Name: In vivo (in vivo) Ocena pasożytytemii zarodźca gryzoni i inwazji merozoitu za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do oceny inwazji merozoitu i pasożytytemii w modelu malarii u myszy. Ta technika pozwala precyzyjnie mierzyć dynamikę zakażenia Plasmodium in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy za wsparcie finansowe od Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (APP605524 grantów, 490037 i 1047082), Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (grant DP12010061), Narodowej Strategii Infrastruktury Badawczej Australii oraz funduszu inwestycyjnego Edukacji z Departamentu Innowacji, Przemysłu, Nauki i Badań. PML jest laureatem australijskiej nagrody podyplomowej.

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z polityką Uniwersytetu Macquarie i były zgodne z australijskim kodeksem postępowania Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC). Praca została wykonana na podstawie umowy o nazwie Ethics No ARA 2012/017 zatwierdzonej i uzyskanej od Komisji ds. Etyki Zwierząt na Uniwersytecie Macquarie. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na myszach SJL/J, chyba że zaznaczono inaczej.
1. Myszy i eksperymentalne zakażenie malarią
<ol>
	<li>Myszy domowe w kontrolowanej temperaturze (21 °C) z cyklem jasno-ciemnym trwającym 12:12 godzin.</li>
	<li>Rozmrozić podwielokrotność kriokonserwowanego P. chabaudi adami DS z 5% pasożytniczymi krwinkami czerwonymi (pRBC) i wstrzyknąć 200 μl do jamy otrzewnowej myszy dawcy C57BL/6.</li>
	<li>Monitorować pasożytniczą mysz dawcę co 1 - 2 dni za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano w sekcji 3 - 4 niniejszego protokołu. Gdy dawca osiągnie 5 - 15% parazytemii, należy pobrać krew przez nakłucie serca w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Odessać 100 μl roztworu heparyny (300 j./ml heparyny w mysim roztworze Ringera (MTR) (154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2,2 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 10 mM glukozy, 30 U/ml heparyny, pH 7,4, filtr 0,22 μM sterylizowany)) do strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 26 G.</li>
		<li>Znieczulij mysz przez inhalację 5% izofluoranem, potwierdzając pożądaną głębokość znieczulenia przez brak reakcji wycofania pedału i odruchów rogówkowych.</li>
		<li>Umieść mysz na boku i prostopadle wbij igłę tuż poniżej łokcia, przez żebra i do serca. Powoli wyciągnąć tłok strzykawki i obracać igłę aż do uzyskania 0,5 - 1 ml krwi.</li>
		<li>Przeprowadzić humanitarną eutanazję przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć liczbę pRBC na objętość krwi dawcy, przyjmując morfologię krwi 9 x 106 RBC/μl (tj. jeśli dawca miał 10% parazytemii w momencie uśmiercenia, krew będzie zawierała 9 x 105 pRBC/μl). Rozcieńczyć spasożytowaną krew w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Krebsa (126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM NaH2PO4, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 0,2% glukozy, pH 7,2, 0,22 μM wysterylizowany filtrem) tak, aby stężenie wynosiło 1 x 104 pRBC na 200 μl i wstrzyknąć 200 μl do jamy wewnątrzotrzewnowej myszy wymaganych do eksperymentu znakowania RBC i transfuzji.</li>
	<li>Monitorować parazytemię co 1 - 2 dni za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano w sekcjach 3 - 4 niniejszego protokołu.</li>
</ol>
2. Etykietowanie krwinek czerwonych i transfuzji
<ol>
	<li>Pobrać heparynizowaną krew od myszy przez nakłucie serca zgodnie z opisem w kroku 1.3 i umieścić na lodzie. Utrzymuj krew w temperaturze 4 °C przez cały czas. Pobrać około 200 μl krwi na mysz do wstrzyknięcia. W razie potrzeby podziel krew na dwie próbki i potraktuj jedną próbkę zgodnie z potrzebami. 
	UWAGA: W ten sposób inwazję próbki poddanej działaniu środka można porównać do próbki kontrolnej, niepoddanej działaniu substancji (schemat znajduje się na rysunku 1).</li>
	<li>Przygotuj 2x roztwór każdej fluorescencyjnej etykiety RBC.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy 2 mg/ml Atto 633-N-hydroksysukcynimidu (Atto 633-NHS) w MTR tak, aby stężenie wynosiło 20 μg/ml.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy N-hydroksysukcynimidu biotyny (Biotin-NHS) o stężeniu 25 mg/ml w MTR, tak aby stężenie wynosiło 250 μg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podziel próbki krwi na dwie probówki i dodaj równą objętość 2x roztworu Atto 633-NHS do jednej probówki i równą objętość 2x Biotin-NHS do drugiej probówki. Natychmiast wymieszaj. Inkubować krew w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę przy ciągłym powolnym mieszaniu lub alternatywnie mieszać próbkę co 10-15 minut.</li>
	<li>Przemyć znakowaną krew 3 razy za pomocą MTRC (MTR + 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), filtr 0,22 μM sterylizowany) w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Dodać co najmniej 2 objętości MTRC, odwirować przy 750 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w co najmniej 2 objętościach MTRC. Powtórz jeszcze 2 razy.</li>
		<li>Po ostatnim przemyciu odwirować przy 750 x g przez 5 minut i połączyć granulowaną krew w różne kombinacje (tj. niepoddane działaniu Atto 633 / biotyna poddana działaniu środka / biotyna poddana działaniu środka / poddane działaniu Atto 633). Dodać MTR, aby uzyskać objętość 200 μl na mysz do wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknąć znakowaną krew donaczyniowo myszom zakażonym malarią gryzoni lub niezakażonym kontrolom w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Wykonaj transfuzję przy 2 - 15% parazytemii w szczytowym momencie schizogonii pasożytów. 
		UWAGA: dzieje się to mniej więcej w połowie cyklu ciemności (tj. między 12 a 2 w nocy w normalnym cyklu światła lub 12 - 2 po południu w odwróconym cyklu światła).</li>
		<li>Ogrzej myszy za pomocą lampy grzewczej przez 5-10 minut, aby zwiększyć przepływ krwi, ale podejmij środki ostrożności, aby nie przegrzać myszy. Umieść myszy w urządzeniu krępującym i wstrzyknij donaczyniowo 200 μl znakowanej krwi (około 1 - 2 x 109 RBC) przez żyłę ogonową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobrać próbki krwi w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu, jak opisano w punkcie 3. 
	UWAGA: wskaźniki inwazji można określić ilościowo w czasie krótszym niż 10 minut po wstrzyknięciu, w zależności od parazytemii myszy biorcy.</li>
</ol>
3. Pobieranie próbek krwi i przygotowanie do cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przygotować 50 μl roztworu barwiącego na próbkę, plus dodatkowo, w dniu doświadczenia w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Rozmrozić podwielokrotność 6 mM JC-1 przechowywaną w temperaturze -20 °C w dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
		<li>Podgrzać 50 μl MTRC na próbkę plus dodatkowo do temperatury 37 °C.</li>
		<li>Ciągle wirując wstępnie podgrzany MTRC, dodaj JC-1, aby końcowe stężenie wynosiło 12 μM. Ma to na celu ograniczenie tworzenia się agregatów JC-1; Jeśli tworzą się agregaty, nie należy odwirowywać probówki, ponieważ zapobiegnie to plamom. 
		UWAGA: Niewielka ilość agregacji nie ma wpływu na wyniki.</li>
		<li>Dodać anty-CD45 APC eFluor 780 i anty-CD71 PerCP eFluor 710 tak, aby końcowe stężenie wynosiło 1 μg/ml. W przypadku wykonywania znakowanego eksperymentu z krwinkami czerwonymi należy dodać streptawidynę PE-Cy7 tak, aby końcowe stężenie wynosiło 1 μg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj krwawienie z ogona poprzez amputację czubka ogona lub uszkodzenie naczynia krwionośnego w ogonie. Umieść kroplę krwi z ogona na małej łodzi do ważenia lub szklanym szkiełku. Po pobraniu krwi należy upewnić się, że krwawienie ustało. Pobrać pipetą 3 μl krwi z ogona do 50 μl roztworu barwiącego podgrzanego do temperatury 37 °C i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Rozmrozić podwielokrotność 4 mM Hoechst 33342 przechowywaną w temperaturze -20 °C w wodzie destylowanej (w przypadku lasera 355 nm) lub 2 mM Hoechst 34580 przechowywaną w temperaturze -20 °C w wodzie destylowanej (w przypadku stosowania lasera 405 nm). Przygotować 500 μl na próbkę, plus dodatkowo, odpowiednio 4 μM lub 2 μM roztworu Hoechst w MTRC.</li>
	<li>Dodać 500 μl 4 μM Hoechst 33342 lub 2 μM Hoechst 34580 do próbek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 750 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant, dodać 700 μl MTRC i przeanalizować metodą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
4. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Analizuj próbki za pomocą lasera 355/488/633 nm lub przyrządu laserowego 405/488/633 nm.</li>
	<li>Przefiltrować próbki przez sitko do komórek 35 μM bezpośrednio przed analizą. Przepłukać sitko komórkowe wodą destylowaną między próbkami i użyć ponownie.</li>
	<li>Rejestruj wystarczającą liczbę zdarzeń, aby najmniejsza populacja zawierała co najmniej 500 zdarzeń (zwykle 1 000 000 - 10 000 000 całkowitych zdarzeń na próbkę).</li>
	<li>Wzbudz Hoechst 33342 za pomocą lasera 355 nm i wykryj zdarzenia przez filtr 460/50. Wzbudz Hoechst 34580 za pomocą lasera 405 nm i wykryj zdarzenia przez filtr 460/50. Wzbudz JC-1, anty-CD71 PerCP eFluor 710 i Streptawidynę PE-Cy7 za pomocą lasera 488 nm i wykryj zdarzenia odpowiednio przez filtr 530/40, 692/40 i 750LP. Wzbudzić Atto 633 i anty-CD45 APC eFluor 780 za pomocą lasera 633 nm i wykryć zdarzenia odpowiednio przez filtr 670/30 lub 750LP.</li>
	<li>Wykonaj analizę i kompensację za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Wybierz całe komórki i wyklucz szum, zanieczyszczenia i płytki krwi na podstawie właściwości FSC/SSC (ryc. 2A). Wybierz pojedyncze komórki na podstawie szerokości impulsu wyzwalającego (rysunek 2B) lub przy użyciu stosunku powierzchni piku do wysokości piku FSC (rysunek 2C).</li>
		<li>Wybierz dojrzałe erytrocyty i wyklucz progenitory RBC i leukocyty, na podstawie ujemnej fluorescencji w kanałach PerCP eFluor 710 i APC eFluor 780 (figura 2D).</li>
		<li>Jeśli wykonujesz eksperyment znakowanych RBC, wybierz każdą populację znakowanych RBC na podstawie fluorescencji PE-Cy7 i Atto 633 i przeanalizuj je osobno (Figura 3A).</li>
		<li>Wybierz pRBC na podstawie dodatniej fluorescencji zarówno dla JC-1, jak i Hoechst (Figura 2E-H).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Obliczenia i statystyki
<ol>
	<li>Oblicz parazytemię, dzieląc liczbę pRBC przez całkowitą liczbę RBC (tj. liczbę zdarzeń w bramce Q2 podzieloną przez liczbę zdarzeń w bramce G4). Podczas przeprowadzania testu inwazji parazytemię dwóch znakowanych populacji można obliczyć, dzieląc liczbę znakowanych pRBC przez liczbę znakowanych erytrocytów w tej populacji (tj. liczbę zdarzeń, które występują w obu bramkach L1 i Q2, podzieloną przez liczbę zdarzeń w bramce L1). 
	UWAGA: Oznaczona parazytemia różni się znacznie w zależności od czynników, takich jak endogenna parazytemia i liczba krążących merozoitów. Z tego powodu pomocne jest podanie współczynnika parazytemii, który jest obliczany jako parazytemia w leczonej populacji znakowanej podzielona przez parazytemię w populacji znakowanej kontrolnie w każdej pojedynczej myszy. Aby skorygować możliwe efekty barwnika, podaj wyniki jako średni stosunek parazytemii w dwóch kombinacjach barwników.</li>
	<li>Określ istotność statystyczną wskaźników za pomocą testu t dla jednej próby, gdzie 1 jest hipotetyczną średnią.</li>
</ol>

<ol><li>Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+malaria+parasite-infected+blood+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry.</a> Cytometry. 4 (3), 228-237 (1983).</li>
<li>Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum%3A+rapid+quantification+of+parasitemia+in+fixed+malaria+cultures+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry.</a> Exp Parasitol. 62 (2), 275-282 (1986).</li>
<li>Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange%3A+a+new+dye+for+Plasmodium+species+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis.</a> Cytometry. 8 (6), 568-570 (1987).</li>
<li>Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+hydroethidine+and+flow+cytometry+to+assess+the+effects+of+leukocytes+on+the+malarial+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 2 (4), 417-425 (1995).</li>
<li>Pattanapanyasat, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+malaria+parasites+in+two+different+red+blood+cell+populations+using+biotin+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry.</a> Cytometry. 25 (3), 287-294 (1996).</li>
<li>Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+Plasmodium+falciparum+growth+and+development+by+UV+flow+cytometry+using+an+optimized+Hoechst-thiazole+orange+staining+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy.</a> Cytometry A. 73 (6), 546-554 (2008).</li>
<li>Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adaptable+two-color+flow+cytometric+assay+to+quantitate+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites.</a> Cytometry A. 77 (11), 1067-1074 (2010).</li>
<li>Bei, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometry-based+assay+for+measuring+invasion+of+red+blood+cells+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum.</a> Am J Hematol. 85 (4), 234-237 (2010).</li>
<li>Clark, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBC+barcoding+allows+for+the+study+of+erythrocyte+population+dynamics+and+P.+falciparum+merozoite+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion.</a> PLoS One. 9 (7), e101041(2014).</li>
<li>Malleret, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+robust+tri-color+flow+cytometry+assay+for+monitoring+malaria+parasite+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development.</a> Sci Rep. 1 (118), (2011).</li>
<li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+Plasmodium-infected+erythrocytes+in+murine+models+of+malaria+by+flow+cytometry+using+bidimensional+assessment+of+SYTO-16+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence.</a> Cytometry A. 75 (3), 225-235 (2009).</li>
<li>Jimenez-Diaz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+detection+specificity+of+Plasmodium-infected+murine+erythrocytes+by+flow+cytometry+using+autofluorescence+and+YOYO-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1.</a> Cytometry A. 67 (1), 27-36 (2005).</li>
<li>Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+Plasmodium+parasitemia+by+flow+cytometry+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Korean+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy.</a> J Korean Med Sci. 27 (10), 1137-1142 (2012).</li>
<li>Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometric+assay+to+quantify+invasion+of+red+blood+cells+by+rodent+Plasmodium+parasites+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo.</a> Malar J. 13 (1), 100(2014).</li>
<li>Morohashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+abnormalities+in+the+spleen+of+an+mFtz-F1+gene-disrupted+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse.</a> Blood. 93 (5), 1586-1594 (1999).</li>
<li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+platelet+abnormalities+in+Berkeley+sickle+cell+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice.</a> Blood Cells Mol Dis. 41 (1), 109-118 (2008).</li>
<li>Duraisingh, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+of+Plasmodium+falciparum+merozoite+proteins+directs+receptor+targeting+for+invasion+of+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes.</a> EMBO J. 22 (5), 1047-1057 (2003).</li>
<li>Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+field+isolates+commonly+use+erythrocyte+invasion+pathways+that+are+independent+of+sialic+acid+residues+of+glycophorin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A.</a> Infect Immun. 67 (11), 5784-5791 (1999).</li>
<li>Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+switching+mechanism+in+the+invasion+of+erythrocytes+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum.</a> J Clin Invest. 86 (2), 618-624 (1990).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisaliśmy metodę pomiaru zarówno parazytemii, jak i inwazji merozoitu w próbkach in vivo . Jeśli chodzi o pomiar parazytemii, metoda ta ma przewagę nad poprzednimi metodami10-13 w tym, że HJ-RBC można odróżnić od pRBC, zmniejszając w ten sposób liczbę zdarzeń fałszywie dodatnich. Podczas gdy HJ-RBC są zwykle rzadkie u ludzi, niektóre badania donoszą o wysokich poziomach u myszy15,16 , co sprawia, że rozróżnienie między tymi komórkami a pRBC jest ważne dla dokładnego pomiaru parazytemii gry...

Objawy kliniczne związane z malarią występują podczas bezpłciowego cyklu replikacyjnego pasożyta Plasmodium w czerwonych krwinkach (RBC). Merozoity, uwalniane w wątrobowej fazie infekcji, szybko przyczepiają się do erytrocytów i atakują je. Po dostaniu się do komórki pasożyt rośnie i dojrzewa, ostatecznie ulegając schizogonii, rozszczepianiu komórki i uwalnianiu skupiska nowo powstałych merozoitów, które powtarzają ten cykl. W związku z tym ocena zakażenia malarią często obejmuje monitorowanie zarówno parazytemii, czyli odsetka erytrocytów zawłaszczonych przez jednego lub więcej pasożytów, jak i wskaźnika inwazji merozoitu do niezakażonych erytrocytów. 
Cytometria przepływowa to potężne narzędzie, które może być użyte do rejestrowania właściwości ogromnej liczby komórek w krótkim czasie. Technika ta ma wyraźne zastosowanie w pomiarze parazytemii malarii i inwazji malarii i oferuje kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi technikami mikroskopii. Należą do nich dokładny pomiar bardzo niskiej parazytemii, który byłby zbyt czasochłonny przy użyciu mikroskopii, bezstronny charakter pomiaru oraz możliwość jednoczesnego pomiaru wielu parametrów komórek. Cytometria przepływowa jest szeroko stosowana do określania zarówno parazytemii, jak i inwazji merozoitu w hodowli in vitro 1-9, jednak techniki pomiaru tych parametrów in vivo są słabiej rozwinięte i mogą być skomplikowane ze względu na obecność dodatkowych typów komórek, które zakłócają analizę. Nie opisano żadnych testów do pomiaru inwazji in vivo i chociaż istnieją testy do analizy parazytemii in vivo, brakuje im zdolności do rozróżnienia między pasożytniczymi erytrocytami (pRBC) a erytrocytami zawierającymi ciała Howella-Jolly'ego (HJ-RBCs)10-13. Ta ostatnia kwestia jest szczególnie ważna, ponieważ u myszy HJ-RBC mogą stanowić do 0,9% dojrzałych RBC14-16, uniemożliwiając w ten sposób dokładny pomiar niskiej parazytemii. 
Wcześniej zademonstrowaliśmy podejście do pomiaru pasożytydemii i inwazji merozoitu w modelu zakażenia malarią u gryzoni14. Tutaj udostępniamy bardziej szczegółowy protokół i towarzyszące mu wideo. Podejście to opiera się na poprzednich metodologiach i pozwala na dokładną identyfikację pasożytniczych erytrocytów, w odróżnieniu od leukocytów, progenitorów RBC i HJ-RBC. Ponadto test ten umożliwia jednoczesny pomiar inwazji merozoitu na dwie znakowane populacje RBC, populację traktowaną lub docelową i populację kontrolną, zapewniając w ten sposób solidną platformę do oceny inwazji na różne typy komórek.

<table><tbody><tr><td>bisBenzimide H 33342 trichlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Hoechst 33342. Przechowywać roztwór podstawowy o stężeniu 4 mM w temperaturze -20 stopni Celsjusza. C w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Hoechst 34580</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63493</td><td>Przechowywać roztwór podstawowy 2 mM w temperaturze -20 & stopni; C w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>JC-1 Dye</td><td>Life Technologies</td><td>T-3168</td><td>Przechowywać małe porcje 6 mM roztworu podstawowego w temperaturze -20 & stopni; C w DMSO</td></tr><tr><td>, Anti-Mouse CD45, APC-eFluor 780</td>, <td>eBioscience</td><td>47-0451-80</td>, <td>Clone 30-F11</td></tr>, <tr><td>Anti-Mouse CD71, PerCP-eFluor 710</td>, <td>eBioscience</td><td>46-0711-80</td>, <td>Clone: R17217</td></tr>, <tr><td>Atto 633, NHS ester</td>, <td>Sigma-Aldrich</td>, <td>1464</td>, <td>Atto 633-NHS. Przechowywać roztwór podstawowy o stężeniu 2 mg/ml w temperaturze -20 stopni Celsjusza. C w DMF</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21335</td><td>Biotyna-NHS. Przechowywać roztwór podstawowy o stężeniu 25 mg/ml w temperaturze -20 ° C w DMF</td></tr><tr><td>Streptawidyna PE-cyjanina7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td>Streptawidyna PE-Cy7</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H478</td><td></td></tr><tr><td>35 i mikro; Rurki z nasadką filtracyjną M</td><td>Becton Dickinson</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy: BD LSRFortessa</td> Cytometr przepływowy <td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: BD FACSAria II</td> Cytometr przepływowy <td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: Napływ BD</td> Cytometr przepływowy <td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: Analizator ADP CyAn</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) ocena pasożytytemii zarodźca gryzoni i inwazji merozoitu za pomocą cytometrii przepływowej

In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry

Podczas infekcji krwi, pasożyty malarii atakują, dojrzewają i replikują się w czerwonych krwinkach (RBC). Powoduje to regularny cykl wzrostu i wykładniczy wzrost odsetka erytrocytów zakażonych malarią, znanych jako parazytemia. Opisujemy protokół oparty na cytometrii przepływowej, który wykorzystuje kombinację barwnika DNA Hoechst i barwnika potencjału błony mitochondrialnej, JC-1, do identyfikacji erytrocytów, które zawierają pasożyty, a tym samym pasożytnictwo, w próbkach krwi in vivo od myszy zakażonych Plasmodium chabaudi adami DS. Stosując to podejście, w połączeniu z przeciwciałami sprzężonymi fluorescencyjnie, pasożytnicze RBC można odróżnić od leukocytów, progenitorów RBC i RBC zawierających ciała Howella-Jolly'ego (HJ-RBC), z granicą wykrywalności 0,007% parazytemii. Dodatkowo nakreślono metodę oceny porównawczej inwazji merozoitu na dwie różne populacje RBC. W tym teście krwinki czerwone, znakowane dwoma odrębnymi związkami identyfikowalnymi za pomocą cytometrii przepływowej, są przetaczane zakażonym myszom. Względną szybkość inwazji w obu populacjach można następnie ocenić za pomocą cytometrii przepływowej na podstawie proporcji pasożytniczych erytrocytów w każdej populacji w czasie. To połączone podejście pozwala na dokładny pomiar zarówno inwazji pasożytów, jak i merozoitów w modelu in vivo zakażenia malarią.

Pomiar poziomu parasitemii.
W celu pomiaru parasitemii należy najpierw wyselekcjonować komórki krwi i wykluczyć szum, debris oraz płytki krwi w oparciu o właściwości FSC/SSC (Ryc. 2A). W zależności od użytego cytometru, pojedyncze komórki powinny zostać następnie wyselekcjonowane na podstawie szerokości impulsu wyzwalającego (Ryc. 2B) lub stosunku wysokości piku FSC do jego pola (Ryc. 2C). Pozostałe zdarzenia powinny składać się z leukocytów, wyb...

Pasożyt malarii atakuje i replikuje się w czerwonych krwinkach. Dokładna ocena inwazji merozoitu i parazytemii ma zatem kluczowe znaczenie w ocenie przebiegu zakażenia malarią. W tym miejscu opisujemy protokół oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru tych parametrów w mysim modelu malarii.

In vivo (in vivo) Ocena pasożytytemii zarodźca gryzoni i inwazji merozoitu za pomocą cytometrii przepływowej

During blood stage infection, malaria parasites invade, mature, and replicate within red blood cells (RBCs). This results in a regular growth cycle and an ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar inwazji parat i mezo w mysim modelu zakażenia malarią. Cel ten realizuje się poprzez uprzednie pobranie krwi od zwierząt niezakażonych. Następnie erytrocyty są znakowane znacznikami fluorescencyjnymi i wstrzykiwane zwierzętom zakażonym.Następnie pobiera się próbki krwi od zakażonych myszy i znakuje je przeciwciałami przeciwko odpowiednim markerom powierzchniowym wybranych komórek. W rezultacie, za pomocą analizy cytometrycznej, można zmierzyć liczbę niezinfekowanych komórek, do których wniknął plasmodium shabo meite, a także ogólną parasitemię zakażonych zwierząt. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod pomiaru inwazji meite i parasitemii jest fakt, że badanie jest przeprowadzane in vivo, co pozwala na uwzględnienie takich czynników jak wpływ układu odpornościowego.W ten sposób metoda ta może odpowiedzieć na niektóre kluczowe pytania w dziedzinie malarii, takie jak to, jakie konkretne elementy biorą udział w inwazji MI w krwinki czerwone. Przed rozpoczęciem testu należy pozyskać sześć do ośmiu myszy zainfekowanych plasmodium shabo z poziomem parasitemii od 2 do 15% na około trzy godziny przed transfuzją. Pobierz 200

in-vivo-assessment-rodent-plasmodium-parasitemia-merozoite-invasion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

In Vivo Ocena Pasożytnictwa Plasmodium U Gryzoni I Inwazji Merozoitów Za Pomocą Cytometrii Przepływowej

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Krzyżowanie genetyczne pasożytów malarii gryzoni przeprowadza się poprzez podanie dwóch genetycznie odmiennych pasożytów komarom. Potomstwo rekombinacyjne jest klonowane z krwi mysiej po tym, jak komary ukąsiły zainfekowane myszy. Niniejszy film pokazuje, jak przeprowadzić krzyżowanie genetyczne Plasmodium yoelii; metoda ta ma zastosowanie również do innych pasożytów malarii gryzoni.

Protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

Przedstawiamy metodę wykonywania mikroskopii intravitalnej ślezy z wykorzystaniem transgenicznych pasożytów malarii GFP oraz kwantyfikacji ruchliwości pasożytów i przepływu krwi w obrębie tego narządu.

Mikroskopia intravitalna śledziony: ilościowa analiza mobilności pasożytów i przepływu krwi

Ten film demonstruje test fagocytozy oparty na cytometrii przepływowej, obejmujący znakowane i opsonizowane erytrocyty zakażone Plasmodium falciparum przez monocyty. Cytometria przepływowa identyfikuje fluorescencję w monocytach, potwierdzając pomyślną identyfikację opsonizowanych erytrocytów poprzez fagocytozę.

Test do ilościowego określania fagocytozy erytrocytów zakażonych pasożytami za pośrednictwem przeciwciał

Ten film demonstruje test do ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożytów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM). Komórki makrofagów są zakażone ruchliwymi i nieruchliwymi stadiami inwazyjnymi Leishmania, odpowiednio promastigotykami metacyklicznymi i amastigotami. Pasożyty atakują makrofagi, uwewnętrzniając się w parazytoforycznej wakuoli i namnażając się w środku. Wewnątrzkomórkowy wzrost pasożyta określa się ilościowo za pomocą mikroskopu po fluorescencyjnym...

Test in vitro w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożyta w makrofagach

Opisano metodę izolacji przylegających leukocytów zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA. Metoda umożliwia kwantyfikację oraz charakterystykę fenotypową wyizolowanych leukocytów po barwieniu przeciwciałami fluorescencyjnymi, a następnie analizie za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA

Ten artykuł opisuje szczegółową metodę dynamicznego pomiaru i kwantyfikacji prędkości przepływu krwi w poszczególnych naczyniach krwionośnych układu krwionośnego wątroby myszy przy użyciu obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym w połączeniu ze specyficzną metodologią pozyskiwania i analizy obrazów.

Obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby po zakażeniu Leishmania: ocena hemodynamiki wątroby

Współinfekcja człowieka jest trudna do odtworzenia in vitro. Jednak ludzkie pasożyty malarii mogą być łatwo hodowane in vitro, podobnie jak świeżo wyizolowane ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej naturalnie zakażone wirusem HIV. Stanowi to doskonały model do badania wczesnych odpowiedzi immunologicznych na pasożyty malarii w kontekście współzakażenia wirusem HIV.

Model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem HIV

Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Tutaj opisujemy nową metodę, która pomaga wyjaśnić mechanizmy odporności komórkowej na Plasmodium podczas fazy infekcji krwi. Jest to test in vitro, który mierzy zabijanie zakażonych krwinek czerwonych przez limfocyty cytotoksyczne.

In vitro Test zabijania krwinek czerwonych zakażonych zarodźcem przez limfocyty cytotoksyczne

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do oceny inwazji merozoitu i pasożytytemii w modelu malarii u myszy. Ta technika pozwala precyzyjnie mierzyć dynamikę zakażenia Plasmodium in vivo.

In vivo (in vivo) Ocena pasożytytemii zarodźca gryzoni i inwazji merozoitu za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów