Dokładne i wolne od fenolu określanie płci DNA zarodków świń w dniu 30 za pomocą PCR

Ogólnym celem tej procedury jest dokładna identyfikacja płci zarodków świni w 30. dniu przy użyciu wolnego od fenolu DNA uzyskanego z każdego zarodka. I dwie pary starterów specyficznych dla płci do reakcji PCR. Metoda ta może potencjalnie odpowiedzieć na różne pytania związane z fizjologią rozrodu u zwierząt gospodarskich, takie jak wpływ czynników matczynych na stosunek płci, w tym pojemność macicy i stan metaboliczny lochy, a także różne czynniki ojcowskie.

Zaletą tej techniki jest brak toksycznych substancji chemicznych, takich jak fenol-chloroform, ani drogich kolumn podczas oczyszczania DNA. A więc ruszajmy w trasę. Wizualna demonstracja tej metody jest równie ważna jak przygotowanie objawów.

Kroki są łatwe do nauczenia, ale ważne jest zwrócenie szczególnej uwagi na szczegóły, aby uniknąć zakażenia krzyżowego objawów. Przenieś próbki zarodków do ujemnej zamrażarki o temperaturze osiemdziesięciu stopni Celsjusza, zgodnie z tekstem. Oznacz probówki z próbkami identyfikatorem próbki potrzebnym do określenia liczby próbek do analizy.

Użyj suchego lodu, aby napełnić do połowy pojemnik termiczny i włóż wstępnie oznaczoną probówkę z próbką do suchego lodu. Ubrany w rękawiczki zimowe, z parą rękawiczek diagnostycznych na wierzchu, przenieś wstępnie schłodzone moździerze i tłuczki z zamrażarki o temperaturze ujemnych osiemdziesięciu stopni Celsjusza do pojemnika z suchym lodem. Następnie umieść zamrożony zarodek wewnątrz moździerza na suchym lodzie, a następnie wlej odpowiednią ilość ciekłego azotu, aby pokryć zarodek.

I użyj tłuczka, aby zmielić go na drobny proszek. Za pomocą mikroszpatułki przenieś proszek z zarodków do wstępnie oznaczonej probówki z próbką i umieść probówkę w zamrażarce o ujemnych temperaturach osiemdziesięciu stopni. Powtórz mielenie i zamrażanie każdego dodatkowego zarodka, zmieniając rękawiczki badawcze między próbkami, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.

Po oznaczeniu etykietowania wszystkich probówek z mikrowirówkami potrzebnych do określenia liczby próbek, które mają być analizowane, należy przenieść probówki zawierające proszek z zarodków z zamrażarki o temperaturze ujemnych osiemdziesięciu stopni Celsjusza do pojemnika z suchym lodem. Odpipetować 180 mikrolitrów 50-milimolowego wodorotlenku sodu do każdej wstępnie oszlifowanej probówki mikrowirówkowej. Rozgrzej inkubator do dziewięćdziesięciu pięciu stopni Celsjusza.

Za pomocą wykałaczki przenieś około pięciu do dziesięciu miligramów proszku zarodkowego z probówki z próbką do wstępnie znakowanej probówki z wodorotlenkiem sodu. Powoli wyjmij wykałaczkę z roztworu, aby uwidocznić lizat DNA jako lepką białą, przezroczystą substancję. Przenieś próbki z lizatem DNA do inkubatora o temperaturze dziewięćdziesięciu pięciu stopni Celsjusza na pięć minut, a następnie natychmiast przenieś probówkę do izolowanego pojemnika wypełnionego lodem.

Następnie dodaj dwadzieścia mikrolitrów jednego molowego trichlorowodorku bezpośrednio do probówek i postukaj w probówki, aby delikatnie wymieszać. Za pomocą papieru do pomiaru pH upewnij się, że pH wynosi około 8,0. Następnie odwiruj probówki w temperaturze dwóch tysięcy G i utrzymuj temperaturę pokojową przez dwie minuty, aby usunąć nierozpuszczone resztki tkanek.

Przenieść 150 mikrolitrów górnego klarownego supernatantu do nowych probówek. Lub płytka 96-dołkowa. I przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dwóch tygodni.

Lub minus dwadzieścia stopni Celsjusza przez okres do jednego roku. Sukces tego protokołu polega na tym, jak dokładnie zaprojektujesz swój elementarz na chromosomie X i Y. Jak więc upewnić się, że znajdują się na chromosomie X i Y?

Najlepszym sposobem, aby to pokazać, jest przeglądarka NCBI Map Viewer. Aby zaprojektować startery specyficzne dla płci do PCR, skorzystaj ze strony internetowej NCBI, aby uzyskać numery dostępu dla regionu Y.Or określającego płeć znaku porowego Y.Or i białka palca cynkowego sprzężonego z chromosomem X lub ZFX. Skopiuj i wklej numery akcesyjne do internetowego narzędzia do projektowania podkładów.

Użyj nukleotydowego blastu lub blastu N, aby zweryfikować specyficzność starterów w stosunku do obecnej genomowej bazy danych znaków porowych 104. Aby wejść do sekwencji, znajdują się tylko na chromosomie X i Y odpowiednio dla SRY i ZFX. Aby przeprowadzić PCR z lizatami DNA, należy użyć dowolnego enzymu PCR gotowego do startu na gorąco i przygotować mieszankę główną, dodając dwa startery specyficzne dla płci w końcowym stężeniu 0,3 mikromola w 15-mikrolitrowej reakcji PCR.

Po raz pierwszy w przebiegu reakcji należy przygotować jedną probówkę PCR do kontroli ujemnej bez matrycy oraz dwie dodatkowe probówki do kontroli dodatniej, dodając jeden mikrolitr komercyjnie uzyskanego genomowego DNA ze znakiem porów płciowych. W przypadku kolejnych rund PCR należy włączyć jeden mikrolitr próbki z ostatniej udanej analizy płci jako kontrolę pozytywną. Skonfiguruj następujący program PCR w termocyklerze i przeprowadź PCR.

Aby zmienić próbki po PCR, należy przygotować żel agarozowy 2% TBE z barwnikiem w żelu cyber DNA lub bromkiem etydyny. Dodaj 1,5 mikrolitra barwnika o 10-krotnym obciążeniu do próbek przed załadowaniem do żelu i uruchomieniem. Obserwuj i dostosuj intensywność pasma w świetle fluorescencyjnym i uchwyć obraz żelu.

Zidentyfikuj zarodki z jednym prążkiem jako żeńskim i dwoma prążkami jako męskimi. Pokazany tutaj jest reprezentatywny wynik do określania płci z 345 lizatów DNA przebadanych metodą PCR. Optymalna temperatura wyżarzania podkładu wynosząca 65 stopni Celsjusza jest wyraźnie wyższa niż TM pokazanych tutaj podkładów w celu uzyskania podobnej intensywności i przewidywanych rozmiarów ampilkonu.

Prezentowane są tutaj dwa wzmocnione produkty SRY i ZFX. Próbka lizatu z zarodków żeńskich wytwarza tylko pojedynczy prążek 506 par fragmentów DNA z genu ZFX zlokalizowanego na chromosomie X. Wszystkie zarodki męskie wytwarzają dwa fragmenty DNA o jednakowej intensywności 400 par zasad dla SRY i 506 par zasad dla ZFX.

Jak pokazano tutaj, lizaty DNA nie wykazały żadnego hamowania reakcji PCR po przeprowadzeniu badań przesiewowych 345 zarodków. Tylko trzy osobniki nie były płci i odsetek embrionów żeńskich był nieco wyższy niż samców. Po opanowaniu tej techniki od mielenia do przeprowadzenia PCR, przetworzenie około dziesięciu zarodków zajmuje około godziny.

Podczas wykonywania tej techniki ważne jest, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, zwłaszcza podczas przenoszenia proszku zarodkowego do probówek. Zgodnie z tą procedurą możemy użyć innych metod, takich jak metylacja DNA, mikromacierz i sekwencjonowanie, aby zbadać genomiczne i epigenetyczne skutki odżywiania i chorób zakaźnych między płciami. Opracowanie tej techniki utoruje drogę naukowcom z dziedziny fizjologii rozrodu i nauk o zwierzętach do prowadzenia badań związanych z dymorfizmem płciowym u różnych gatunków zwierząt gospodarskich.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak projektować startery specyficzne dla płci, abstrahować DNA z zarodków i przeprowadzać reakcję PCR przy użyciu lizatów DNA. Pamiętaj, że praca z suchym lodem jest dość niebezpieczna, dlatego należy zachować odpowiednie środki ostrożności, nosić rękawice i okulary.