Metody in vivo i ex vivo do badania przerzutowej kolonizacji raka jajnika struktur mlecznej w tkance tłuszczowej otrzewnej

Ogólnym celem tej procedury jest wykazanie zastosowania standardowych technik do ilościowego oznaczania kolonizacji otrzewnowych magazynów tłuszczowych w wyniku raka jajnika. Osiąga się to poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie komórek raka jajnika myszom po uśmierceniu myszy w określonych punktach czasowych. Magazyny tłuszczu otrzewnowego są identyfikowane i izolowane od myszy.

Na koniec liczbę komórek raka jajnika obecnych w określonych magazynach tłuszczowych określa się ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Oprócz badań opartych na mechanizmach, kolonizację komórek raka jajnika można również badać w kohodowli ex vivo, po której następuje odpowiednia analiza ilościowa i/lub molekularna. Ostatecznie te podejścia in vivo i ex vivo umożliwiają zbadanie procesów zaangażowanych w kolonizację komórek raka jajnika w tłuszczu otrzewnej za pomocą metod jakościowych lub ilościowych.

Główną zaletą tego podejścia jest to, że jesteśmy w stanie wdrożyć standardowe techniki oceny poszczególnych etapów przerzutowej kolonizacji tkanki tłuszczowej otrzewnej w raku komórki. Implikacje tej techniki rozszerzają zapobieganie przerzutom. W szczególności umożliwia identyfikację interakcji mikrośrodowiskowych komórek nowotworowych, które regulują rozrost komórek raka jajnika w obrębie komórek odpornościowych zawierających struktury znane jako mleczne plamki.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie uznają za pomocne doświadczenie w obchodzeniu się z myszami. Chociaż wstrzyknięcia dootrzewnowe są pozornie proste, brak dobrej techniki może prowadzić do niedokładnych danych. Co więcej, dysocjacja tkanek do zawiesiny pojedynczej komórki wymaga praktyki i skrupulatnego planowania przed rozpoczęciem eksperymentu.

Ta szczególna technika nie wymaga, aby zwierzęta były pod narkozą. Zgodnie z zatwierdzonymi protokołami należy wykonywać tę technikę na żywych zwierzętach. Załaduj 500 mikrolitrów fluorescencyjnie znakowanej zawiesiny jednokomórkowej do strzykawki.

Następnie umieścić strzykawkę w sterylnej igle z nasadką 25G, aby zmniejszyć ścinanie komórek przed wstrzyknięciem. Przytrzymując mysz drugą ręką, podnieś mysz za kark i przytrzymaj ogon za pomocą dłoni i palca wskazującego. Następnie przymocuj lewą tylną nogę między palcem serdecznym a małym, aby uniknąć urazu narządów jamy brzusznej.

Należy dobrze przytrzymać mysz, aby nie mogła się poruszać podczas wstrzykiwania. Wyobraź sobie linię w poprzek brzucha i zlokalizuj punkt po prawej stronie zwierzęcia i blisko linii środkowej. Punkt wejścia jest czaszkowy drugi i lekko przyśrodkowy ostatniego sutka.

Przygotuj się do wkłucia igły po prawej stronie myszy, aby uniknąć jelita ślepego i zmniejszyć ryzyko przebicia jelit. Wbij igłę w dolną boczną część brzucha myszy na głębokość około 0,5 centymetra. Odciągnąć tłok, aby upewnić się, że igła nie przebiła się przez naczynie krwionośne lub inne narządy otrzewnej.

Jeśli płyn nie jest zasysany, należy wstrzyknąć próbkę pod powolnym, stałym ciśnieniem. Następnie wyjmij igłę i umieść mysz z powrotem w klatce. Nie należy ponownie zamykać strzykawki przed wyrzuceniem jej do pojemnika na ostre przedmioty.

Poświęć myszy w określonych punktach czasowych po wstrzyknięciu w celu usunięcia ważnych narządów. Zgodnie z opisem w protokole tekstowym pobranie depitorów tłuszczu otrzewnowej stanowi usunięcie narządów wewnętrznych. Wykonaj nacięcie w linii środkowej w pobliżu pachwinowego papki przez ścianę otrzewnej, aby odsłonić narządy wewnętrzne w celu wycięcia tłuszczu omentalnego.

Odsłoń kompleks trzustkowy poprzez przedłużenie śledziony z jamy otrzewnej za pomocą kleszczy dla tłuszczu gonadalnego. Użyj kleszczy, aby podnieść tłuszcz gonad otaczający jajniki i wyciąć go, przecinając połączenia tkankowe. Natychmiast. Umieść chusteczki w lodowatym PBS.

Następnie usuń tłuszcz z macicy za pomocą kleszczy, aby podnieść tłuszcz maciczny otaczający rogi macicy i wyciąć, przecinając połączenia tkankowe przed natychmiastowym umieszczeniem tkanek w lodowatym PBS. Podczas uzyskiwania tłuszczu krezkowego przetnij połączenie między jelitem cienkim a odźwiernikiem. Użyj kleszczy, aby mocno chwycić wolny koniec jelita cienkiego i powoli oderwać go od tłuszczu krezkowego.

Uwolnij tłuszcz krezkowy z korzenia krezki za pomocą nożyczek preparujących. Następnie natychmiast umieść chusteczki w lodowatym PBS. Na koniec, aby usunąć tłuszcz wrotny pleo, podnieś dystalny koniec śledziony za pomocą kleszczy, aby odsłonić cienki pas tłuszczowy tkanki, łączący wnękę śledziony z trzustką.

Wytnij tłuszcz z pleo portalu, najpierw uwalniając go z trzustki, a następnie ostrożnie wycinając go ze śledziony. Następnie natychmiast umieść tkanki w PBS, aby rozpocząć ważenie. Dopasuj całą tkankę tłuszczową do sieci tkanki tłuszczowej.

Przenieść tkanki do oddzielnych pięciomililitrowych probówek zawierających 1,5 mililitra ECCO wolnych od surowicy, zmodyfikowanej pożywki orłów lub DMEM i 0,1% albuminy surowicy bydlęcej. Połącz tkanki pobrane od trzech niezależnych myszy, aby zapewnić wystarczającą wydajność komórek do cytometrii przepływowej. Następnie zmiel tkanki za pomocą nożyczek chirurgicznych i dodaj 1,5 mililitra wolnego od surowicy DMEM zawierającego 0,4% kolagenazy.

Inkubować zawiesinę tkankową w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, z mieszaniem rotacyjnym jako opcjonalnym krokiem. Dalej dysocjuj tkankę przez przeżuwanie. W takim przypadku przenieś zawiesinę kolagenazy tkankowej do mikrożołądka lub worka i przeżuwaj przez 10 minut na niskim poziomie, obracając orientację worków po pięciu minutach.

Następnie przefiltruj próbki przez nylonowy filtr siatkowy, aby usunąć duże zanieczyszczenia. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 250 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić frakcję sklarowaną nad osadem. Zawiesić osad komórkowy w 100 mikrolitrach PBS w połączeniu z 900 mikrolitrami chlorku amonu, lizą potasu, buforem i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.

Następnie ponownie odwiruj komórki jak poprzednio i wyrzuć supernatant po resus, zawieszając osad komórkowy w 250 mikrolitrach lodowatego PBS, przefiltruj próbki przez nylonową siatkę o grubości 60 mikronów, aby zapewnić zawieszenie pojedynczej komórki. Następnie przepłucz filtr 250 mikrolitrami lodowatego PBS, wyhoduj i przygotuj fluorescencyjnie oznakowane komórki i resus. Zawiesić w stężeniu 2 milionów komórek na mililitr.

Nałóż około sześciu mikrolitrów kleju tkankowego na błonę kultury. Włóż i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie dwukrotnie umyj membranę sterylną wodą, aby usunąć nadmiar kleju Przed wysuszeniem membran na powietrzu pod kapturem laminarnym, ostrożnie wyciąć OA i przymocować go do membrany pokrytej klejem za pomocą sterylnych kleszczy.

Po pozostawieniu tkanki do przylegania do błony przez jedną minutę, dodaj 500 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na wierzch każdej sieci w każdej wkładce hodowlanej. Następnie wypełnij obszar wokół komory transwell 2,5 mililitra pożywki DMEF 12. Inkubować chorobę zwyrodnieniową stawów z zawiesiną komórkową przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w środowisku 5% CO2.

Ostrożnie usunąć i umyć chorobę zwyrodnieniową stawów około 10 mililitrami PBS. Na koniec uwidocznij ogniska fluorescencyjnych komórek rakowych za pomocą odpowiedniego systemu obrazowania fluorescencyjnego. Względne lokalizacje magazynów tłuszczowych otrzewnej można zobaczyć za pomocą grubego rozwarstwienia anatomicznego.

Pokazane tutaj jest bliższe przyjrzenie się portalowi Pleo i omentalnej tkance tłuszczowej. Względne rozmiary wyciętych składów tłuszczu są pokazane tutaj. Plamki mleczne obserwuje się w tkance tłuszczowej omental i pleo portal za pomocą standardowej histologii.

Przedstawiono wyniki ilościowe analizy przepływu w różnych magazynach tłuszczu otrzewnowego. Kryteria bramkowania dla analiz są przedstawione tutaj. Komórki rodzicielskie Ideate wykorzystano jako kontrolę negatywną.

Preparaty tkanek psychicznych zawierały znaczną populację komórek pomidorowo-dodatnich TD w stosunku do tkanki tłuszczowej macicy i tłuszczu gonadalnego. W ilościowej cytometrii przepływowej dane są wyrażone jako średni wzrost zmiany krotności pozytywnych zdarzeń pomidora TD w porównaniu z myszami, którym wstrzyknięto PBS in vivo i kolonizację ex vivo OA przez SKV trzy, IP jedna komórka raka jajnika GFP jest pokazana tutaj. Obrazowanie fluorescencyjne całej choroby zwyrodnieniowej stawów wykazało podobne wzorce kolonizacji lokalizacji komórek nowotworowych zarówno w testach in vivo, jak i ex vivo.

Badania histologiczne tych tkanek potwierdziły obecność komórek nowotworowych zlokalizowanych w mlecznych plamach. Wreszcie, immunohistochemiczne wykrycie cytokeratyny wyrażonej przez komórki SKO V three IP one GFP potwierdza te wyniki histologiczne. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zidentyfikowaniu i dokładnym wycięciu tkanki tłuszczowej otrzewnej oraz zapobieganiu zanieczyszczeniu przez inne typy tkanek, które z kolei zniekształcą dane ilościowe uzyskane z cytometrii przepływowej.

Po drugie, ważne jest, aby pamiętać o doborze odpowiednich szczepów do danego badania. Technika ta może być wykorzystana do identyfikacji interakcji dobrze ugruntowanych linii komórkowych raka jajnika w mikrośrodowisku sieci komórkowej, które są ważne dla tworzenia przerzutów. Może być również wykorzystany do oceny potencjału złośliwego linii komórkowych, które modelują wczesne zmiany chorobowe obserwowane w jajowodach.