Izolacja i hodowla ex vivo limfocytów T Vδ1⁺CD4⁺γδ, pozatymicznego progenitora komórek αβT

Ogólnym celem tej procedury eksperymentalnej jest ilościowe wyizolowanie i uzyskanie wysoce oczyszczonej populacji rzadkiej jednostki limfocytów T CD four dodatnich V delta i jedna gamma delta, która została wykazana dla komórek progenitorowych alfa beta T. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju dodatkowych limfocytów T grasicy, dotyczące tego, co inicjuje, napędza i moduluje indukcję adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia ona szybkie i skuteczne wzbogacenie jednostki bliznowatej przy jednoczesnym zachowaniu funkcjonalności, żywotności i sterylności komórek.

Aby wyizolować PBMC, zacznij od rozcieńczenia od 50 do 100 mililitrów świeżo uzyskanej próbki krwi ludzkiej w stosunku jeden do dwóch za pomocą PBS. Następnie ostrożnie nałóż 35 mililitrów rozcieńczonej krwi na 15 mililitrów gradientu separacji komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i oddziel komórki przez odwirowanie. Po zebraniu warstwy limfocytów umyj komórki w PBS i ponownie zawieś osad limfocytarny w jednym do pięciu mililitrów hipotonicznego roztworu buforowego w celu lizy pozostałych erytrocytów.

Przerwij lizę po dwóch do czterech minutach: dodając 10-krotność objętości PBS, a następnie osadzaj komórki i myj je w 10 mililitrach świeżego PBS przed rozpoczęciem izolacji limfocytów T V delta one. Użyj jeden razy 10 do szóstej podwielokrotności PBMC, aby ocenić częstość występowania limfocytów T V delta jeden, CD cztery dodatnie w próbce dawcy za pomocą cytometrii przepływowej. Następnie odwiruj resztę limfocytów i ponownie zawieś osad w 60 mikrolitrach maksymalnego buforu na jeden razy 10 do siódmej komórki.

Następnie zablokuj komórki w 20 mikrolitrach odczynnika blokującego FC na jeden razy 10 do siódmych komórek, a następnie dodaj 10 mikrolitrów sprzężonego ZI anty-ludzkiego V delta, jedno przeciwciało na jeden razy 10 siódmych komórek na 12 minut w czterech stopniach Celsjusza w ciemności. Pod koniec inkubacji przemyć komórki w 14 mililitrach maksymalnego buforu. Ponownie zawiesić osad w 80 mikrolitrach maksymalnego buforu na jeden razy 10 do siedmiu komórek i dodać 20 mikrolitrów mikrogranulek anty FTSE na jeden razy 10 siódmych komórek z mieszaniem po 15 minutach w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Umyj komórki w 10 mililitrach świeżego maksymalnego buforu podczas wirowania. Zrównoważyć wstępnie schłodzoną kolumnę magnetyczną z 500 mikrolitrami maksymalnego buforu. Następnie ponownie zawieś komórki w 500 mikrolitrach maksymalnego buforu i ostrożnie dodaj je do górnej części kolumny.

Przepłukać kolumnę trzema płukaniami buforu o maksymalnej pojemności 500 mikrolitrów. Następnie wyjmij kolumnę z magnesu i za pomocą tłoka szybko przepłucz dodatnie ogniwa V delta one z jednym mililitrem maksymalnego buforu do 15-mililitrowego stożkowego. Dwa. Po przepuszczeniu komórek przez drugą kolumnę, wiruj 25 mikrolitrów czterech kulek CD przez 30 sekund.

Następnie przenieś kulki do 1,5 mililitrowej probówki reakcyjnej zawierającej jeden mililitr maksymalnego buforu i umieść probówkę na magnesie. Po jednej minucie za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów ostrożnie zassać supernatant i ponownie zawiesić kulki w 25 mikrolitrach maksymalnego buforu. Następnie odwiruj izolowane dodatnie komórki v delta one i ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach maksymalnego buforu.

Energicznie wymieszaj komórki z koralikami. Następnie po 20 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy ciągłym przechylaniu umieść rurkę z powrotem na magnesie. Aby uniknąć utraty objętości próbki i zminimalizować obecność zanieczyszczających komórek ujemnych CD czterech, konieczne jest przepompowanie pozostałego buforu z wnętrza wieczka z powrotem do fiolki.

Po dwóch minutach za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów przenieść płytę CD z czterema ujemnymi V delta, jedną dodatnią komórką zawierającą supernatant do świeżej probówki. Następnie wyjmij CD cztery dodatnie komórki z magnesu i ponownie zawiesić je w 500 mikrolitrach maksymalnego buforu, po usunięciu CD czterech ujemnych komórek jeszcze dwa razy, jak właśnie pokazano, inkubuj CD cztery dodatnie komórki w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej i 10 mikrolitrach roztworu odłączającego kulki w temperaturze pokojowej przez 45 minut ze stałym przechylaniem. Pod koniec inkubacji umieść komórki z powrotem w magnesie na jedną minutę i użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby przenieść kulkę bez kulek.

V delta, jedna dodatnia komórka CD cztery dodatnie zawierają supernatant do nowej probówki po usunięciu wszelkich pozostałych kulek. Jeszcze dwa razy, jak właśnie pokazano, odwiruj komórki, a następnie ponownie zawieś V delta jedną dodatnią CD cztery dodatnie komórki w świeżym, wstępnie podgrzanym podłożu w celu zliczenia do pojedynczej komórki. Sklonuj komórki przez ograniczone rozcieńczenie, wyizoluj PBMC od innego dawcy, jak właśnie pokazano.

Następnie napromieniować gamma 2,5 razy 10 siódmego z tych allogenicznych PBMC 80 grayami w 25 mililitrach pożywki hodowlanej. Następnie dodaj IL dwa IL siedem i PHA do napromieniowanych komórek zasilających i wysiewaj pięć razy 10 do czwartych komórek na 50 mikrolitrów pożywki na studzienkę do 96. Płytki z grupy Well U rozcieńczyć wyizolowaną V delta, jedną dodatnią CD, cztery dodatnie komórki do stężenia 0,3 komórki na 50 mikrolitrów i dozować 50 mikrolitrów komórek do każdej studzienki komórek zasilających i cytokin.

Następnie umieść płytki w atmosferze nawilżonej CO2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%, wymieniając połowę pożywki w każdym dołku kultur współczynników na 50 mikrolitrów świeżych cytokin i pożywki co trzy do czterech dni. Pierwsze klony staną się widoczne w ciągu trzech do czterech tygodni, a kolor pożywki hodowlanej zmieni się, gdy komórki metabolizują i tworzą kolonie, tutaj typowy rozkład komórek dodatnich v delta one w CD trzy dodatnie próbki limfocytów krwi obwodowej jest pokazany u tego dawcy. Częstość występowania komórek v delta one dodatnich wynosi 2,3% całkowitej liczby limfocytów, z których 2,6% jest dodatnich w postaci CD 4, a populacja docelowa do izolacji stanowi 0,06% wszystkich limfocytów.

Ważne jest, aby zauważyć, jak można zaobserwować na tym wykresie kropkowym z typowego eksperymentu izolacji, że żadne limfocyty T alfa beta nie pozostają w wzbogaconej puli limfocytów T po pierwszym dodatnim etapie izolacji w celu wzbogacenia komórek dodatnich V delta one. W tym przypadku typowy fenotyp wyłaniającego się CD trzy dodatniego CD czwartego dodatniego klonu wyrażającego receptor limfocytów T złożony z łańcucha V delta jeden i V gamma nine jest przedstawiony na tych wykresach gęstości pojedynczego klonu wyizolowanego tą techniką. Proces różnicowania trans, podczas którego łańcuch One V delta jest regulowany w dół, a receptor komórek T alfa beta jest regulowany w górę, jest pokazany proces, który skutkuje przejściowym fenotypem podwójnie dodatniego receptora komórek T dla klonu.

Fenotyp podwójnie dodatni CD czterech, podwójnie dodatni CD 8 może być również wykazywany przez niektóre klony. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkiej pracy bez zatrzymywania się i używaniu sterylnych odczynników, zimnych i zestawów izolacyjnych, które nie mogą przekroczyć daty ważności zgodnie z tą procedurą.

Innym rzadkim typom komórek można celować, takim jak komórki macierzyste lub podtypy przedziałów komórek T NK lub INCT. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do zbadania molekularnych wyzwalaczy i czynników napędzających dodatkowy szlak rozwojowy grasicy tego nowo zidentyfikowanego przodka limfocytów T alfabetu ludzkiego. W systemach modelowych in vitro powinieneś teraz dobrze zrozumieć, jak szybko i ilościowo izolować jednostki bliznowate ze źródeł komórek ludzkich, takich jak szpik kostny, rdzeń i krew obwodowa jako situ lub płyn maziowy, zachowując jednocześnie funkcjonalność i sterylność komórek.