Ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zbadanie wpływu toksycznych chemikaliów na migrację komórek śródbłonka z wykorzystaniem różnych testów migracji. Najpierw, w kolejnym doświadczeniu, zaprezentowano zastosowanie zmodyfikowanego testu z komorą unikową w celu zbadania chemokinezy eksponowanych komórek śródbłonka. Test gojenia ran został połączony ze śledzeniem komórek, aby dostarczyć dodatkowych, szczegółowych informacji na temat dynamiki migracji komórek.

W końcowym teście zaprezentowano badanie potencjału błony mitochondrialnej w celu zidentyfikowania mechanizmów leżących u podstaw upośledzonej migracji komórek śródbłonka. Ostatecznie testy migracji te mogą zostać wykorzystane do oceny wpływu silnie toksycznych czynników alkilujących na potencjał błony mitochondrialnej oraz migrację komórek śródbłonka. Przedstawione metody mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie zaburzeń gojenia ran indukowanych przez silnie toksyczne substancje chemiczne; procedury te zostaną zademonstrowane przez Ramata, Voera oraz Stefana Millera, techników z mojego laboratorium. Aby przygotować kolby do hodowli komórkowej, należy rozpocząć od dodania odpowiedniej objętości świeżo przygotowanej żelatyny, tak aby pokryła ona dno sterylnej kolby do hodowli komórkowej.

Umieść kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowej na co najmniej 30 minut. Następnie usuń pozostały roztwór żelatyny i przenieś w odpowiedniej ilości pożywki wczesne komórki śródbłonka pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych (EEC), gdy komórki osiągną subkonfluencję, aby doprowadzić je do 80% konfluencji. Usuń pożywkę, wypłucz komórki buforem PBS i inkubuj je w 1 ml Accutane na 25 cm² przez 2 do 10 minut.

Po odklejeniu się komórek, podzielić je w stosunku jeden do pięciu w świeżej pożywce w celu analizy migracji komórek śródbłonka za pomocą testu w komorze Boydena. Powlec wkładki z filtrem 500 µL świeżo przygotowanej 0,1% żelatyny. Po zebraniu EEC w sposób przedstawiony powyżej, należy policzyć komórki i dodać 500 µL pożywki do hodowli komórkowej do dolnych komór komory Boydena.

Następnie do każdego filtra dodaj dokładnie 10⁴ EEC w 500 µL pożywki. Po usunięciu pęcherzyków powietrza umieść komorę Boydena w inkubatorze dokładnie na osiem godzin. Po zakończeniu inkubacji przepłucz filtry jednokrotnie za pomocą PBS.

Następnie, po 20 minutach, utrwalone komórki poprzez dodanie 0,5 ml 4% paraformaldehydu do obu komór. Filtry przemyć co najmniej trzy razy 0,1 M PBS, a następnie wyciąć membrany skalpelem. Do zamontowania każdej membrany pomiędzy dwiema szkiełkami podstawowymi użyć medium montażowego uzupełnionego o DPI.

Należy zwrócić uwagę na orientację filtrów. Następnie, używając mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 400 x, należy policzyć wyłącznie komórki, które przemieściły się do dolnej komory. Należy uważać, aby nie pomylić porów z migrującymi komórkami.

Aby rozpocząć test gojenia ran, należy ręcznie usunąć komórki z naczynia z hodowlą EEC o 80% konfluencji, delikatnie przesuwając sterylną końcówkę pipety 10 µL po powierzchni hodowli w linii prostej od jednej do drugiej strony naczynia. Płytkę należy dwukrotnie przemyć 0,1 M PBS, aby usunąć oderwane komórki. Następnie do naczynia z hodowlą należy dodać pożywkę uzupełnioną o badany związek.

Następnie umieść szalkę hodowlaną pod mikroskopem umożliwiającym obrazowanie żywych komórek w warunkach hodowli komórkowej i wykonaj zdjęcia w trybie time-lapse przez 24 godziny w odstępach 10 minut, stosując rozdzielczość co najmniej 10 24 na 10 24 na koniec sesji obrazowania. Użyj odpowiedniego narzędzia programowego do pomiaru szerokości szczeliny w czasie 0 i 24 godzin w celu przeprowadzenia testu śledzenia komórek. Zaimportuj sekwencję obrazów do programu ImageJ i aktywuj wtyczkę MT track J dla ImageJ.

Następnie, korzystając z polecenia add, wybierz losowo 10 komórek w polu widzenia, aby ręcznie śledzić ich ruch w ciągu 24-godzinnego okresu obrazowania. Użyj polecenia measure, aby wyświetlić wyniki. Następnie użyj polecenia movie, aby wyeksportować ścieżki w celu oceny potencjału błony mitochondrialnej komórek po potraktowaniu badanym związkiem eksperymentalnym; zastąp pożywkę hodowlaną dwiema mikrolitrami świeżo przygotowanego TMRM w jednym mililitrze świeżej pożywki hodowlanej.

Po usunięciu pożywki, bez przemywania, należy natychmiast umieścić szalkę pod mikroskopem i wykonać zdjęcia komórek kontrolnych oraz poddanych działaniu czynnika eksperymentalnego, nie zmieniając parametrów akwizycji. Aby zapewnić porównywalność między różnymi grupami, należy pamiętać, że gojenie ran wymaga angiogenezy, która zależy od migracji komórek śródbłonka, co zilustrowano na wykresie przedstawiającym ekspozycję EEC na czynnik alkilujący. Chlorambucyl powoduje istotny spadek migracji komórek, co zmierzono za pomocą testu w komorze Boydena. Dodanie kwasu alfa-linolenowego, będącego zmiataczem reaktywnych form tlenu (ROS), bezpośrednio po 24-godzinnej ekspozycji na chlorambucyl, znacząco przywraca fenotyp prawie do poziomu kontrolnego.

Test w komorze Boydena nie dostarcza jednak informacji o zachowaniu migracyjnym komórek w tym reprezentatywnym teście gojenia ran. Nieeksponowane EEC były w stanie zamknąć lukę w ciągu 24 godzin, podczas gdy EEC traktowane chlorambicilem nie zdołały tego zrobić. Co więcej, śledzenie poszczególnych EEC wykazało, że komórki eksponowane na chlorambicil wykazywały niewielki ruch, który został przywrócony po zastosowaniu wymiatacza ROS.

W rzeczywistości EEC eksponowane na chlorambacyl wykazują spadek potencjału błony mitochondrialnej, co obrazuje brak ekspresji TMRM. Leczenie EEC pogromiecie lśniących form tlenowych (ROS) zapobiegło jednak tym uszkodzeniom mitochondriów, utrzymując ich potencjał błony mitochondrialnej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak analizować migrację chemicznie zaburzonych komórek śródbłonka za pomocą zmodyfikowanego testu w komorze punktowej z wykorzystaniem testu gojenia rany (scratch wound assay) oraz jak oceniać ich potencjał błony mitochondrialnej.