej jelitowy reaguje na TP w sposób zależny od dawki, z jednym milimolem na litr, wywołując maksymalne odpowiedzi. Ten film pokazuje zwój mięśniowo-jelitowy z dystalnej okrężnicy myszy załadowany wapniem dwa plus wskaźnik barwnika grypy oh four. Agonista komórek glejowych DP dodaje się do kąpieli, gdy jest to wskazane.

DP wywołuje wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia dwa plus w gliku jelitowym, co obserwuje się na podstawie przejściowego wzrostu fluorescencji grypy oh four. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dokładnie badać złożone interakcje między neuronami i empirycznie za pomocą obrazowania wapnia. Scharakteryzowanie mechanizmów i potencjalnych konsekwencji funkcjonalnych reakcji wapnia w preparatach z całego mocowania wymaga precyzyjnych sekcji w celu uzyskania idealnej jakości obrazowania.

Zastosowanie znakowania fluorescencyjnego i bodźców farmakologicznych w tej technice opartej na mikroskopii umożliwia lepszą ocenę tych komórek w ich naturalnym środowisku wielokomórkowym.