Ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie wpływu toksycznych substancji chemicznych na migrację komórek śródbłonka przy użyciu różnych testów migracji. Po pierwsze, w następnym eksperymencie zademonstrowano zastosowanie zmodyfikowanego testu komory unikającej do zbadania kinezy chemicznej odsłoniętych komórek śródbłonka. Test gojenia się ran jest połączony ze śledzeniem komórek, aby dostarczyć dodatkowych szczegółowych informacji na temat dynamiki migracji komórek.

W końcowym teście wykazano badanie potencjału błony mitochondrialnej w celu identyfikacji mechanizmów leżących u podstaw upośledzonej migracji komórek śródbłonka. Ostatecznie te testy migracji można wykorzystać do oceny wpływu wysoce toksycznych czynników alkilujących na potencjał błony mitochondrialnej i migrację komórek śródbłonka. Metody mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zaburzeń gojenia się ran wywołanych przez wysoce toksyczne chemikalia, demonstrując procedury będą ramat, voer i Stefan Miller, wszyscy technicy z mojego laboratorium Aby Preco, kolby do hodowli komórkowych zaczynają się od dodania wystarczającej ilości świeżo przygotowanej żelatyny, aby pokryć dno sterylnej kolby do hodowli komórkowych.

Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych na co najmniej 30 minut. Następnie usuń pozostały roztwór żelatyny i przenieś embrionalne komórki macierzyste pochodzące z wczesnych komórek śródbłonka lub EEC w wystarczającej ilości pożywki, aby wyhodować komórki do 80% płynności CO, gdy komórki osiągną subkonfluencję. Usuń pożywkę, przepłucz komórki PBS i inkubuj je w jednym mililitrze Accutane na 25 centymetrów kwadratowych przez dwie do 10 minut.

Kiedy komórki się odłączą, podziel je w stosunku od jednego do pięciu w świeżej pożywce w celu analizy migracji komórek śródbłonka za pomocą testu komory Boydena. Wstępnie kodowany, filtr wkłada się do 500 mikrolitrów świeżo przygotowanej 0,1% żelatyny. Po zebraniu EWG, jak właśnie pokazano, należy policzyć komórki i dodać 500 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych do dolnych komór boydena.

Następnie dodaj dokładnie jeden razy 10 do czwartego EWG w 500 mikrolitrach pożywki do każdego filtra. Następnie, po usunięciu wszelkich pęcherzyków, umieść komorę Boydena w inkubatorze na dokładnie osiem godzin. Pod koniec inkubacji przepłukać filtry jeden raz PBS.

Następnie po 20 minutach przymocuj komórki z dodatkiem 0,5 mililitra 4% paraformaldehydu do obu komór. Umyj filtry co najmniej trzy razy 0,1 molowym PBS i wyciąć membrany skalpelem. Użyj medium montażowego uzupełnionego o DPI, aby zamontować każdą membranę między dwoma szklanymi szkiełkami nakrywkowymi.

Zwracając uwagę na orientację filtrów. Następnie użyj mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 400x, aby policzyć tylko komórki, które migrowały w kierunku dolnej komory. Uważając, aby nie pomylić porów z migrującymi komórkami.

Aby rozpocząć test gojenia się ran, ręcznie podnieś komórki z naczynia do hodowli EWG o 80% konfluencji, delikatnie popychając sterylną końcówkę pipety o pojemności 10 mikrolitrów po powierzchni kultury w gładkiej linii prostej z jednej strony naczynia na drugą. Umyj płytkę dwukrotnie w 0,1 molowym PBS, aby usunąć oderwane komórki. Następnie dodaj pożywkę uzupełnioną interesującym związkiem do pojemnika na kulturę.

Następnie zamontuj szalkę hodowlaną pod mikroskopem zdolnym do obrazowania żywych komórek w warunkach hodowli komórkowej i uzyskaj obrazy poklatkowe w ciągu 24 godzin w odstępach 10-minutowych, używając rozdzielczości co najmniej 10 24 na 10 24 na koniec sesji obrazowania. Użyj odpowiedniego narzędzia programowego, aby zmierzyć szerokość szczeliny po zeru i 24 godzinach, aby wykonać test śledzenia komórek. Zaimportuj sekwencję obrazów do obrazu J i włącz wtyczkę MT track J image J.

Następnie za pomocą polecenia dodaj wybierz losowo 10 komórek w polu widzenia, aby ręcznie śledzić ruch komórek w ciągu 24-godzinnego okresu obrazowania. Użyj polecenia zmierz, aby wyświetlić wyniki. Następnie użyj polecenia movie, aby wyeksportować ścieżki w celu oceny potencjału błony mitochondrialnej komórek po potraktowaniu badanym związkiem eksperymentalnym, zastąp pożywkę do hodowli komórkowej dwoma mikrolitrami świeżo przygotowanego TMRM w jednym mililitrze świeżej hodowli komórkowej.

Pożywka, a następnie bez natychmiastowego mycia, umieścić naczynie pod mikroskopem i uzyskać obrazy komórek kontrolnych i eksperymentalnie poddanych działaniu środka bez zmiany parametrów akwizycji Aby zapewnić porównywalność między różnymi grupami, gojenie się ran wymaga angiogenezy, która jest zależna od migracji komórek śródbłonka, jak pokazano na wykresie ekspozycji EWG na czynnik alkilujący. Chlorambacil powoduje znaczne zmniejszenie migracji komórek, mierzonej za pomocą testu w komorze Boydena. Dodanie reaktywnej formy tlenu lub kwasu alfa-linolenowego wymiatacza ROS bezpośrednio po 24-godzinnej ekspozycji na chlorambacyl znacznie ratuje fenotyp prawie do poziomów kontrolnych.

Test z komorą Boydena nie dostarcza jednak informacji na temat zachowania migracyjnego komórek w tym reprezentatywnym teście ran i gojenia. Nienarażone EWG były w stanie wypełnić lukę w ciągu 24 godzin, podczas gdy EWG poddane działaniu chlorambacylu nie były w stanie tego zrobić. Co więcej, śledzenie komórek poszczególnych EEC ujawniło, że komórki wystawione na działanie chlorambacylu wykazywały niewielki ruch, który został przywrócony po leczeniu wymiataczem ROS.

W rzeczywistości chlorambacil narażony na EWG wykazuje załamanie potencjału błony mitochondrialnej, co ilustruje brak ekspresji TMRM. Leczenie EEC zmiataczem ROS zapobiegło jednak uszkodzeniom mitochondriów, utrzymując ich potencjał błony mitochondrialnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować migrację chemicznie zaburzonych komórek śródbłonka za pomocą zmodyfikowanego testu punktowego w komorze za pomocą testu rany drapanej i jak ocenić ich potencjał błony mitochondrialnej.