Wykorzystanie ex vivo pionowych kultur kropelkowych całych narządów płodu do badania procesów rozwojowych podczas organogenezy myszy

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie wpływu inhibitorów małocząsteczkowych na rozwój narządów płodu przy użyciu techniki hodowli kropelkowej ex vivo. Osiąga się to poprzez najpierw otwarcie otrzewnej ciężarnej myszy i usunięcie zarodka zawierającego macicę. Następnie zarodki są usuwane z macicy i uwalniane z żółtka i worków owodniowych.

Następnie kompleks neph goad me jest preparowany i izolowany z zarodka. Wreszcie, kompleks oścień Meris jest hodowany w kropelce z inhibitorem małocząsteczkowym lub bez niego. Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna służy do pokazania zmian w architekturze narządów przy użyciu przeciwciał specyficznych dla typu komórki.

Tak więc zaletą naszej wyprostowanej hodowli kropelkowej ex vivo całego narządu w porównaniu z powiedzmy liniami hodowli komórkowych jest to, że ma ona tę zaletę, że ma trójwymiarową strukturę powodującą interakcje komórkowe ze względu na lokalizację, a także zewnątrzkomórkową sygnalizację macierzystwą, która może być ważna dla tworzenia i modelowania narządów. Co więcej, nasza technika pionowych kropel pozwala na użycie mniejszej ilości odczynników, zmniejszając w ten sposób koszty i potencjalną toksyczność spowodowaną skutkami ubocznymi. Jest to przewaga nad innymi technikami pracy całego narządu, a mimo to pozwala na dyfuzję środków farmakologicznych do narządu docelowego.

Chociaż technika ta może zapewnić wgląd w rozwój naczyniowy jąder płodu, może być również stosowana do innych narządów płodu, takich jak płuca, a także możemy jej używać do badania różnych procesów biologicznych. Istnieją inne szlaki sygnalizacji komórkowej podczas rozwoju płodu W E 11.5. Po eutanazji ciężarnej myszy, zgodnie z tekstem, użyj 70% etanolu, aby spryskać brzuch cienkimi nożyczkami.

Wykonaj nacięcie w kształcie litery V, aby otworzyć skórę brzucha i otrzewnej i odciągnij płat tkanki, aby odsłonić narządy przednie. Zlokalizuj jajniki na obu końcach rogu macicy, a następnie nożyczkami naciąć jajnik i tkankę łączną, aby oddzielić macicę zawierającą zarodki od ciała matki. Następnie otwórz ścianę macicy, delikatnie przecinając stronę przeciwną do łożyska, odsłaniając worki z żółtkiem.

Uważaj, aby nie przebić worka z żółtkiem, aby uniknąć uszkodzenia lub utraty zarodków. Następnie przetnij w pobliżu łożyska, aby usunąć zarodek zawierający worki z żółtkiem i umieść je w naczyniu zawierającym PBS z wapniem i magnezem, co pomoże wspomóc cząsteczki adhezyjne komórek w celu utrzymania architektury tkanki i zapobiegnie przywieraniu tkanki do narzędzi Za pomocą kleszczy usuń woreczek żółtkowy i owodnię z zarodka, ostrożnie nakłuwając woreczek żółtkowy, aby stworzyć otwór, w którym zarodek może się wysunąć. Gdy zarodek znajdzie się poza woreczkiem żółtkowym, przetnij pępowinę.

Od tego momentu należy używać mikroskopu umieszczonego w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych. Usuń głowę zarodka, używając kleszczy, aby uszczypnąć po obu stronach szyi, wyrzuć głowę, usuń ogon i umieść ją w nowej probówce do mikrowirówki w celu analizy X-Y-P-C-R w celu określenia płci zarodka. Teraz zabezpiecz zarodek w pozycji leżącej na dnie naczynia hodowlanego, używając pary kleszczy, aby przypiąć pachy zarodka inną parą kleszczy.

Usuń skórę pokrywającą brzuch i delikatnie usuń wątrobę, jelita i inne narządy, aby odsłonić ścianę tylnej części ciała, gdzie znajduje się grzbiet moczowo-płciowy. Użyj kleszczy, aby zgarnąć pod grzbietem moczowo-płciowym, ostrożnie otwierając kleszcze i podnosząc do góry. Usuń grzbiet moczowo-płciowy.

Uważaj, aby nie uszkodzić gonad. Przenieś grzbiet moczowo-płciowy do naczynia C-D-M-E-M, aby zaaklimatyzować tkankę do podłoża za pomocą igieł o rozmiarze 27, aby oddzielić kompleks gonady Sphs od reszty mostu moczowo-płciowego. Użyj jednej igły do cięcia, dociskając, a drugiej, aby prawidłowo poprowadzić tkankę, aby umożliwić optymalne oddzielenie od hodowli.

Gonada z inhibitorem małych cząsteczek ustawiła dwie pipety o pojemności 20 mikrolitrów na 15 mikrolitrów każda za pomocą czystej, wysterylizowanej żyletki. Odciąć około jednego do dwóch milimetrów od jednej z końcówek pipet barierowych w celu przeniesienia gonad i dodania kontroli C-D-M-E-M. Ułóż gonady tak, aby ich długa oś była równoległa do końcówki pipety, aby można je było łatwo pipetować za pomocą końcówki odcinającej Oznacz jedną stronę 35-milimetrowej pokrywki naczynia jako kroplę kontrolną, a drugą jako kropelkę zawierającą lek.

Upewnij się, że etykiety na pokrywkach są zgodne z etykietami na tkance ogonowej zawierającej mikroprobówki wirówkowe. Odpipetować 15 mikrolitrów C-D-M-E-M zawierających pojedynczą gonadę do kropelki w pokrywce. Uważając, aby gonady nie przykleiły się do wewnętrznej strony końcówki pipety i powtórz z drugą kroplą po drugiej stronie.

Sprawdzić pod mikroskopem, czy gonady zostały przeniesione do kropli wyznaczonej jako kontrola. Za pomocą pipety kontrolnej dodać dodatkowe 15 mikrolitrów C-D-M-E-M zawierających DMSO, aby uzyskać kroplę o wielkości 30 mikrolitrów do drugiej kropli. Użyj pipety przeznaczonej do stosowania leku, aby dodać 15 mikrolitrów TKI dwa do C-D-M-E-M za pomocą pipety.

Rozłóż kropelki w rozszerzający się okrągły wzór, aż osiągną średnicę około 15 do 18 milimetrów, a gonada znajduje się mniej więcej pośrodku. Ustaw gonadę tak, aby leżała na boku, a oścień i mesyny były łatwe do odróżnienia. Ustaw płuca tak, aby dwa płaty leżały płasko i były utrzymywane na miejscu przez napięcie powierzchniowe, nie stykając się ze sobą.

Ostrożnie umieść pokrywkę naczynia hodowlanego z kropelkami pionowo i połóż płasko na powierzchni wody w dużym naczyniu nawilżacza, upewniając się, że pod spodem nie ma pęcherzyków i że woda nie dostała się do pokrywki. Aby stworzyć małą wilgotną komorę, natychmiast przykryj duże naczynie pokrywką, upewniając się, że małe pokrywki naczyń mogą się swobodnie poruszać w większym naczyniu i że może nastąpić wymiana powietrza. Po umieszczeniu dwóch małych pokrywek w komorze, natychmiast umieść komorę w inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 48 godzin.

Przeprowadź PCR i immunofluorescencję zgodnie z protokołem tekstowym. W przypadku hodowli przy użyciu systemu hodowli kropelkowej Exvivo, płodowe kompleksy gona sphs mają wysoki wskaźnik przeżywalności, jak pokazano tutaj. Porównanie gonad E 11,5 w początkowej inkubacji z 24 lub 48 godzinami w hodowli ujawnia dramatyczną zmianę w kształcie gonad i pojawienie się prążkowanych struktur sznurowych w kontrolnej gonadzie XY, jak widać tutaj.

System hodowli kropelkowej może odtworzyć zdarzenia różnicowania jąder ex vivo, ponieważ możliwe jest uwidocznienie SOX dziewięciu dodatnich komórek Sertoliego w gonadach XY tworzących się w rurki przypominające sznury i naczynia krwionośne tworzące się w całym narządzie. W płucach 48-godzinna hodowla powoduje zwiększone rozgałęzienie SOX dziewięciu podwójnie dodatnich gałęzi nabłonka ekoherryny. Chociaż występuje pewien wzrost liczby komórek apoptotycznych w płucach, w tych samych warunkach hodowli podobne poziomy apoptozy obserwuje się w hodowlach kontrolnych i w macicy.

Gonady sugerujące, że gonada jest szczególnie podatna na warunki hodowli. Do zbadania wpływu unaczynienia i przebudowy naczyń krwionośnych w morfogenezie jąder wykorzystano małocząsteczkowy inhibitor TKI dwa, który blokuje aktywność receptorów VEGF. Wyniki pokazują, że zakłócenie przebudowy naczyń krwionośnych w jądrze płodu jest skuteczne w systemie hodowli kropelkowej, a późniejsze defekty w morfogenezie rdzenia jądra można uwidocznić po tej procedurze.

Inne metody, takie jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym, sekwencjonowanie RNA nowej generacji lub cytometria przepływowa, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, jak różne odczynniki farmakologiczne wpływają na ekspresję białka lub genów będących przedmiotem zainteresowania. Dodatkowo możemy użyć poklatkowego obrazowania na żywo do wizualizacji dynamiki komórkowej w czasie rzeczywistym, jeśli używane są transgeniczne zarodki fluorescencyjne. Ponadto dostępna jest szeroka gama odczynników do celowania w potencjalne szlaki sygnałowe, które mogą być zaangażowane w organogenezę płodu.

Techniki te pomogą nam zrozumieć podstawowe mechanizmy, które napędzają rozwój płodu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wykonać ex vivo pionowe hodowle kropelkowe całego narządu w celu wyjaśnienia szlaków sygnałowych podczas organogenezy płodu. Technika ta polega na rozbiorze zarodków w połowie ciąży, izolacji narządów docelowych oraz przygotowaniu pionowych kultur kropelkowych do inkubacji tych narządów za pomocą odczynników farmaceutycznych.