Ex vivo Hodowla łuków gardłowych w celu zbadania przodków serca i mięśni oraz ich niszy

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie utrzymania, migracji i losu komórek progenitorowych serca i mięśni w mezodermie gardła. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie łuków gardłowych ze świeżo pobranego zarodka myszy. Następnie łuki umieszcza się w folii z nośnikiem, aby ułatwić ich mocowanie.

Komórki znajdujące się w obrębie lub migrujące z planu gardła są następnie codziennie monitorowane. Ostatecznie, fluorescencyjne śledzenie linii genealogicznych na podstawie Cree może być wykorzystane do śledzenia migracji, różnicowania i odnawiania komórek progenitorowych serca i mięśni w obrębie łuków gardłowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to jedyny system ex vivo do badania odnawiającej się populacji komórek progenitorowych serca lub mięśni oraz ich mikrośrodowiska in vitro.

Demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ łuki rodzicielskie w 9,5-dniowych zarodkach myszy mają wielkość od dwóch do 300 mikrometrów, co sprawia, że są one bardzo trudne do zidentyfikowania i wypreparowania bez wcześniejszej wizualizacji. Przed rozpoczęciem zabiegu. Coda 12, płytka studzienkowa z PBS uzupełnionym 10% FBS.

Po godzinie zastąp roztwór powlekający 200 mikrolitrami wolnego podłoża surowicy na studzienkę. Obracaj płytą, aby upewnić się, że warstwa medium pokrywa całą powierzchnię dna studzienki. Następnie spryskaj i oczyść brzuch ciężarnej myszy poddanej eutanazji 70% etanolem.

Następnie za pomocą sterylnych narzędzi wykonaj 0,5-centymetrowe nacięcie w regionie morskim. Chwyć skórę powyżej i poniżej nacięcia i delikatnie pociągnij w przeciwnych kierunkach. Następnie wykonaj nacięcie w kształcie litery V w błonie od pępka do jajników po obu stronach brzucha, aby odsłonić macicę.

Ściśnij jajowód łączący macicę z jajnikiem za pomocą kleszczy, a jajowód po stronie jajnika nożyczkami, aby uwolnić macicę z jajnika. Delikatnie podciągając macicę za pomocą uct. Wytnij macicę z okolicy pęcherza moczowego.

Następnie pociągnij macicę dalej do góry za pomocą uct i przetnij UCT po drugiej stronie, uwalniając macicę z jamy brzusznej. Przenieś macicę do 50-mililitrowej probówki zawierającej 20 mililitrów zimnego, sterylnego PBS z wapniem i magnezem. Delikatnie potrząsaj probówką przez 10 sekund, aby wypłukać krew.

Następnie za pomocą kleszczy przenieś macicę do 10-mililitrowego naczynia i dodaj pięć mililitrów zimnego PBS do tkanki. Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, użyj dwóch par kleszczy, aby delikatnie otworzyć macicę i wypreparować worki owodniowe zawierające zarodki jeden po drugim. Następnie dla każdego zarodka po kolei uszczypnij i delikatnie usuń worek owodniowy jedną parą kleszczy, używając drugiej pary do przecięcia i uwolnienia worka z zarodka.

Umieść zarodek na boku i za pomocą kleszczy przeciąć pierwszy i drugi łuk z tyłu serca między łukiem a torebką gardłową. Po odwróceniu zarodka i przecięciu łuku po drugiej stronie jest właśnie pokazany. Przeciąć drogę odpływową serca łączącą łuki z zarodkiem i usunąć je.

Ściśnij i zwolnij każdy z dwóch łuków gardłowych z pozostałej drogi odpływu serca i czterech endodermy jelitowej. Z kolei następnie przenieś tkanki do środka poszczególnych dołków powlekanej płytki 12-dołkowej, uważając, aby łuki nie były pokryte podłożem. Aby ułatwić przyczepianie, inkubuj łuki w warunkach hodowli komórkowej.

Po dwóch godzinach dodaj 200 mikrolitrów 37 stopni Celsjusza, pożywkę wolną od surowicy po bokach studzienek, uważając, aby łuki pozostały przyczepione i inkubuj tkanki przez noc. Następnego dnia wizualnie potwierdzono, że łuki są nadal przymocowane. Następnie delikatnie dodaj do studzienek 200 dodatkowych mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Jeśli tkanki odczepią się i zaczną unosić się na wodzie, delikatnie usuń pożywkę pipetą, nie usuwając łuków, aż pozostanie tylko warstwa podłoża. Następnie użyj końcówki pipety, aby przesunąć łuki z powrotem do środka studzienki i ponownie inkubować tkanki. Co drugi dzień zastąp odparowaną pożywkę 100 do 200 mikrolitrami świeżej pożywki podczas rozwoju.

Mięśnie progenitorowe twarzy i serca można prześledzić, gdy proliferują i migrują z pierwszego i drugiego łuku gardłowego, aby stać się odpowiednio mięśniami głowy i serca. Hodowla łuków gardłowych oferuje unikalny sposób na szczegółowe badanie rozwoju serca i mięśni ex vivo. Korzystając z systemu blokady CRE, potomstwo mezodermy myszy można śledzić za pomocą fluorescencyjnych reporterów po ekspresji Cree w ciągu 24 do 48 godzin od hodowli ex vivo po 36 do 72 godzinach.

Powstawanie kardiomiocytów można wizualnie potwierdzić poprzez spontaniczne kurczenie się klastrów migrujących komórek w obrębie drugiego łuku, a także poprzez analizę specyficznych markerów kardiomiocytów. Po trzech do siedmiu dniach hodowli, rurkę mięśniową i tworzenie mięśni twarzy można uwidocznić jako wydłużone i spontanicznie drgające komórki w pierwszym łuku oraz poprzez analizę określonych markerów mięśniowych po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek macierzystych serca i mięśni do bezpośredniego monitorowania i badania rozszerzających się komórek progenitorowych i ich nisz in vitro.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozwarstwiać łuki otworowe od rozwijających się zarodków myszy i do hodowli in vitro, co pozwala na badanie rozwoju progeneratywnego serca i mięśni ex vivo.