Pomiar aktywności larw w monitorze aktywności Drosophila
April 30th, 2015
Ten raport opisuje metodę pomiaru aktywności larw Drosophila za pomocą TriKinetics Drosophila Activity Monitor. Urządzenie wykorzystuje wiązki podczerwieni do wykrywania ruchów do 16 pojedynczych zwierząt. Dane mogą być analizowane w celu przedstawienia parametrów ruchu, w tym szybkości i pozycji zwierząt w komorach testowych.
Ogólnym celem tej procedury jest analiza aktywności larw bez użycia skomplikowanego oprogramowania do analizy wideo. Osiąga się to poprzez najpierw przeniesienie wybranych larw do filtra siatkowego w celu usunięcia zanieczyszczeń. Następnie pojedyncze larwy są przenoszone do probówek, gdzie są zabezpieczane zatyczkami ślimakowymi, które są umieszczane w monitorze aktywności drosophila lub urządzeniu zaporowym.
Po trzech do pięciu minutach aklimatyzacji pobierane są nagrania z systemu DAM w celu analizy. Ostatecznie zmierzone ruchy larw przez matkę mogą być wykorzystane do analizy różnych parametrów aktywności dla danego genotypu. Jedną z zalet tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że jest zautomatyzowana i obiektywna.
Chociaż jest wystarczająco prosty do rutynowych pomiarów aktywności, wiele laboratoriów posiada już niezbędny sprzęt, który można łatwo dostosować do stosowania na larwach. Procedurę zademonstruje Aiden McFarlin, student studiów licencjackich z mojego laboratorium. Protokół ten wykorzystuje wielowiązkowe urządzenie monitorujące aktywność M five Drosophila lub tamę.
Aby ustawić zaporę. Najpierw podłącz monitor do zasilacza lub PSIU za pomocą telefonicznego CAB six. Następnie podłącz zasilacz PSIU do gniazdka elektrycznego.
Zielone światło wskaże odpowiednie połączenie. Po trzecie, podłącz PSIU za pomocą USB do komputera w celu nagrania danych. Teraz zainstaluj i otwórz program DAM system MB one V six X na komputerze.
Po otwarciu oprogramowanie automatycznie rozpoczyna rejestrowanie danych w kontrolce oprogramowania. Dla zapory ustaw żądany interwał nagrywania. Wybierz preferencje, a następnie kliknij powyżej lub poniżej opcji interwału odczytu, aby wybrać różne przedziały czasowe, w których dane będą przechowywane.
Istnieje wiele innych parametrów, które można ustawić, znajdujących się w preferencjach i w polu typ danych wyjściowych. Każdy parametr zapewnia unikalną analizę aktywności larwalnej w probówce. Sugeruje się, aby wszystkie parametry zostały wybrane przed zebraniem danych.
Jeśli nie masz pewności, który parametr chcesz zmierzyć Do tego testu przygotuj fiolkę z larwami żerującymi Dla każdego genotypu, który ma być testowany. Użyj standardowego środowiska i pokarmu dla much, aby przygotować probówki testowe. Wlej 4% roztwór świdra na głębokość 1,5 centymetra do szalki Petriego.
Staje się to materiałem zatyczki dla probówki testowej, zbyt gęstym, aby można było się w nim zakopać. Następnie upewnij się, że rurki są czyste i drożne, myjąc je gorącą wodą. Następnie podgrzej wyciskaną butelkę ze 100 mililitrami wody w kuchence mikrofalowej przez 10 do 15 sekund lub do momentu pojawienia się kondensacji.
Następnie odwróć butelkę i delikatnie wyciśnij ciepłe, wilgotne powietrze do probówki testowej. Kiedy na ściance rurki pojawi się cienka warstwa kondensacji, jest ona wystarczająco wilgotna. Następnie wyjmij krążek żelu z naczynia i połóż go na siatkowej powierzchni, do której nie będzie ściśle przylegał.
Aby zebrać larwy, przygotuj filtr siatkowy, rozciągając siatkę nylonową z sitodruku na lejku. Zabezpiecz siatkę na szyjce lejka gumką i umieść lejek w zlewce. Teraz zgarnij szpatułkę pełną pokarmu zawierającego żerujące larwy z butelki hodowlanej i przenieś je do filtra siatkowego.
Zmyj pokarm z larw za pomocą temperatury pokojowej, wody z kranu, pojedyncze larwy można zebrać z siatki za pomocą pędzla. Przenieś larwy na około 1,5 cala do wilgotnej probówki testowej. Następnie uszczelnij rurkę, zatykając ją ślimakiem.
Odbywa się to poprzez dwukrotne wciśnięcie jednego końca tubki w żel, a drugiego końca. Gdy ciśnienie wypchnie jedną z dwóch zatyczek na przeciwległym końcu, podczas ładowania rurek umieść je w zaporze wodnej. Następnie dostosuj położenie każdej rurki tak, aby zwierzę nie mogło wyjść poza zasięg czujników.
Następnie przymocuj rurki do urządzenia za pomocą pierścienia szpachli. Rejestruj aktywność LARVAS w inkubatorze o temperaturze 20 stopni Celsjusza, aby zapobiec niedokładnym odczytom, które mogą wystąpić z powodu cieni, lamp fluorescencyjnych lub zmian temperatury w laboratorium. W inkubatorze.
Podczas nagrywania używaj oświetlenia LED, które nie jest fluorescencyjne. Przed zebraniem danych pozwól larwom zaaklimatyzować się przez pięć minut. Przydatne może być przeprowadzenie próby bez udziału zwierząt, aby upewnić się, że warunki oświetleniowe nie uruchamiają czujników DAM.
Po pięciu minutach uruchom wstępnie skonfigurowane oprogramowanie DAM, aby rozpocząć nagrywanie. Test może trwać 30 minut bez dodatkowej kondensacji lub jedzenia. Istotne jest, aby przed zapisaniem parametr aktywności przeznaczony do analizy został wybrany w preferencjach.
Jeśli ta aktywność nie zostanie wybrana, nie będzie dostępna do analizy post hoc. Po upływie żądanego czasu nagrywania zamknij oprogramowanie DAM, dane są automatycznie zapisywane w folderze danych systemu zapory. Przenieś plik danych do osobnego folderu, aby można go było później przetworzyć.
Probówki testowe można wyczyścić wrzącą wodą w celu ponownego użycia. Aby przetworzyć surowe dane do zrozumiałego formatu, otwórz aplikację do skanowania plików DAM i wybierz. Wybierz folder danych wejściowych, a następnie wybierz folder danych i żądany plik, a następnie wybierz opcję skanowania.
Na koniec wybierz długość pojemnika na żądany okres odczytu. Spowoduje to uporządkowanie surowych danych w parametry ustawione przez operatora. Teraz wybierz typ danych wyjściowych, aby przeanalizować żądane ustawienie ruchu.
Jeśli długość pojemnika jest większa niż wybrany interwał odczytu systemu, przejdź do menu dodatkowych odczytów i wybierz opcję dwie sumy do przedziałów. Następnie zapisz plik pod odpowiednią nazwą w tym samym folderze, do którego zostały przeniesione surowe dane. Korzystając ze standardowego programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych, otwórz zapisany plik.
W zależności od analizowanego typu danych, arkusz kalkulacyjny musi być odczytywany w różny sposób. Zazwyczaj, aby zmierzyć ruchy lub liczenia, okres badania będzie rejestrowany numerycznie, podczas gdy każda pojedyncza rurka odczytu otrzyma wyznaczoną literę. Zwykle kolumny od K do Z reprezentują szczeliny dla probówek testowych, a wiersze reprezentują zebrane punkty danych.
Jeśli, na przykład, ruchy były zbierane przez 20 minut, w ciągu jednej minuty interwały uśredniają 20 wierszy, aby obliczyć średnią liczbę ruchów na minutę i inne pomiary. Przeprowadzono badanie reakcji temperaturowej larw trzeciego stadium rozwojowego szczepu W 1 1 1 8 przy użyciu urządzenia monitorującego w celu wykrycia różnic w larwach i lokomocji. W siedmiu różnych temperaturach każda larwa była analizowana przez 20 minut.
Wyraźnie widać, że larwy stawały się znacznie bardziej aktywne w miarę nagrzewania się środowiska. Dla porównania, przebadano hipoaktywnego mutanta szczepu W 1 1 18 zwanego nieaktywnym. Analiza wykazała, że nieaktywne larwy były znacznie mniej ruchliwe niż grupa kontrolna w celu zbadania granic wykrywalności testu.
Porównano larwy w różnych stadiach, podczas gdy larwy gwiaździste są znacznie mniejsze niż trzecie. Aktywność pierwszej i drugiej larwy gwiazdy była rzeczywiście wykrywalna i mierzalna, biorąc pod uwagę zmiany aktywności w czasie w urządzeniu. Stwierdzono, że aktywność trzeciej części larw gwiaździstych w każdej minucie 20-minutowego testu pozostawała względnie stała.
Po opanowaniu, protokół ten zapewnia dokładną, prostą i opłacalną metodę oceny podstawowych parametrów aktywności larwalnej w różnych warunkach eksperymentalnych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To raport opisuje metodę pomiaru aktywności larw Drosophila za pomocą monitora aktywności Drosophila TriKinetics. Urządzenie wykorzystuje wiązki podczerwieni do wykrywania ruchów do 16 pojedynczych zwierząt, umożliwiając analizę parametrów ruchu, w tym szybkości i pozycji w komorach testowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza zachowań
- Genetyka
Tło
- Analiza aktywności larw jest kluczowa dla zrozumienia wpływów genetycznych na zachowanie.
- Tradycyjne metody często wymagają złożonego oprogramowania do analizy wideo.
- Monitor aktywności Drosophila TriKinetics oferuje prostszą alternatywę.
- Ta metoda pozwala na obiektywne i zautomatyzowane zbieranie danych.
Cel badania
- Aby efektywnie mierzyć aktywność larw Drosophila.
- Aby zapewnić metodę, która eliminuje potrzebę skomplikowanych analiz wideo.
- Aby analizować różne parametry aktywności dla różnych genotypów.
Stosowane metody
- Przenieść wybrane larwy na sitko do oczyszczenia z zanieczyszczeń.
- Zabezpieczyć pojedyncze larwy w probówkach testowych za pomocą kołków ślimaka.
- Włożyć probówki do monitora aktywności Drosophila (DAM).
- Rejestrować ruchy larw po 3-5 minutowej okresie aklimatyzacji.
Główne wyniki
- Zautomatyzowane rejestracji ruchów larw zostały pomyślnie uzyskane.
- Analiza danych ujawniła różne parametry aktywności.
- Metoda okazała się obiektywna i wydajna.
- Wyniki mogą być wykorzystane do porównania aktywności różnych genotypów.
Wnioski
- Monitor DAM TriKinetics zapewnia niezawodną metodę pomiaru aktywności larw.
- Ta technika poprawia zdolność badania wpływów genetycznych na zachowanie.
- Przyszłe badania mogą wykorzystywać tę metodę do szerszych zastosowań w neuronaukach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables automated, objective measurement of Drosophila larval locomotion using an adapted TriKinetics activity monitor, providing a scalable, cost-effective alternative to video-based behavioral assays. By delivering quantitative movement data across genotypes and environmental conditions, it supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in neurobehavioral discovery pipelines. The method enhances predictive confidence in larval phenotype screening by standardizing activity readouts for high-throughput genetic or pharmacological studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying larval activity changes across genotypes, supporting functional target validation.
- Operational Value: Provides automated, reproducible locomotion metrics that reduce variability and increase confidence in early phenotypic screening.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through standardized, high-resolution activity readouts that correlate with neural circuit function.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated larval activity measurements for downstream compound screening by establishing baseline locomotion parameters.
- Scalability: Supports parallel monitoring of up to 16 individual larvae per run, enabling medium-throughput screening workflows.
- Data Compatibility: Outputs are compatible with standard spreadsheet and graphing software, streamlining data integration into existing analytics pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Larval activity serves as a disease-relevant system for modeling neurodevelopmental and neurodegenerative conditions.
- Translational Continuity: Enables seamless transition from discovery to preclinical validation by maintaining consistent behavioral readouts across model systems.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying hyper- or hypoactivity phenotypes with statistical rigor.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows as a phenotypic screening tool for target validation, bridging genetic manipulation to quantifiable behavioral output before lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring larval locomotion as a functional readout of gene or drug effects on neural activity.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible activity data with minimal operator bias, enhancing screening reliability.
- Analytics: Generates quantitative outputs such as move counts and positional data, enabling statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity by using larval behavior as a translatable biomarker for neural function in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Leverages existing DAM infrastructure, positioning the method as a reusable platform across multiple projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through objective behavioral quantification.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across labs by eliminating subjective video analysis.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by repurposing existing equipment and reducing reliance on specialized imaging resources.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets based on robust, quantifiable phenotypic profiles.
Implementation Considerations
- Requires basic expertise in Drosophila handling and behavioral assay setup.
- Depends on access to a TriKinetics DAM system and compatible data analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of assay conditions, including temperature, humidity, and lighting.
- Involves adaptation considerations for different larval stages and genetic backgrounds.
- Limited to measuring gross locomotion and position preference; not suitable for complex sub-behavioral analysis without modification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:11
Setting Up the DAM Software
2:34
Preparations
3:42
Setting Up the Assay
4:56
Measuring Locomotion
6:18
Preparing and Processing the Data
7:57
Temperature Regulation of Locomotion, Locomotion of Mutant Larvae, Locomotion at Three Instar Stages and Consistency of Locomotion
9:04
Conclusion
