In vitro Modelowanie nowotworowej inwazji neuronalnej: model zwoju korzenia grzbietowego

Ten artykuł wideo pokazuje zastosowanie modelu zwojów korzenia grzbietowego (DRG)/komórek rakowych w gruczolakoraku przewodowym trzustki.

Ogólnym celem tego modelu jest rekapitulacja nowotworowego mikrośrodowiska nerwowego. Umożliwia to eksplorację interakcji neuronów komórek nowotworowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrośrodowiska guza, takie jak interakcja między komórką nowotworową a neuronami oraz wzajemny wpływ każdego zestawu.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest niezawodna, łatwa do wykonania i odnosi się zarówno do czynników komórkowych, jak i mózgowych w niszy neuronalnej. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku rozwoju terapeutycznego i farmakologicznego ukierunkowania na kluczowe czynniki w procesie przebudowy i inwazji neuronów w trakcie rozwoju raka. Po eutanazji zwierzęcia w komorze CO2 namocz futro 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.

Przypnij mysz w pozycji leżącej, a następnie wykonaj nacięcie w linii środkowej, rozciągające się czaszkowo-ogonowo od tylnej szyi do grzbietu drewna. Następnie za pomocą kleszczy podnieś płaty skórne obustronnie i odsłonij tkankę podskórną. Dotykaj czaszki myszy, aż zostanie zidentyfikowane połączenie czaszkowo-szyjne.

Użyj nożyczek ustawionych pod kątem prostopadłym do zwierzęcia, aby przeciąć mięśnie szyjki macicy i kręgosłup na skrzyżowaniu czaszkowo-szyjnym. Następnie rozetnij kręgosłup doogonowo i użyj nożyczek, aby wykonać pełną transsekcję ogonową na piątym kręgu lędźwiowym. Następnie ustaw mysz w pozycji leżącej, a po wykonaniu nacięcia wzdłuż linii środkowej od szyi do brzucha cofnij skórę na boki, a następnie rozetnij otrzewną.

Czaszkowo otwórz ścianę klatki piersiowej nożyczkami. Po usunięciu narządów otrzewnowej i zaotrzewnowej użyj kleszczy i ostrza chirurgicznego, aby przeciąć żebra, pozostawiając około pięciu milimetrów żeber wystających z kręgosłupa. Usuń kręgosłup od reszty ciała.

i umyć dwukrotnie zimnym PBS. Ustaw kręgosłup skierowany do góry w tej samej orientacji czaszkowo-ogonowej na nieprzylegającej platformie absorpcyjnej pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w 4-krotne powiększenie. Patrząc przez ten mikroskop stereoskopowy, usuń wszelkie mięśnie rdzenia kręgowego i tkankę łączną.

Użyj żeber jako punktów orientacyjnych dla nerwów, ponieważ opuszczają one kręgosłup. DRG znajdują się na kręgach szyjnych, piersiowych i lędźwiowych. Użyj nożyczek, aby przeciąć trzon kręgu w linii środkowej, tworząc okno do rdzenia kręgowego, a następnie delikatnie cofnij trzon kręgu, aby odsłonić rdzeń kręgowy i korzenie DRG.

Następnie za pomocą nożyczek sprężynowych zdejmij górne żebro, aby odsłonić DRG. Podążaj za nerwem obwodowym przyśrodkowo wzdłuż żebra bocznego do DRG. Zidentyfikuj DRG, który można opisać jako wyglądający jak żółtko jajka sadzonego leżące na nerwie.

Przeciąć nerw międzyżebrowy dystalnie do DRG, pozostawiając dwa do trzech milimetrów dystalnego nerwu do zwojów, który zostanie użyty do retrakcji. Ostrożnie chwyć nerw odprowadzający za pomocą kleszczy, nie ściskając ani nie uszkadzając DRG. Teraz zastosuj delikatną retrakcję do DRG, pociągając nerw na boki.

Następnie przetnij przednie i tylne korzenie w pobliżu DRG. Przenieś wyizolowany DRG na 35-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną lodowato uzupełnionym DMEM. Pracując w okapie z przepływem laminarnym, umieść 35-milimetrową szklaną płytkę Petriego na papierowej siatce na lodzie.

Używając wstępnie schłodzonej końcówki pipety, dozuj około 10 mikrolitrów ECM ze zubożonym czynnikiem wzrostu na środku siatki. Podczas oglądania anteny przez mikroskop stereoskopowy pod powiększeniem od 2 do 4x, umieść DRG na środku ECM blisko dna czaszy. Po zebraniu i umyciu 40 000 komórek rakowych z kultur zlewających się, ponownie zawiesić osad i 40 mikrolitrów ECM na lodzie.

Jeszcze raz obejrzyj siatkę przez mikroskop stereoskopowy, zmierz 500 mikronów z DRG i w tym momencie dozuj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek. Powtórz we wszystkich kierunkach od DRG. Pozostaw naczynie w okapie z przepływem laminarnym na 10 do 15 minut, aby stężało, ale nie wyschło.

Gdy ECM zastygnie, powoli dodawać uzupełniony DMEM, pipetując do ścianki bocznej płytki. Dodaj około dwóch mililitrów pożywki, wystarczająco dużo, aby pokryć ECM. Dodawanie DMEM powinno odbywać się bardzo powoli, pipetując do ścianki bocznej płytki, aby uniknąć oderwania DRG od dna płytki.

Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych i postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w pisemnej części protokołu, aby utrzymać hodowlę. Ta mikrofotografia pokazuje DRG w górnej części pola widzenia i komórki rakowe w dolnej części pola widzenia w dniu zero po wysiewie. Tutaj ta sama kultura jest pokazana siedem dni po wysianiu.

Jak wskazują strzałki, komórki rakowe migrują wzdłuż neuronu DRG. Ten histogram pokazuje wskaźnik inwazji nerwów DRG różnych typów komórek nowotworowych. Można zauważyć, że komórki Kpc 989 i MiaPaCa mają wyższy wskaźnik inwazji nerwów niż komórki QLL2 lub NIH3T3.

Ten wykres współrzędnych przedstawia ścieżkę migracji komórki rakowej Kpc w kontakcie z nerwem pokazaną na czerwono i komórki QLL2 pokazaną na fioletowo. Pokazane są współrzędne X i Y. Rysunek ten przedstawia analizę od odległości pochodzenia dla migrujących komórek nowotworowych QLL2 z kontaktem aksonalnym.

Tutaj pokazano odległość pochodzenia komórek rakowych Kpc. W każdym przypadku kierunek migracji był w kierunku zwoju nerwowego. Próbując tej procedury, należy pamiętać o przygotowaniu większej liczby zwojów niż jest to wymagane, ponieważ wskaźnik kontroli nie wynosi 100%Po jego opracowaniu, motyw DRG utorował drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad rakiem do zbadania niszy neuronalnej w mikrośrodowisku guza.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozpoznać anatomiczne punkty orientacyjne, takie jak DRG w myszy, wyodrębnić DRG i wreszcie, jak wyhodować go w DCM. Przedstawiono również kokulturację DRG wraz z komórkami nowotworowymi.