Metody badania regulacyjnej roli małych RNA i rybosomalnego zajmowania Plasmodium falciparum

Ludzkie mikroRNA przemieszczają się z erytrocytów gospodarza do pasożytów Plasmodium falciparum. W tym miejscu opisano techniki stosowane do transfekcji syntetycznych mikroRNA do erytrocytów gospodarza i wyizolowania wszystkich RNA z P. falciparum. Ponadto w artykule szczegółowo opisano metodę izolacji polisomów u P. falciparum w celu określenia zajętości rybosomalnej i potencjału translacyjnego transkryptów pasożytów.

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie roli mikroRNA erytrocytów w potranskrypcyjnej regulacji genów transkryptów plasmodium falciparum. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie malarii, takie jak to, w jaki sposób zdarzenia splicingu RNA z małymi RNA gospodarza lub pasożyta mogą wpływać na potencjał translacyjny fuzyjnych mRNA. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wychwytywania całkowitych i małych RNA razem w jednej puli, wykazując obecność małych RNA i fuzyjnych RNA w jednej komórce.

Dodatkowo procedura ta wykorzystuje profilowanie polisomów, aby pokazać, w jaki sposób te małe RNA wpływają na translację ich produktów fuzji mRNA. Aby rozpocząć transfekcję przez centif 300 mikrolitrów czerwonych krwinek w kompletnym podłożu malarii w 800 razy G przez pięć minut. Umyj erytrocyty dwukrotnie pożywką RPMI, ponownie zasmów komórki w pełnej mieszance cyto w 50% hematokrycie.

Następnie przenieś komórki do elektroporacji i dodaj 10 mikrogramów mikro RNA sprzężonego z biotyną DYS th lub niesprzężonego mikro RNA kontroli negatywnej. Aby naelektryzować ogniwa, umieść vete w elektroporowanym i dostarcz pojedynczy impuls. Następnie płytki komórek i zainfekuj je Plasmodium falciparum po czterech godzinach, jak opisano w protokole tekstowym.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów zapakowanego, pozbawionego pasków i kulek do 10 mikrogramów RNA pasożyta w mikrocentralnej probówce i inkubuj probówkę z rotacją przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować pasek davan i kulki w temperaturze 800 razy G przez 30 sekund, a następnie przepłukać osad 500 mikrolitrami buforu RNP zawierającego inhibitor RNA o rozcieńczeniu od 1 do 1000. Następnie eluuj RNA z kulek przez Resus, zawieszając je w 200 mikrolitrach RNA.

Wychwytywać bufor elucyjny zawierający nadmiar biotyny. Inkubuj koraliki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z rotacją. Następnie odwirować kulki w temperaturze 800 razy G przez 30 sekund i zebrać supernatant RNA.

Bardzo ważne jest, aby eluować z nadmiarem biotyny i użyć minimalnej ilości paciorkowca i kulek, aby zapewnić prawidłową właściwą elucję. Zmniejsza to wzbogacanie tła RNA. Na koniec określ stopień wzbogacenia transkryptów P falciparum i wzbogacenia mikro RNA za pomocą ilościowego R-T-P-C-R, jak opisano w protokole tekstowym, aby rozpocząć separację polysoomów.

Najpierw umieść pięć mililitrów 50% roztworu sacharozy w probówce ultrawirówkowej. Następnie ostrożnie nałożyć pięć mililitrów 15% roztworu sacharozy na 50% roztwór. Następnie uszczelnij rurkę gradientową perfilem i ostrożnie przechyl rurkę, aż będzie leżeć poziomo na blacie.

Upewnij się, że rurka jest w stabilnej pozycji, aby zapobiec stoczeniu się. Utrzymuj rurkę w tej pozycji przez co najmniej dwie godziny, aby umożliwić utworzenie się gradientu. W międzyczasie zbierz około 100 mililitrów asynchronicznej kultury krwi zakażonej zarodźcem w stężeniu od trzech do 5% persitu.

Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej zawierającej dwa milimolowe cyklo, heide i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 500 razy G przez siedem minut, a następnie umyj je dwukrotnie 80 mililitrami PBS zawierającym 200 mikromolowych cyklo heide resus. Zawiesić osad w PBS z cykloheksymidem i umieścić go na lodzie.

Osadzać komórki i usuwać supernatant, aby oszacować objętość osadu. Następnie utrzyj komórki w końcowej objętości 4,25 mililitra lizy, buforuj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z rotacją. Wcześniejsze próby profilowania polisomów i gatunków wywołujących malarię ujawniły głównie mono, ponieważ liza ponentów prowadzi do rozpadu polisomu na strefy mono

Tutaj wykorzystujemy bufor do lizy, który jednocześnie lizuje erytrocyty i pasożyty, aby zachować wzór polisomowy plasmodium falciparum, przenosi lizat do mikroprobówek wirówkowych, a następnie wiruje z prędkością 16 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. W oddzielnej, wstępnie schłodzonej, pięciomililitrowej probówce ultrawirówkowej dodaj 1,25 mililitra zimnego 0,5-molowego roztworu poduszki sacharozy za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 27. Ostrożnie ułóż 3,75 mililitra supernatantu lizatu nad poduszką sacharozy.

Odwirować próbkę w temperaturze 366 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 146 minut. W tym czasie powoli odłóż probówkę ultrawirówki z sacharozą do pozycji pionowej i pozostaw ją na lodzie na co najmniej 15 minut. Po wyjęciu lizatu z ultrawirówki ostrożnie zebrać supernatant w 15-mililitrowym stożkowym dwa.

Przechowuj supernatant w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby zachować frakcję RNA niezwiązaną przez rybosomy. Następnie ponownie zawieś osad rybosomu w 500 mikrolitrach zawiesiny Resus, buforuj przez pipetowanie przez pięć minut, aby wymieszać odwirować próbkę w temperaturze 16 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Aby usunąć nierozpuszczalny materiał, ostrożnie usuń uszczelkę param z rurki gradientowej, aby uniknąć zakłócenia gradientu, a następnie nałóż zawiesinę rybosomalną na wierzch za pomocą strzykawki i igły o rozmiarze 27.

Po odwirowaniu probówki w temperaturze 200 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 180 minut, przechowuj gradienty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do załadowania do frakcjonatora. Umieść pustą probówkę ultrawirówki w frakcjonatorze gradientowym i myj system wodą wolną od RNA przez pięć minut. Podczas prania ustaw czułość detektora absorbancji UV na 254 nanometry na 0,2.

Chociaż może to wymagać dostosowania w zależności od sygnału. Następnie ustaw sygnał linii bazowej na zero, gdy woda przepływa przez detektor. Po umyciu kolektora należy odwrócić przepływ płynu przez frakcjonator w celu opróżnienia przewodów, a następnie wyjąć pustą probówkę ultrawirówki.

Przepuścić 60% roztwór sacharozy przez FRAKCJONATOR, aż opuści on aparat igłowy. Następnie umieść załadowaną rurkę gradientową w górnej części komory załadowczej i dokręć uszczelkę. Przekłuć igłą spód rurki.

Następnie zresetuj prędkość przepływu frakcjonatora do 12,5 na 10 i zbierz 18 sekundowych frakcji w mikroprobówkach wirówkowych. Rozpocznij przepływ do przodu 60% roztworu sacharozy, aby wymyć frakcje, zanim pierwsza kropla roztworu gradientowego dostanie się do mikroprobówki wirówkowej. Rozpocznij zarówno zbieranie, jak i rejestrowanie na żywo absorbancji przy sygnale 254 nanometrów.

Gdy sygnał absorpcyjny gwałtownie spadnie na granicy 50% i 60% roztworu sacharozy, zatrzymaj przepływ i nagrywanie. Przechowuj frakcje gradientu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie odwróć przepływ płynu, aż 60% roztwór opróżni się z probówki ultrawirówki.

Wyjmij rurkę i rozpocznij analizę następnego gradientu. Transfekcja czerwonych krwinek mikroRNA 4 5 1, a następnie odzyskanie biotynylowanych hybryd mRNA mikro NA ujawniła wzbogacenie transkryptów fuzyjnych PKAR. Pozorowana lub niepowiązana transfekcja mikro RNA nie wzbogaciła transkryptu PKAR.

Dane pokazują wyraźne piki podjednostek rybosomalnych 40 s i 60 s, rybosom DS oraz frakcje polisomów zawierające wskazaną liczbę rybosomów. Rybosomy były związane z transkryptami wyizolowanymi z PCI znajdującymi się w czerwonych krwinkach. Analiza krwi północnej wykazała, że rybosomy i polisom były związane z 18 S i 28 SRNA.

Wraz z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak trawienie R nase H, testy ochrony rybonukleazy i northern blotting w celu dodatkowego potwierdzenia obecności mikroRNA MR. Fuzje NA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak transfekować mikroRNA do erytrocytów, a następnie wychwytywać małe RNA z całkowitym RNA, w tym chimeryczne transkrypty. Powinieneś również być w stanie odzyskać polysome, aby określić zajętość rybosomalną, a tym samym potencjał translacyjny tych transkryptów fuzyjnych.