Name: Ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Poznaj metody oceny migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia, w tym testy Boydena i zadrapania. Techniki te pozwalają analizować dynamikę ruchu komórek i potencjał mitochondrialny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez niemieckie Ministerstwo Obrony (Grant nr M-SAB1-6-A009).

Poniższy protokół opisuje techniki badania wczesnej migracji komórek śródbłonka. Właściwa hodowla komórek śródbłonka naczyń krwionośnych wymaga wstępnego pokrycia kolb hodowli komórkowych żelatyną, aby zapewnić prawidłową proliferację i utrzymanie fenotypu śródbłonka.
1. Wstępne powlekanie kolb do hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Rozpuścić żelatynę w 0,1 M PBS do końcowego stężenia 0,1%.</li>
	<li>Autoklawuj roztwór z parametrami do autoklawowania płynnego (szczegóły znajdują się w instrukcji konkretnego autoklawu).</li>
	<li>Dodać wystarczającą objętość autoklawizowanego roztworu żelatyny do sterylnej kolby do hodowli komórkowych (np. co najmniej 5 ml w przypadku kolby do hodowli komórek T25).</li>
	<li>Przenieść kolby do inkubatora (37°C, 5% CO2 nie jest wymagane, ale nie przeszkadza) na co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Usuń pozostały roztwór żelatyny. Kolby z powłoką należy następnie wykorzystać (patrz hodowla komórek) lub przechowywać w sterylnych warunkach do momentu użycia.</li>
</ol>
2. Hodowla wczesna komórek śródbłonka
Uwaga: Embrionalne komórki macierzyste pochodzące z wczesnych komórek śródbłonka (EEC) uzyskano ze zróżnicowanych mysich ciał embrionalnych poprzez aktywowane magnetycznie sortowanie komórek frakcji PECAM-1 dodatniej, jak opisano wcześniej10,11.
<ol>
	<li>Hodowla EEC na pokrytych żelatyną szalkach do hodowli komórkowych w DMEM uzupełnionych 15% FCS, 50 U/ml penicyliny, 50 U/ml streptomycyny, 200 μM L-glutaminy, 100 μM ß-merkaptoetanolu i 1% aminokwasów endogennych. Z komórkami należy obchodzić się w sterylnych warunkach. Hodować komórki z 5% CO2 w temperaturze 37 °C i wilgotności 95% aż do konfluencji (maks. 80%).</li>
	<li>W przypadku konfluencji pod-konfluencji podziel komórki w stosunku 1:5. Uwaga: Oderwanie komórek śródbłonka jest krytycznym krokiem.
	<ol>
		<li>Zbierz komórki za pomocą akutazy RT. Usunąć podłoże, spłukać PBS i dodać 1 ml akutazy na 25 cm2.</li>
		<li>Inkubować kolbę w temperaturze pokojowej przez 2-10 minut, aż komórki się oderwą. Rozproszyć komórki i przenieść je do żądanej aplikacji. Uwaga: Chemiczna neutralizacja akutazy nie jest wymagana, ponieważ ma ona miejsce, gdy wysiane komórki są przechowywane w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Jednak aktywność akutazy można również zmniejszyć, dodając DMEM zawierający FCS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Komnata Boydena
Uwaga: Testy w komorze Boydena są wykonywane przy użyciu systemów wkładek z politereftalanu etylenu o wielkości porów 8 μm.
<ol>
	<li>Wstępnie pokryć wkłady filtracyjne (które mieszczą się w studzienkach hodowli komórkowych, tworząc w ten sposób komorę Boydena), dodając 500 μl 0,1% żelatyny rozpuszczonej w 0,1 M PBS przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Jeśli komórki mają być narażone na działanie toksycznych substancji chemicznych, przed pobraniem komórek należy je poddać działaniu zgodnie ze specjalnym projektem doświadczalnym. Uwaga: Komórki wystawiono na działanie 12,5 μg chlorambucylu/ml DMEM przez 24 godziny. W odniesieniu do konkretnego projektu eksperymentalnego, instrukcje mogą się różnić.</li>
	<li>Zebrać EWG i określić liczbę komórek za pomocą komory zliczającej. Uwaga: Można używać automatycznych urządzeń liczących, ale należy ich używać ostrożnie: ręczne liczenie komórek jest dokładniejsze i jest wysoce zalecane.</li>
	<li>Dodać 500 μl pożywki do hodowli komórkowych do dolnej komory komory Boydena.</li>
	<li>Dodać dokładnie 104 EWG w 500 μl pożywki do hodowli komórkowych na wkład filtracyjny w górnej komorze komory. Wyeliminuj bąbelki.</li>
	<li>Inkubować wkłady filtracyjne w inkubatorze dokładnie przez 8 godzin.</li>
	<li>Spłucz raz PBS i zastąp pożywkę 0,5 ml 4% paraformaldehydu w obu komorach przez 25 minut w celu utrwalenia komórek. Dokładnie umyj filtr, ale co najmniej 3 razy za pomocą 0.1 M PBS.</li>
	<li>Wytnij błony skalpelem.</li>
	<li>Zamontuj membranę między dwoma szkiełkami nakrywkowymi z medium montażowym zawierającym DAPI do barwienia jądrowego. Zwróć uwagę na orientację. Upewnij się, że liczone są tylko komórki, które migrowały w kierunku dolnej strony komory membrany.</li>
	<li>Policz komórki, które migrowały w kierunku dolnej strony przedziału membrany za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 400-krotnym powiększeniu. Nie należy mylić porów błony z migrowanymi komórkami (ryc. 1A, 1B). Zbadaj rozsądną liczbę kontrprób biologicznych (co najmniej 3 kontrpróby biologiczne na warunek).</li>
</ol>
4. Test gojenia się ran
<ol>
	<li>W zależności od dostępnego sprzętu starannie wybierz szalki lub płytki do hodowli komórkowych: Podczas korzystania z mikroskopii DIC unikaj plastikowych naczyń hodowlanych lub płytek studzienkowych, ale zamiast tego używaj urządzeń na bazie szkła. 
	Uwaga: W przypadku korzystania z mikroskopii z kontrastem fazowym można również używać naczyń na bazie tworzywa sztucznego.</li>
	<li>Uprawiać EEC w odpowiednim urządzeniu do hodowli komórkowej (np. na szalce Petriego ze szklanym dnem o średnicy 4 cm, odpowiedniej do obrazowania żywych komórek) aż do 80% konfluencji. Ważne: nie hoduj komórek do całkowitego zgrania.</li>
	<li>Zdrap monowarstwy sterylnymi końcówkami do pipet o pojemności 10 μl. Delikatnie dociśnij końcówkę bez zbytniego nacisku na powierzchnię naczynia i przesuwaj ją płynnie w linii prostej z jednej strony na drugą. Umyj komórki dwukrotnie 0,1 M PBS, aby usunąć oderwane komórki.</li>
	<li>Dodaj wystarczającą ilość pożywki do naczynia hodowlanego. W razie potrzeby dodać związki, które powinny zostać zbadane. 
	Uwaga: Dodano 1,5 ml pożywki zawierającej 15 ng/ml kwasu alfa-linolenowego.</li>
	<li>Zamontuj szalkę hodowlaną pod mikroskopem zdolnym do obrazowania żywych komórek. Zapewnić 5% CO2, 37 °C i nawilżoną atmosferę. 
	Uwaga: Nawilżanie jest szczególnie ważne, aby uniknąć parowania medium.</li>
	<li>Rób zdjęcia poklatkowe w ciągu 24 godzin w odstępach 10-minutowych. Zaplanuj duże rozmiary plików. Uwaga: Rozdzielczość 512 x 512 pikseli jest zwykle wystarczająca; Zalecamy jednak używanie obrazów o wymiarach co najmniej 1 024 x 1 024.</li>
	<li>Zmierz szerokość szczeliny przy t = 0 godz. i przy t = 24 godz. za pomocą narzędzia do pomiaru długości w oprogramowaniu dostarczonym z mikroskopem lub użyj oprogramowania typu open source (np. ImageJ). Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, specjalne oprogramowanie do akwizycji i analizy obrazu jest dostarczane przez producenta. Dlatego szczegółowe informacje techniczne dotyczące korzystania z oprogramowania można znaleźć w instrukcji.</li>
</ol>
5. Śledzenie komórek
<ol>
	<li>W zależności od dostępnego sprzętu starannie wybierz szalki lub płytki do hodowli komórkowych: Podczas korzystania z mikroskopii DIC unikaj plastikowych naczyń hodowlanych lub płytek studzienkowych, ale zamiast tego używaj urządzeń na bazie szkła. 
	Uwaga: W przypadku korzystania z mikroskopii z kontrastem fazowym można również używać naczyń na bazie tworzywa sztucznego.</li>
	<li>Wysiewać 5 x 104 EEC w uzupełnionym DMEM w odpowiednim urządzeniu do hodowli komórkowej (np. na 24-dołkowej płytce) i hodować komórki z 5% CO2 w temperaturze 37 °C i wilgotności 95% przez 1-2 dni.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, należy usunąć pożywkę i wyhodować komórki z nową pożywką w obecności odpowiednich substancji badanych (np. 12,5 μg chlorambucylu / ml DMEM). Należy zawsze włączyć komórki kontrolne (poddane działaniu rozpuszczalnika, np. etanolu) w temperaturze 37 °C przez określony czas (24 godziny, w zależności od indywidualnego systemu oznaczania).</li>
	<li>Zamontuj naczynie hodowlane pod mikroskopem zdolnym do obrazowania żywych komórek (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności). Rejestruj zdjęcia poklatkowe w ciągu 24 godzin w określonych odstępach czasu. Rejestruj obrazy w odstępach 10-minutowych.</li>
	<li>Wykonaj ręczne śledzenie EEC za pomocą wtyczki ImageJ MTrackJ. Wybierz losowo 10 komórek z pola widzenia i śledź ich ruchy, dodając punkt danych na punkt w czasie za pomocą polecenia "Dodaj" MTrackJ.</li>
</ol>
Uwaga: MTrackJ jest dostępny za darmo na [Meijering, \Mtrackj." http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ "], a ImageJ jest dostępny na [Rasband, \Imagej." http://rsbweb.nih.gov/ij/ "]. Szczegółowa instrukcja na temat wtyczki MTrackJ jest dostępna pod adresem "http://www.imagescience.org".
6. Obrazowanie żywych komórek/ocena potencjału błony mitochondrialnej
<ol>
	<li>Uprawiać EEC w odpowiednim urządzeniu do hodowli komórkowej (np. na szalce Petriego ze szklanym dnem o średnicy 4 cm, odpowiedniej do obrazowania żywych komórek) do 80% konfluencji. 
	Ważne: Nie hoduj komórek w celu całkowitego zbieżności.</li>
	<li>W razie potrzeby wystaw ogniwa na działanie chemikaliów. Uwaga: Komórki wystawiono na działanie 12,5 μg/ml chlorambucylu przez 24 godziny. W odniesieniu do konkretnego projektu eksperymentalnego, instrukcje mogą się różnić.</li>
	<li>Przygotować 10 mM roztwór podstawowy tetrametylorodaminy (TMRM) w DMSO. Chronić przed światłem. Uwaga: Roztwór podstawowy można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy w pożywce do hodowli komórkowej do roztworu roboczego o stężeniu 10 μM (rozcieńczenie 1:1 000). Chronić przed światłem i zużyć tak szybko, jak to możliwe. Uwaga: Roztwór roboczy można przechowywać w temperaturze pokojowej przez pewien czas (>1 godz.), jednak zdecydowanie zaleca się przygotowanie świeżego roztworu roboczego.</li>
	<li>Dodać 2 μl roztworu roboczego do 1 ml pożywki do hodowli świeżych komórek (roztwór nasycający).</li>
	<li>Załaduj komórki, zastępując pożywkę do hodowli komórkowych roztworem ładującym. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotnej atmosferze (inkubator). Uwaga: Prawie wszystkie wskaźniki fluorescencji są z czasem eksportowane przez żywe komórki; Dlatego unikaj długotrwałego ładowania lub opóźnionej analizy.</li>
	<li>Bez mycia umieść naczynie pod mikroskopem odpowiednim do obrazowania żywych komórek. Ważne: wskaźniki fluorescencji są bardzo wrażliwe na światło, dlatego należy unikać niepotrzebnej ekspozycji na światło.</li>
	<li>Pozyskiwanie obrazów bez zmiany parametrów akwizycji, aby zapewnić porównywalność między różnymi obrazami.</li>
</ol>

<ol><li>Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis%2C+vasculogenesis%2C+and+induction+of+healing+in+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+and+Endovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds.</a> Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).</li>
<li>Reinke, J. M., Sorg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Surgical+Research.+Europaische+Chirurgische+Forschung.+Recherches+Chirurgicales+Europeennes%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).</li>
<li>Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation.+1%3A+Its+role+in+the+healing+of+acute+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds.</a> Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).</li>
<li>Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((endothelial+progenitor+cell+mobilization%2C+and+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).</li>
<li>Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperbaric+oxygen+and+bone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells+in+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular%22%5BJournal%5D)">Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing.</a> Vascular. 14, 328-337 (2006).</li>
<li>Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+toxicology+of+sulfur+mustard-induced+cutaneous+inflammation+and+blistering%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering.</a> Toxicology. 263, 12-19 (2009).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+mustard+%28Chlorambucil%29+has+a+negative+influence+on+early+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development.</a> Toxicology. 263, 32-40 (2009).</li>
<li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+N-acetyl+cysteine+and+alpha-linolenic+acid+on+sulfur+mustard+caused+impairment+of+in+vitro+endothelial+tube+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation.</a> Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).</li>
<li>Steinritz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorambucil+%28nitrogen+mustard%29+induced+impairment+of+early+vascular+endothelial+cell+migration+-+Effects+of+alpha-linolenic+acid+and+N-acetylcysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine.</a> Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+endostatin+on+embryonic+vasculo-+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics+%3A+an+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).</li>
<li>Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cell+separations%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2FBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Methods in cell separations.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+VEGF-induced+endothelial+cell+migration+by+mitochondrial+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+culture+conditions+on+endothelial+cell+growth+and+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness.</a> Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).</li>
<li>Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+substrates+for+human+umbilical+vein+endothelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry+%3A+Official+Publication+of+the+Biological+Stain+Commission%22%5BJournal%5D)">A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture.</a> Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> BioTechniques. 50, 98-115 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Narażenie skóry na toksyczne chemikalia często powoduje poważne zaburzenia gojenia się ran. Mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska są w dużej mierze nieznane. Gojenie się ran to złożony proces, który składa się z różnych faz (hemostaza, stan zapalny, proliferacja i przebudowa). Migracja komórek jest zaangażowana w każdą fazę, jednak ma ogromne znaczenie dla tworzenia się ziarniny. Tutaj nowe naczynia krwionośne powstają w wyniku angiogenezy lub unaczynienia.
Oba procesy wymagają niezakłócon...

Migracja komórek jest ważna w wielu procesach fizjologicznych i patofizjologicznych, w tym w rozwoju, różnych chorobach i gojeniu się ran po urazach skóry.
Po urazie skóry, stan zapalny usuwa uszkodzoną lub martwiczą tkankę, a ziarninacja prowadzi do wstępnego zamknięcia rany i umożliwia tworzenie sieci nowych naczyń włosowatych poprzez waskulogenezę (tworzenie powieści) lub angiogenezę (kiełkowanie istniejących pęcherzyków)1-3. Zarówno naczynia krwionośne, jak i angiogeneza wymagają migracji komórek śródbłonka. Rosnąca sieć naczyń krwionośnych jest niezbędna do transportu tlenu i składników odżywczych do proliferujących keratynocytów, które ostatecznie ulegają keratynizacji, tworzą nowy nabłonek i zapewniają zamknięcie rany.
Upośledzona migracja komórek śródbłonka jest podstawową przyczyną zaburzeń gojenia się ran4,5. W związku z tym potrzebne są metody oceny migracji wczesnych komórek śródbłonka, aby zbadać patofizjologię zaburzeń migracji komórek i zidentyfikować nowe strategie interwencji terapeutycznej.
Narażenie skóry na czynniki alkilujące (np. iperyty siarkowe i azotowe) powoduje zaburzenia gojenia się ran6. Związki te były używane jako chemiczne środki bojowe w kilku konfliktach w XX wieku i nadal budzą duże zaniepokojenie ze względu na istniejące zapasy w niestabilnych politycznie regionach i stosunkowo prostą syntezę. Chociaż iperyt siarkowy został po raz pierwszy zsyntetyzowany w 1822 roku, molekularna i kliniczna patologia ekspozycji na SM nie jest szczegółowo poznana i nie zidentyfikowano antidotum na ekspozycję na SM.
Przeprowadzono kilka badań, aby zrozumieć i modelować upośledzone gojenie ran po ekspozycji na SM oraz przetestować potencjalne potencjalne związki zdolne do zachowania tego efektu. Schmidt i in. (2009) przetestowali wpływ chlorambucylu, związku alkilującego o właściwościach podobnych do SM w modelach ciała myszy embrionalnych i stwierdzili dramatyczne, czasami ponad 99% zmniejszenie tworzenia naczyń7. To niekorzystne działanie było najbardziej widoczne na etapie rozwoju, który w warunkach fizjologicznych jest zdominowany przez proliferację i migrację komórek prekursorowych śródbłonka naczyń krwionośnych. W związku z tym stwierdzono, że komórki te są szczególnie wrażliwe na czynniki alkilujące. Steinritz i in. (2010) przetestowali zmiatacze reaktywnych form tlenu (ROS), w szczególności N-acetylocysteiny (NAC) i kwasu alfa-linolenowego (ALA) pod kątem ich zdolności do zmniejszania toksyczności SM w modelach ciała zarodków myszy, a w szczególności do przywracania tworzenia naczyń8. Zaobserwowano tymczasowe działanie ochronne, co wskazuje, że nadmierne tworzenie ROS może przyczyniać się do niekorzystnego wpływu SM na gojenie się ran. Efekty te nie były trwałe, a dwa kandydujące związki mogą nie być zdolne do przywrócenia tworzenia naczyń krwionośnych i gojenia się ran w dłuższej perspektywie8. Eksperymenty te zostały jednak przeprowadzone na złożonym modelu 3D, który pozwolił na zbadanie migracji komórek. W związku z tym następnie przetestowaliśmy NAC i ALA pod kątem korzystnego wpływu na migrację komórek EWG, które odgrywają kluczową rolę w procesie tworzenia naczyńkrwionośnych 9.
Ponadto, istnieją dowody na to, że polaryzacja komórek jest wymagana do migracji komórek. Wykazano, że dysfunkcja mitochondriów prowadząca do powstawania ROS upośledza polaryzację komórek, a tym samym może niekorzystnie wpływać na migrację komórek. W związku z tym przeprowadzono obrazowanie żywych komórek pod kątem funkcji mitochondriów oraz zbadano działanie zmiataczy ROS. Poniższy protokół opisuje ogólne wymagania dotyczące uprawy EWG, testu w komorze Boydena, testu gojenia się ran, w tym analizy śledzenia komórek oraz szczegółowego stosowania TMRM do oceny funkcji mitochondriów. Podkreślono ważne aspekty protokołów doświadczalnych dotyczących uprawy i migracji EWG.

<table><tbody><tr><td>Komora Boydena&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli tkankowych Corning FluoroBlok (TC), 24 dołki - 3 i mikro; m</td><td>Corning Incorporated</td><td>#351151</td><td></td></tr><tr><td>Corning FluoroBlok Wkładki do hodowli tkankowej (TC), 24 dołki - 8 i mikro; m</td><td>Nauki przyrodnicze</td><td>#351152(</td><td></td></tr><tr><td>do użytku z płytką towarzyszącą Falcon Insert 24 dołki (353504)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Test gojenia</td><td></td><td></td><td></td>ran&nbsp;</tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem</td><td>Word Precision Instruments, Inc.</td><td>#FD35-100</td><td></td></tr><tr>Ocena potencjału <td></td><td></td><td></td><td>mitochondrialnego</td></tr><tr><td>TMRM (ester metylowy tetrametylorodaminy)</td><td>Life Technologies</td><td>#T669</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla</td><td></td><td></td><td></td>komórkowa</tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA, Pasching, Austria</td><td># L11-007</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-kwas linolenowy</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Niemcy</td><td>&nbsp;# L2376</td><td></td></tr><tr><td>Chlorambucil</td><td>Fluka (Sigma), Steinheim, Niemcy#</td> <td>23125</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy</td><td># G2500-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Narażenie na substancje chemiczne (w tym alkilujące chemiczne środki bojowe, takie jak iperyty siarkowe i azotowe) powoduje mnóstwo objawów klinicznych, w tym zaburzenia gojenia się ran. Fizjologiczny proces gojenia się ran jest bardzo złożony. Tworzenie się ziarniny jest kluczowym etapem w tym procesie, który prowadzi do wstępnego zamknięcia rany i zapewnienia sieci nowych naczyń krwionośnych naczyń włosowatych – albo poprzez waskulogenezę (tworzenie powieści), albo angiogenezę (kiełkowanie istniejących naczyń). Zarówno naczynia krwionośne, jak i angiogeneza wymagają funkcjonalnej, ukierunkowanej migracji komórek śródbłonka. W związku z tym badanie wczesnej migracji komórek śródbłonka (EEC) jest ważne dla zrozumienia patofizjologii zaburzeń gojenia się ran wywołanych chemikaliami i potencjalnego zidentyfikowania nowych strategii interwencji terapeutycznej.
Oceniliśmy upośledzone gojenie się ran po ekspozycji na środek alkilujący i przetestowaliśmy potencjalne związki kandydujące do leczenia. Zastosowaliśmy zestaw technik opisanych w tym protokole. Opisano zmodyfikowaną komorę Boydena do ilościowego badania chemokinezy EWG. Ponadto zilustrowano zastosowanie testu gojenia się ran w połączeniu z analizą torów w celu jakościowej oceny migracji. Na koniec demonstrujemy zastosowanie barwnika fluorescencyjnego TMRM do badania potencjału błony mitochondrialnej w celu identyfikacji mechanizmów leżących u podstaw zaburzonej migracji komórek. Poniższy protokół opisuje podstawowe techniki, które zostały dostosowane do badania EWG.

Ekspozycja skóry na środki alkilujące wywołuje rumień, powstawanie pęcherzy oraz owrzodzenia skóry, co wiąże się z zaburzeniem gojenia ran. Gojenie ran wymaga angiogenezy i waskulogenezy, które opierają się na migracji komórek śródbłonkowych. Migrację ilościową można ocenić za pomocą testu w komorze Boydena. Jak pokazano na Rysunku 1C, ekspozycja EEC na środek alkilujący chlorambucil spowodowała istotny spadek migracji komórek9. Dodatek przeciwutleniacza kwasu alfa-linolenowego (ALA) bezpośred...

Badanie wczesnej migracji komórek śródbłonka (EEC) jest ważne dla zrozumienia patofizjologii niektórych chorób i potencjalnego zidentyfikowania nowych strategii interwencji terapeutycznej. Poniższy protokół opisuje techniki oceny migracji komórek, które zostały dostosowane do badania EWG.

Ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zbadanie wpływu toksycznych chemikaliów na migrację komórek śródbłonka z wykorzystaniem różnych testów migracji. Najpierw, w kolejnym doświadczeniu, zaprezentowano zastosowanie zmodyfikowanego testu z komorą unikową w celu zbadania chemokinezy eksponowanych komórek śródbłonka. Test gojenia ran został połączony ze śledzeniem komórek, aby dostarczyć dodatkowych, szczegółowych informacji na temat dynamiki migracji komórek.W końcowym teście zaprezentowano badanie potencjału błony mitochondrialnej w celu zidentyfikowania mechanizmów leżących u podstaw upośledzonej migracji komórek śródbłonka. Ostatecznie testy migracji te mogą zostać wykorzystane do oceny wpływu silnie toksycznych czynników alkilujących na potencjał błony mitochondrialnej oraz migrację komórek śródbłonka. Przedstawione metody mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie zaburzeń gojenia ran indukowanych przez silnie toksyczne substancje chemiczne; procedury te zostaną zademonstrowane przez Ramata, Voera oraz Stefana Millera, techników z mojego laboratorium. Aby przygotować kolby do hodowli komórkowej, należy rozpocząć od dodania odpowiedniej objętości świeżo przygotowanej żelatyny, tak aby pokryła ona dno sterylnej kolby do hodowli komórkowej.Umieść kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowej na co najmniej 30 minut. Następnie usuń pozostały roztwór żelatyny i przenieś w odpowiedniej ilości pożywki wczesne komórki śródbłonka pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych (EEC), gdy komórki osiągną subkonfluencję, aby doprowadzić je do 80% konfluencji. Usuń pożywkę, wypłucz komórki buforem PBS i inkubuj je w 1 ml Accutane na 25 cm² przez 2 do 10 minut.Po odklejeniu się komórek, podzielić je w stosunku jeden do pięciu w świeżej pożywce w celu analizy migracji komórek śródbłonka za pomocą testu w komorze Boydena. Powlec wkładki z filtrem 500 µL świeżo przygotowanej 0,1% żelatyny. Po zebraniu EEC w sposób przedstawiony powyżej, należy policzyć komórki i dodać 500 µL pożywki do hodowli komórkowej do dolnych komór komory Boydena.Następnie do każdego filtra dodaj dokładnie 10⁴ EEC w 500 µL pożywki. Po usunięciu pęcherzyków powietrza umieść komorę Boydena w inkubatorze dokładnie na osiem godzin. Po zakończeniu inkubacji przepłucz filtry jednokrotnie za pomocą PBS.Następnie, po 20 minutach, utrwalone komórki poprzez dodanie 0,5 ml 4% paraformaldehydu do obu komór. Filtry przemyć co najmniej trzy razy 0,1 M PBS, a następnie wyciąć membrany skalpelem. Do zamontowania każdej membrany pomiędzy dwiema szkiełkami podstawowymi użyć medium montażowego uzupełnionego o DPI.Należy zwrócić uwagę na orientację filtrów. Następnie, używając mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 400 x, należy policzyć wyłącznie komórki, które przemieściły się do dolnej komory. Należy uważać, aby nie pomylić porów z migrującymi komórkami.Aby rozpocząć test gojenia ran, należy ręcznie usunąć komórki z naczynia z hodowlą EEC o 80% konfluencji, delikatnie przesuwając sterylną końcówkę pipety 10 µL po powierzchni hodowli w linii prostej od jednej do drugiej strony naczynia. Płytkę należy dwukrotnie przemyć 0,1 M PBS, aby usunąć oderwane komórki. Następnie do naczynia z hodowlą należy dodać pożywkę uzupełnioną o badany związek.Następnie umieść szalkę hodowlaną pod mikroskopem umożliwiającym obrazowanie żywych komórek w warunkach hodowli komórkowej i wykonaj zdjęcia w trybie time-lapse przez 24 godziny w odstępach 10 minut, stosując rozdzielczość co najmniej 10 24 na 10 24 na koniec sesji obrazowania. Użyj odpowiedniego narzędzia programowego do pomiaru szerokości szczeliny w czasie 0 i 24 godzin w celu przeprowadzenia testu śledzenia komórek. Zaimportuj sekwencję obrazów do programu ImageJ i aktywuj wtyczkę MT track J dla ImageJ.Następnie, korzystając z polecenia add, wybierz losowo 10 komórek w polu widzenia, aby ręcznie śledzić ich ruch w ciągu 24-godzinnego okresu obrazowania. Użyj polecenia measure, aby wyświetlić wyniki. Następnie użyj polecenia movie, aby wyeksportować ścieżki w celu oceny potencjału błony mitochondrialnej komórek po potraktowaniu badanym związkiem eksperymentalnym; zastąp pożywkę hodowlaną dwiema mikrolitrami świeżo przygotowanego TMRM w jednym mililitrze świeżej pożywki hodowlanej.Po usunięciu pożywki, bez przemywania, należy natychmiast umieścić szalkę pod mikroskopem i wykonać zdjęcia komórek kontrolnych oraz poddanych działaniu czynnika eksperymentalnego, nie zmieniając parametrów akwizycji. Aby zapewnić porównywalność między różnymi grupami, należy pamiętać, że gojenie ran wymaga angiogenezy, która zależy od migracji komórek śródbłonka, co zilustrowano na wykresie przedstawiającym ekspozycję EEC na czynnik alkilujący. Chlorambucyl powoduje istotny spadek migracji komórek, co zmierzono za pomocą testu w komorze Boydena. Dodanie kwasu alfa-linolenowego, będącego zmiataczem reaktywnych form tlenu (ROS), bezpośrednio po 24-godzinnej ekspozycji na chlorambucyl, znacząco przywraca fenotyp prawie do poziomu kontrolnego.Test w komorze Boydena nie dostarcza jednak informacji o zachowaniu migracyjnym komórek w tym reprezentatywnym teście gojenia ran. Nieeksponowane EEC były w stanie zamknąć lukę w ciągu 24 godzin, podczas gdy EEC traktowane chlorambicilem nie zdołały tego zrobić. Co więcej, śledzenie poszczególnych EEC wykazało, że komórki eksponowane na chlorambicil wykazywały niewielki ruch, który został przywrócony po zastosowaniu wymiatacza ROS.W rzeczywistości EEC eksponowane na chlorambacyl wykazują spadek potencjału błony mitochondrialnej, co obrazuje brak ekspresji TMRM. Leczenie EEC pogromiecie lśniących form tlenowych (ROS) zapobiegło jednak tym uszkodzeniom mitochondriów, utrzymując ich potencjał błony mitochondrialnej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak analizować migrację chemicznie zaburzonych komórek śródbłonka za pomocą zmodyfikowanego testu w komorze punktowej z wykorzystaniem testu gojenia rany (scratch wound assay) oraz jak oceniać ich potencjał błony mitochondrialnej.

assessment-endothelial-cell-migration-after-exposure-to-toxic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne substancje chemiczne

Ten film pokazuje metodę testowania migracji między neuronami w odpowiedzi na chemoatrakcyjne sygnały z okołokomorowych komórek śródbłonka (PVEC). Interneurony są umieszczone w centralnym pomieszczeniu, z PVEC i komórkami kontrolnymi po obu stronach. Zwiększona migracja w kierunku PVEC wskazuje na pozytywną reakcję na ich chemoatrakcyjne sygnały.

Ocena odpowiedzi interneuronów na chemoatrakcyjne sygnały z komórek śródbłonka okołokomorowego

Opracowaliśmy model in vitro, który naśladuje ważny składnik ostrej reakcji zapalnej podczas infekcji pęcherza moczowego uropatogennym Escherichia coli.  Test migracji neutrofili przezuroepitelialnych umożliwia ilościową ocenę migracji neutrofili u ludzi przez nabłonek pęcherza moczowego, hodowanych na przepuszczalnych podporach, w odpowiedzi na infekcję bakteryjną lub substancje chemoatraktantowe.

Ilościowa ocena migracji neutrofili człowieka przez nabłonek pęcherza moczowego z hodowlą

Trójwymiarowa komora przepływowa to nowatorska technologia in vitro do ilościowej i stopniowej oceny kaskady wynaczynień komórek krążących w warunkach fizjologicznego stresu ścinającego. W związku z tym urządzenie spełnia krytyczną potrzebę podstawowych, przedklinicznych i klinicznych badań migracji komórek.

Nowatorskie trójwymiarowe urządzenie z komorą przepływową do badania wynaczynienia komórek krążących w fizjologicznych warunkach przepływu kierowanego przez chemokinę

Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Migracja komórek to zjawisko biologiczne, które bierze udział w wielu procesach fizjologicznych, takich jak gojenie się ran i reakcje immunologiczne oraz procesy patofizjologiczne, takie jak rak. Test migracji macierzy kolagenu 3D jest wszechstronnym narzędziem do analizy właściwości migracyjnych różnych typów komórek w środowisku fizjologicznym 3D.

Analiza migracji komórek w obrębie trójwymiarowej matrycy kolagenowej

Opisujemy metodę in vitro, która pozwala na ilościowe określenie rzeczywistej liczby komórek adhezyjnych w monowarstwie komórek śródbłonka.

Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro

To badanie przedstawia dwie różne metody analizy inwazji i migracji komórek: test komory Boydena i test gojenia ran oparty na mikroskopie in vitro. Opisano protokoły tych dwóch eksperymentów oraz porównano ich zalety i wady.

Ocena procesu inwazji i migracji komórek: porównanie testu ran drapanych opartego na mikroskopie wideo i testu z komorą Boydena

W tym protokole, limfocyty są umieszczane w górnej komorze systemu transmigracyjnego, oddzielone od dolnej komory porowatą błoną. Do dolnej komory dodaje się chemokinę, która indukuje aktywną migrację wzdłuż gradientu chemokin. Po 48 godzinach limfocyty są liczone w obu komorach w celu ilościowego określenia transmigracji.

Ocena migracji limfocytów w systemie transmigracji ex vivo

Prezentujemy trzy proste testy in vitro - test migracji na duże odległości, test migracji kokulturowej i test przyciągania chemo-chemicznego - które wspólnie oceniają funkcje komórek śródbłonka okołokomorowego pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i ich interakcję z interneuronami GABA-ergicznymi.

Testy migracji, chemoprzyciągania i kohodowli komórek śródbłonka pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i neuronów GABA-ergicznych

Przedstawiamy opłacalną metodę do testu migracji od razu, która zapewnia nowe podejście do określania migracji komórek bez użycia metod intensywnie wykorzystujących sprzęt. Chociaż w tym protokole wykorzystano fibroblasty, można go dostosować i wykorzystać do badania dodatkowych typów komórek i wpływu na migrację komórek.

Ekonomiczny i elastyczny test migracji zarysowania

Poznaj metody oceny migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia, w tym testy Boydena i zadrapania. Techniki te pozwalają analizować dynamikę ruchu komórek i potencjał mitochondrialny.

Ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia

Przeglądaj więcej filmów