Name: Izolacja egzosomów z osocza osób zakażonych wirusem HIV-1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T15:00:01.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Poznaj metodę izolacji egzosomów z osocza pacjentów zakażonych HIV-1 przy użyciu gradientu iodaksanolu. Technika ta umożliwia analizę cytokin i chemokin w egzosomach, dostarczając cennych informacji o patogenezie zakażenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy następującym osobom: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers i Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu była wspierana przez UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10 oraz NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. Praca ta była wspierana przez granty NIMHD 8G12MD007602 i 8U54MD007588, grant NIAID 1R21AI095150-01A1, grant Georgia Research Alliance GRA. ODKURZACZ08. W, a Emory CFAR przyznają P30 A1050409.

Ogólny schemat procedury izolacji i oczyszczania egzosomów znajduje się na rysunku 1. Krew pełną pobrano od zdrowych dawców-ochotników oraz od osób zakażonych wirusem HIV, które nie otrzymywały terapii antyretrowirusowej, uczęszczających do Hope Clinic of Emory University i Infectious Disease Program of Grady Health System w Atlancie w stanie Georgia. Badanie to zostało zatwierdzone przez instytucjonalne komisje rewizyjne Uniwersytetu Emory i Morehouse School of Medicine. Wszystkie osoby biorące udział w badaniu wyraziły pisemną i świadomą zgodę.
1. Przygotowanie egzosomów z osocza krwi
<ol>
	<li>Pobieranie i przetwarzanie krwi ludzkiej
	<ol>
		<li>Zebrać 10 ml krwi obwodowej przez nakłucie żyły do probówek do pobierania krwi EDTA (zawierających 18 mg EDTA potasu) i delikatnie odwrócić pięć razy, aby wymieszać.</li>
		<li>Odwirować probówki do pobierania krwi o stężeniu 1 000 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia krwinek. Za pomocą sterylnej pipety przenieść frakcję osocza (4-5 ml) do stożkowej probówki o pojemności 25 ml. Rozcieńczyć osocze 10 ml 1 X PBS. Wyrzuć krwinki (czerwone krwinki i białe krwinki, znane również jako PBMC) do odpowiednio oznakowanego pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. 
		UWAGA: W przypadku niezakażonych próbek krwi dawcy, PBMC może być zarezerwowany do dalszego wykorzystania (patrz procedura IV.2 poniżej).</li>
		<li>Próbki osocza należy przechowywać w temperaturze 4 oC przez krótki okres (2-3 dni) lub w temperaturze -80 oC w przypadku dłuższego przechowywania. 
		UWAGA: Przed dalszym przetwarzaniem doprowadzić zamrożone próbki osocza do temperatury 4 oC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie frakcji egzosomu z osocza
	<ol>
		<li>Odwirować osocze o sile 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórkowych. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przenieść oczyszczony supernatant osocza do czystej probówki ultrawirówkowej o pojemności 25 ml. Wyrzuć granulki do pojemnika na zagrożenie biologiczne.</li>
		<li>Odwirować oczyszczone osocze o sile 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C w celu usunięcia dużych pęcherzyków. Ostrożnie usunąć 100 000 x g supernatantu za pomocą pipetowania i wyrzucić do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne. Zawiesić 100 000 x g granulki w 1 ml 1X PBS w czystej probówce i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie mieszając, aby usunąć i oddzielić cząstki.</li>
		<li>Przemyć zawieszone 100 000 x g osadu egzosomu/wirusa, dodając 25 ml PBS. Delikatnie odwrócić probówkę pięć razy, aby wymieszać, a następnie ponownie odwirować przy 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Wylać roztwór płuczący PBS do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne.</li>
		<li>Zawiesić 100 000 x g osadu w 1 ml 1 X PBS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie wirując, aby usunąć i rozpuścić osad. 
		UWAGA: Jeśli nie jest możliwe bezpośrednie przejście do etapu gradientu jodiksanolu, należy przechowywać osad zawierający egzosomy i cząstki wirusa w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni do etapu gradientu jodiksanolu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oczyszczanie egzosomów
<ol>
	<li>Generuj gradienty prędkości jodiksanolu o 6%-18% za pomocą dwukomorowego aparatu do formowania gradientu.
	<ol>
		<li>Przygotować 6% i 18% roztwory odczynnika jodiksanolu, dostarczanego w postaci 60% roztworu w wodzie, przez rozcieńczenie w PBS. Odmierzyć pipetą 5,5 ml 18% roztworu do komory mieszania, a następnie odpipetować 5,5 ml 6% roztworu do komory zbiornika. Włącz mieszadło, otwórz kran i pozwól, aby każdy gradient spłynął do probówki ultrawirówkowej o pojemności 14 ml. 
		UWAGA: Zużyć natychmiast lub przechowywać przygotowane gradienty O/N w temperaturze 4 °C przed użyciem.</li>
		<li>Ostrożnie nałożyć 1 ml roztworu egzosomu/wirusa na wierzch każdego 11 ml gradientu. Wirowanie nachylenia przy 250 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, przy użyciu wahliwego wirnika kubełkowego SW40Ti.</li>
		<li>Oznaczyć dwanaście (12) probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Usuń 1,0 ml z górnej części gradientu i przenieś do probówki #1. Przenieś pozostałe 1 ml frakcje do probówek 2-12 w kolejności sekwencyjnej. 
		UWAGA: Najwyższy ułamek będzie zatem #1, a dolny ułamek #12. Frakcje gradientu przechowywać w temperaturze 4 °C. Oczyszczone egzosomy, które powinny znajdować się we frakcjach 1-3 na szczycie gradientu, są stabilne przez 3-4 tygodnie, gdy są przechowywane w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka egzosomu
<ol>
	<li>Test aktywności acetylocholinoesterazy (AChE)
	<ol>
		<li>Przygotować 100 mM substratu, mieszając jodek acetylotiocholiny 28,9 mg w 1 ml 1X PBS. Zapas substratu należy przechowywać w temperaturze -20 °C do 1 miesiąca.</li>
		<li>Przygotować 10 mM kolorowego wskaźnika, mieszając kwas benzoesowy 39,6 mg i wodorowęglan sodu 15 mg w 10 ml 1X PBS. Zapas kolorowego wskaźnika należy przechowywać w temperaturze 4 °C do dwóch tygodni.</li>
		<li>Przygotować odczynnik do oznaczania, mieszając 1X PBS, substrat i wskaźnik koloru w stosunku 100:2:5 (na przykład 10 ml 1X PBS + 200 μl substratu + 500 μl wskaźnika koloru).</li>
		<li>Przenieść 50 μl z każdej probówki z frakcją gradientową o pojemności 1,5 ml (oznaczonej 1-12 z procedury III.3) do dołków 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Przygotuj zduplikowane studzienki dla każdej próbki gradientu.</li>
		<li>Przygotuj zestaw wzorców, wykonując najpierw zapas 2000 μU/ml AChE w PBS. Wykonać jedenaście (11) 2-krotnych seryjnych rozcieńczeń tego wywaru i dodać 50 μl każdego rozcieńczenia do pojedynczego dołka płytki do mikromiareczkowania, tak aby wzorzec #1 = 2,000 μU/ml, #2 = 1,000 μU/ml, #3 = 500 μU/ml, itd., aż #12 = 0,98 μU/ml. Dwanaście wzorców AchE zajmie zatem pojedynczy rząd 96-dołkowej płytki testowej.</li>
		<li>Dodać 200 μl mieszaniny odczynników do oznaczania do każdego dołka i inkubować przez 20 minut (w ciemności) w temperaturze pokojowej, aby umożliwić rozwój zabarwionego produktu reakcji. Zmierz aktywność AChE przy długości fali 450 nm za pomocą fluorescencyjnego czytnika mikropłytek. 
		UWAGA: Procent materiału wyjściowego pozostałego po oczyszczeniu egzosomu ocenia się za pomocą testu AchE niefrakcjonowanego osocza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza immunoblot
	<ol>
		<li>Oddzielić białka we frakcjach gradientowych 1-12 (z procedury 2.1.3) za pomocą SDS-PAGE na 4-20% prefabrykowanych żelach Tris-HCl przy 100 V x 1 godz. Przenieść białka w żelu do membrany nitrocelulozowej za pomocą elektrobibuły transferowej zgodnie z instrukcjami producenta. Pozwól transferom zatkać się przez 12-16 godzin (O/N) przy 350 V.</li>
		<li>Zdjąć membranę z urządzenia do bibułowania i myć w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) przez 5 minut. Blok z 5% mlekiem beztłuszczowym w TTBS (TBS z 0,1% Tween 20) przez 1 godzinę, wstrząsając w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować błonę z pierwszorzędowymi przeciwciałami specyficznymi dla egzosomów (CD9, CD45, CD63) lub białka kapsydu HIV-1 (p24) w 5% mleku beztłuszczowym, wstrząsając w temperaturze 4 °C przez 12-16 godzin (O/N). Rozcieńczenia pierwszorzędowych przeciwciał dla immunoblotów wahają się od 1:2 000 -1:5 000.</li>
		<li>Myć blot w TTBS przez 20 minut, a następnie inkubować z rozcieńczeniem 1: 2,000 peroksydazy chrzanowej (HRP) sprzężonej z anty-IgG (przeciwciałem drugorzędowym), w 5% beztłuszczowym mleku przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj blot 3 razy za pomocą TTBS, 10 minut na pranie.</li>
		<li>Inkubować blot z odczynnikiem substratowym luminolu zgodnie ze wskazówkami producenta, aby wygenerować sygnał chemiluminescencyjny z białek znakowanych HRP Wykryj sygnał chemiluminescencyjny za pomocą elektronicznego systemu obrazowania z kamerą CCD.</li>
		<li>Zapisz obrazy jako pliki TIFF, które można wyświetlić w programie Adobe Photoshop. Wykonaj analizę densytometryczną pasm za pomocą oprogramowania ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test cytokin
	<ol>
		<li>Przed testem cytokin należy rozbić kompleksy immunologiczne, które są zwykle obecne w ludzkim osoczu, poprzez dysocjację kwasu i zlizować egzosomy za pomocą detergentu. Oznacz zarówno początkowe próbki osocza, jak i oczyszczone preparaty egzosomów.
		<ol>
			<li>Do 100 μl osocza ludzkiego dodać 100 μl 0,33 N HCL i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Dodać 100 μl 0,33 N NaOH w celu zneutralizowania osocza poddanego działaniu kwasu. Dodaj Triton X-100 zarówno do zneutralizowanego osocza, jak i oczyszczonych próbek egzosomów, do końcowego stężenia 1%, aby spowodować lizę egzosomów.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Do tego testu (procedura oparta na kulkach fluorescencyjnych) należy użyć kulek magnetycznych wstępnie pokrytych przeciwciałami przez producenta. Użyj specjalnie zaprojektowanego panelu kulek pokrytych przeciwciałami anty-ludzkimi cytokinami; wymienionych w tabeli 1. Wirować kulki magnetyczne pokryte przeciwciałem z zestawu do oznaczania cytokin przez 30 sekund i dodać 50 μl kulek do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, która ma być użyta w teście.</li>
		<li>Przygotować serię roztworów wzorcowych w buforze wzorcowym osocza (oba zawarte w zestawie do oznaczania cytokin) zgodnie z opisem w instrukcji obsługi zestawu do oznaczania cytokin, aby wygenerować 8-punktową krzywą wzorcową.</li>
		<li>Dodaj 150 μl buforu do płukania 1X (z zestawu) do każdej studzienki i umyj kulki za pomocą magnetycznej podkładki do perełek, zgodnie z opisem w instrukcji. Dodaj 25 μl buforu do oznaczania osocza (z zestawu) do każdej studzienki. Dodać 25 μl wzorców i próbek do wszystkich studzienek użytych w teście. Dodać 25 μl buforu do próbki osocza do studzienek kontroli ujemnej. Uszczelnić i wstrząsnąć płytką przy 700 obr./min przez 60 min w temperaturze pokojowej i inkubować O/N w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać 150 μl buforu do płukania 1X do każdej studzienki i umyć płytkę (jak w kroku 3.3.4 powyżej). Dodać 25 μl przeciwciał detekcyjnych do każdej studzienki, uszczelnić i wstrząsnąć płytką z prędkością 700 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć etap mycia.</li>
		<li>Dodać 50 μl roztworu streptawidyny (SAPE, z zestawu) do każdej studzienki, uszczelnić i wstrząsnąć płytką z prędkością 700 obr./min przez 30 min w suchej smożniku. Powtórzyć płukanie płytki jak w ppkt 3.3.4.</li>
		<li>Dodać 120 μl bufora odczytowego (z zestawu) do każdej studzienki i wstrząsać laboratoryjnym wytrząsaczem stołowym z prędkością 700 obr./min przez 5 minut w temperaturze suchej, aby umożliwić rozwinięcie się sygnału fluorescencyjnego. Odczytaj tabliczkę na czytniku płytek zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Aby uwzględnić ilość egzosomów utraconych podczas procedury izolacji, użyj następującego równania: [(oryginalny odczyt / objętość osocza) x 66,6 = skorygowany odczyt cytokin].</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test potencjału immunomodulacyjnego
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywki hodowlanej z pozbawioną egzosomów płodową surowicą bydlęcą
	<ol>
		<li>Odwirować 500 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w stężeniu 100 000 x g przez 20 godzin w temperaturze 4 °C w celu osadzenia zanieczyszczających egzosomów i mikropęcherzyków. Ostrożnie usuń i zachowaj zubożony w egzosomy supernatant FBS. Wyrzuć granulki wraz z odpadami stanowiącymi zagrożenie biologiczne.</li>
		<li>Połącz 20% zubożonego w egzosomy supernatantu FBS z 500 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640). Przefiltrować medium przez filtr membranowy 0,45 μm.</li>
		<li>Do przefiltrowanego podłoża dodać streptomycynę (100 j./ml), penicylinę (100 j./ml), L-glutaminę (2 mM), buforowany przez HEPES roztwór soli fizjologicznej (10 μM) i IL-2 (20 j./ml).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla komórkowa i ekspozycja na egzosomy
	<ol>
		<li>Wystaw egzosomy na działanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej dawcy (PBMC) uzyskanych od zdrowych ochotników klinicznych. Zawiesić PBMC w przygotowanej pożywce hodowlanej i policzyć komórki za pomocą licznika komórek/cząstek (zgodnie ze standardową metodą producenta). 
		UWAGA: PBMC uzyskuje się podczas przygotowania osocza opisanego powyżej (krok 1.2).</li>
		<li>Używając przygotowanej pożywki z procedury 4.1.3, należy przeprowadzić kohodowlę 3,0 x 106 (PBMC) z 1 μg/ml połączonych egzosomów od trzech (3) seropozytywnych osób HIV-1 lub od trzech (3) osób seronegatywnych HIV-1 w całkowitej objętości 1 ml w studzienkach 12-dołkowej płytki hodowlanej (z pokrywką). Inkubować kultury przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przygotować niepoddane działaniu PBMC kultury i kultury poddane działaniu konkanawaliny A (Con A; 5 μg/ml), aby służyły jako odpowiednio kontrole negatywne i pozytywne, jak opisano powyżej (4.2.2). Inkubować wszystkie kultury PBMC przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Bezpośrednio przed pobraniem komórek należy przygotować rozcieńczenia następujących przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z fluorochromem: anty-CD3 znakowane Alexa Fluor 700 (rozcieńczenie 1:400), anty-CD4 znakowane allofikocyjaniną (APC)/cyjaniną 7 (Cy7) (1:400), anty-CD4 znakowane białkiem chlorofilu perydyniny (1:400), anty-CD8 znakowane V450 (1:400), anty-CD45RA znakowane biotyną (1:1000), anty-CD62L znakowane fikoerytryną (PE)/Cy7 (1:1000), anty-CD38 znakowane PE/cyjaniną 5 (Cy5) (1:200), PE-Texas znakowane na czerwono antystreptawidyna (1:2,000) i kontrola izotypu IgG1K myszy znakowana PE / Cy5 (1:200).</li>
		<li>Po 48-godzinnym okresie inkubacji należy zebrać PBMC. Przemyć PBMC w PBS w celu usunięcia egzosomów i wybarwienia komórek przez inkubację przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z pojedynczymi przeciwciałami znakowanymi fluorochromem. Przeanalizować wybarwiony PBMC za pomocą cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia ekspresji chemokin (jak opisano 21).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , Geneva Switzerland. (2013).</li>
<li>Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+activation+markers+on+CD8+lymphocytes+in+human+immunodeficiency+syndrome%3A+staging+and+prognostic+value%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immun%22%5BJournal%5D)">The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value.</a> Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).</li>
<li>Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+CD38%2B+CD8%2B+T+cells+in+HIV+infection+add+to+the+prognostic+value+of+low+CD4%2B+T+cell+levels%3A+results+of+6+years+of+follow-up.+The+Los+Angeles+Center%2C+Multicenter+AIDS+Cohort+Study%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Acq+Immun+Def+Synd%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study.</a> J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).</li>
<li>Bofill, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+numbers+of+primed+activated+CD8%2BCD38%2BCD45RO%2B+T+cells+predict+the+decline+of+CD4%2B+T+cells+in+HIV-1-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients.</a> AIDS. 10, 827-834 (1996).</li>
<li>Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+CD38+antigen+expression+on+CD8%2B+T+cells+is+a+stronger+marker+for+the+risk+of+chronic+HIV+disease+progression+to+AIDS+and+death+in+the+Multicenter+AIDS+Cohort+Study+than+CD4%2B+cell+count%2C+soluble+immune+activation+markers%2C+or+combinations+of+HLA-DR+and+CD38+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acq+Immun+Def+Synd%22%5BJournal%5D)">Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression.</a> J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).</li>
<li>Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS.</a> Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).</li>
<li>Roberts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cytokine+levels+during+acute+HIV-1+infection+predict+HIV+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression.</a> AIDS. 24, 819-831 (2010).</li>
<li>Mueller, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-15+increases+effector+memory+CD8%2B+T+cells+and+NK+Cells+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> J Virol. 79, 4877-4885 (2005).</li>
<li>Picker, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).</li>
<li>Mueller, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+treatment+during+acute+simian+immunodeficiency+virus+%28SIV%29+infection+increases+viral+set+point+and+accelerates+disease+progression+despite+the+induction+of+stronger+SIV-specific+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses.</a> J Immunol. 180, 350-360 (2008).</li>
<li>O'Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+in+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection.</a> Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).</li>
<li>Chihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+preferentially+activate+anti-inflammatory+M2-type+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages.</a> J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).</li>
<li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Vesicle formation during reticulocyte maturation.</a> J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).</li>
<li>Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+and+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Microvesicles and viral infection.</a> J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).</li>
<li>Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Nef+protein+is+secreted+into+vesicles+that+can+fuse+with+target+cells+and+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Ethn.+Dis%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions.</a> Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).</li>
<li>Muratori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+Secretion+by+T+Cells+Is+Caused+by+HIV+Nef+in+Infected+Cells+and+by+Nef+Transfer+to+Bystander+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host.+Microbe%22%5BJournal%5D)">Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells.</a> Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).</li>
<li>Lenassi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Nef+is+Secreted+in+Exosomes+and+Triggers+Apoptosis+in+Bystander+CD4+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells.</a> Traffic. 11, 110-122 (2009).</li>
<li>Raymond, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Type+1+Nef+Is+Released+from+Infected+Cells+in+CD45%2B+Microvesicles+and+Is+Present+in+the+Plasma+of+HIV-Infected+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retrovir%22%5BJournal%5D)">HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals.</a> AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).</li>
<li>James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Nef+Protein+Targets+CD4%2B+T+Cells+for+Apoptosis+by+Interacting+with+CXCR4+Surface+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors.</a> Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).</li>
<li>Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Nef-CXCR4+Interactions+Important+for+Apoptosis+Induction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction.</a> Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).</li>
<li>Konadu, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+cytokines+with+exosomes+in+the+plasma+of+HIV-1-seropositive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals.</a> Journal of Infectious Diseases. , (2014).</li>
<li>Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+between+exosomes+and+HIV-1%3A+purification+of+both+vesicles+from+cell-free+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants.</a> J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracellular Vesicles. 2, 20360(2013).</li>
<li>Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+RNA-Containing+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes.</a> J. Vis. Exp. (59), e3037(2012).</li>
<li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+microRNA+Profiling+of+Exosomes+Derived+from+Blood+and+Culture+Media%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media.</a> J. Vis. Exp. (76), e50294(2013).</li>
<li>Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modified+Precipitation+Method+to+Isolate+Urinary+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes.</a> J. Vis. Exp. (95), e51158(2015).</li>
<li>Lötvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przewlekła aktywacja immunologiczna (CIA) i wyczerpanie limfocytów T CD4+ to dwie ważne cechy charakterystyczne zakażenia HIV-1. Zostały one uznane za predyktory patogenezy, przy czym CIA jest najlepszym predyktorem. Jednak mechanizmy leżące u podstaw przewlekłej ogólnoustrojowej aktywacji immunologicznej i spadku limfocytów T CD4 + nadal nie zostały w pełni wyjaśnione. Wraz z innymi laboratoriami opracowaliśmy mocne dowody na to, że egzosomy wydzielane z komórek zakażonych wirusem HIV-1 odgrywają rolę w obu cechach char...

Epidemia HIV-1 nadal wywiera znaczący wpływ na cały świat. W 2013r. około 35 milionów ludzi na całym świecie żyło z wirusem HIV, a 2,1 miliona z nich to osoby nowo zakażone1. Strategie zapobiegawcze i zwiększony dostęp do terapii antyretrowirusowej okazały się pomocne w ograniczeniu ogólnego zakażenia wirusem HIV. Jednak w poszczególnych populacjach nadal obserwuje się wzrost liczby zakażeń wirusem HIV1. W związku z tym konieczne są dalsze wysiłki na rzecz przeciwdziałania tej epidemii.
Jednym z najsilniejszych predyktorów postępu choroby HIV jest przewlekła aktywacja immunologiczna (CIA)2-10. Zdefiniowana przez utrzymujące się wysokie poziomy wykrywalnych cytokin i podwyższone markery ekspresji na powierzchni limfocytów T, CIA przypisuje się: i) ciągłej produkcji komórek dendrytycznych IFN11 typu I; (ii) bezpośrednia aktywacja immunologiczna napędzana przez białka HIV Tat, Nef i gp12012; (iii) translokacja białek bakteryjnych w komórkach odpornościowych związanych z jelitami6. Jednak dokładny mechanizm (mechanizmy) leżący u podstaw przewlekłej, ogólnoustrojowej aktywacji immunologicznej w zakażeniu wirusem HIV nie został jeszcze w pełni wyjaśniony.
Nasza grupa badawcza i inni wykazali rolę egzosomów w patogenezie HIV15-18. Nasza grupa ustaliła, że białko Nef jest wydalane z zakażonych komórek w egzosomach15, a egzosomalne Nef (exNef) jest obecne w osoczu osób zakażonych wirusem HIV na poziomienanogramów 18. Wykazaliśmy, że limfocyty T CD4 + osoby postronne wystawione na działanie exNef powodowały śmierć komórek wywołaną aktywacją, zależną od szlaku CXCR419, 20. Alternatywnie, monocyty/makrofagi były oporne na apoptozę wywołaną przez exNef, ale wykazywały zmienione funkcje komórkowe i ekspresję cytokin. Ostatnio nasza grupa wykazała, że egzosomy wyizolowane z osocza osób zakażonych wirusem HIV zawierają różne cytokiny prozapalne. Co więcej, naiwne komórki jednojądrzaste krwi obwodowej wystawione na egzosomy pochodzące z osocza od pacjentów zakażonych wirusem HIV indukowały ekspresję CD38 na naiwnych i centralnych limfocytach T CD4 + i CD8 + pamięci. Prawdopodobnie przyczynia się to do ogólnoustrojowego stanu zapalnego i rozprzestrzeniania się wirusa poprzez aktywację komórek osób postronnych21 i sugeruje, że egzosomy odgrywają znaczącą rolę w patogenezie HIV.
Podczas badania roli egzosomów w patogenezie HIV, jednym z wyzwań jest opracowanie technik skutecznego oddzielania egzosomów od cząsteczek HIV przy jednoczesnym zachowaniu zawartości egzosomalnej oraz ich funkcjonalnej zdolności modulacji immunologicznej. Opisano kilka metod izolowania egzosomów z hodowli komórkowych i płynów biologicznych22,23. Ze względu na ich mały rozmiar i niską gęstość (egzosomy unoszą się w gęstości 1,15 - 1,19 g/ml), ultrawirowanie różnicowe i/lub ultrafiltracja są najczęściej stosowanymi technikami izolacji egzosomów23. Jednak supernatanty z hodowli komórkowych zakażonych wirusem HIV i osocze pacjentów zawierają zarówno egzosomy, jak i cząsteczki wirusa HIV-1. Egzosomy i cząsteczki HIV-1 są bardzo podobne zarówno pod względem wielkości, jak i gęstości. Alternatywnie, wykorzystując ekspresję unikalnych markerów egzosomalnych, takich jak CD63, CD45 i CD81, egzosomy wyizolowano przy użyciu metod wychwytywania powinowactwa immunologicznego23. Ta procedura może oddzielić wirusa od egzosomów. Jednak wadą tej techniki jest ścisłe przywiązanie przeciwciał do oczyszczonych egzosomów, co może zakłócać ocenę potencjału immunomodulacyjnego egzosomów w hodowli.
Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy procedurę oczyszczania egzosomów z cząsteczek HIV w ludzkim osoczu zmodyfikowanym z Cantin i współpracowników22 przy użyciu gradientów prędkości jodixanol. Stwierdzono, że egzosomy segregują się w gradientach jodiodksanolu o niskiej gęstości / górnych, podczas gdy cząsteczki wirusa segregują się w frakcjach o wysokiej gęstości / dolnych. Cząsteczki wirusa zidentyfikowano za pomocą testu ELISA p24, a egzosomy zidentyfikowano za pomocą markerów egzosomów AChE, CD9, CD63 i CD45. Pobrane górne frakcje o niskiej gęstości zawierały egzosomy, które były ujemne pod kątem zanieczyszczenia HIV-1 p24. Skuteczne oczyszczanie i separacja egzosomów od cząsteczek wirusa HIV w osoczu człowieka pozwala na dokładne zbadanie zawartości egzosomów pochodzących z osocza ludzkiego, a także zbadanie ich potencjału immunomodulacyjnego oraz wartości diagnostycznej i prognostycznej egzosomów w patogenezie HIV-1.

<table><tbody><tr><td>Probówki BD Vacutainer EDTA (10ml)&nbsp;</td><td>Różowe górne probówki</td> <td>Becton Dickinson</td><td>368589</td></tr><tr><td>Odczynnik Lymphoprep Ficoll</td><td>Cosmo Bio</td><td>AXS-1114545</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik jodiksanol Optiprep</td><td>Probówki ultrawirówkowe Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Ultraprzezroczyste</td><td>probówki</td><td>Beckman Coulter</td><td>344060</td></tr><tr><td>Gradient Former Model 485</td><td>BIO-RAD</td><td>165-4120</td><td></td></tr><tr><td>Jodek acetylotiocholiny</td><td>Sigma</td><td>1480</td><td></td></tr><tr><td>Kwas benzoesowy</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Acetylocholinesteraza</td><td>Sigma</td><td>C3389</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa przezroczysta płytka do mikromiareczkowania</td><td>Partnerzy w zakresie zaopatrzenia medycznego</td><td>TR5003</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek SpectraMax 190</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>190</td><td>Czytnik płytek fluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Criterion Żelowa komórka elektroforetyczna</td><td>BIO-RAD</td><td>165-6001</td><td></td></tr><tr><td>Transblot Gel&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-3910</td><td></td></tr><tr><td>Komórka</td><td></td><td></td><td></td>transferowa</tr><tr><td>Tris-HCl Kryterium żele prefabrykowane</td><td>BIO-RAD</td><td>567-1093</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD45&nbsp;</td><td>Biblioteka&nbsp;</td><td>Ab10558</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD63 (H-193)</td> <td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-15363</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD9 (H-110)</td> <td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-9148</td><td></td></tr><tr><td>PAb królika p24 HIV-1&nbsp;</td><td>ImmunoDX, LLC</td><td>1303</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>G1472430</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buforowana sól fizjologiczna</td><td>BIO-RAD</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe IgG (H+L) sprzężone z HRP</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td>Kozio-Anty-Królik</td></tr><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe IgG (H+L) sprzężone z HRP</td><td>Thermo Scientific</td><td>31430</td><td>Odczynnik</td></tr> do Western <tr><td>Blotting Luminol</td> Koziołkowy <td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-2048</td><td></td></tr><tr><td>GE LAS-4010 Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>LAS-4010</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania cytokin ludzkich Procarta</td><td>Affymetrix&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td>Niestandardowy panel testów immunologicznych</td></tr><tr><td>Bio-Plex 200 Czytnik immunobeadów</td><td>BIO-RAD</td><td>171-000201</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Z2 Licznik cząstek</td><td>Beckman Coulter</td><td>383552</td><td>Licznik komórek</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 znakowany anty-CD3</td><td>BD Bioscience (UCHT1)</td><td>300424</td><td></td></tr><tr>Anty-CD4 <td>Biolegend (OKT4)</td> <td>znakowany APC/Cy7</td> <td>317418</td><td></td></tr><tr><td>Znakowany PerCP anty-CD4</td><td>BD Bioscience (RPA-T8)</td><td>550631</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD8</td><td>BD Bioscience (RPA-T8) znakowany anty-CD8 BD Bioscience (RPA-T8)</td> <td>560347</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD45RA</td> znakowany <td>biotyną (HI100)</td><td>555487</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD62L</td><td>Biolegend (DREG-56)</td><td></td> znakowany PE/Cy7 304822 <td></td></tr><tr><td>anty-CD38</td><td>Biolegend (HIT2) znakowany</td> PE/Cy5 <td>303508</td><td></td></tr><tr><td>APC/ Biolegend znakowany anty-HLADR</td><td>(L243) znakowany</td> Cy7 <td>307618</td><td></td></tr><tr><td>Anty-streptawidyna znakowana czerwienią PE-Texas</td><td>BD Bioscience</td><td>551487</td><td></td></tr><tr><td>Mysia IgG1K</td><td>Biolegend (MOPC-21)</td><td>400116</td><td></td></tr><tr><td>Mysz znakowana APC/Cy7 IgG2aK</td><td>Biolegend (MOPC-173)</td><td>400229</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja egzosomów z osocza osób zakażonych wirusem hiv-1

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Egzosomy to małe pęcherzyki o rozmiarach od 30 nm do 100 nm, które są uwalniane zarówno konstytutywnie, jak i po stymulacji przez różne typy komórek. Znajdują się one w wielu płynach biologicznych i wiadomo, że przenoszą różne białka, lipidy i cząsteczki kwasów nukleinowych. Pierwotnie uważano, że są one czymś więcej niż rezerwuarem szczątków komórkowych, ale rola egzosomów regulujących procesy biologiczne i choroby jest coraz bardziej doceniana.
Opisano kilka metod izolowania egzosomów z pożywek komórkowych i płynów biologicznych. Ze względu na ich niewielkie rozmiary i niską gęstość, ultrawirowanie różnicowe i/lub ultrafiltracja są najczęściej stosowanymi technikami izolacji egzosomów. Jednak osocze osób zakażonych wirusem HIV-1 zawiera zarówno egzosomy, jak i cząsteczki wirusa HIV, które są podobne pod względem wielkości i gęstości. W związku z tym skuteczne oddzielenie egzosomów od cząstek wirusa HIV w ludzkim osoczu było wyzwaniem.
Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy zmodyfikowaną procedurę z Cantin et al., 2008 do oczyszczania egzosomów z cząsteczek HIV w ludzkim osoczu. Gradienty prędkości jodiksanolu wykorzystano do oddzielenia egzosomów od cząstek HIV-1 w osoczu osób zakażonych wirusem HIV-1. Cząsteczki wirusa zostały zidentyfikowane za pomocą testu p24 ELISA. Egzosomy zidentyfikowano na podstawie markerów egzosomów acetylocholinoesterazy (AChE) oraz antygenów CD9, CD63 i CD45. Nasza procedura gradientowa pozwoliła uzyskać preparaty egzosomów wolne od cząsteczek wirusa. Skuteczne oczyszczanie egzosomów z ludzkiego osocza umożliwiło nam zbadanie zawartości egzosomów pochodzących z osocza oraz zbadanie ich potencjału immunomodulacyjnego i innych funkcji biologicznych.

Egzosomy są wydajnie oczyszczane z ludzkiej plazmy dodatniej pod kątem HIV-1. Izolowane egzosomy, zidentyfikowane na podstawie aktywności acetylocholinoesterazy (AChE), wydzieliły się w frakcjach o niższej gęstości 1-3 w górnej części gradientów jodiksanolu, podczas gdy cząstki wirusa, zidentyfikowane za pomocą antygenu p24 HIV-1, wydzieliły się we frakcjach o wyższej gęstości (10-12, w pobliżu dna). Obecność egzosomów została dodatkowo potwierdzona poprzez identyfikację ...

Opisano techniki opisujące gradientową procedurę oddzielania egzosomów od cząsteczek ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Procedura ta została wykorzystana do wyizolowania egzosomów z dala od cząstek HIV w ludzkim osoczu od osób zakażonych wirusem HIV. Wyizolowane egzosomy analizowano pod kątem zawartości cytokin/chemokin.

Izolacja egzosomów z osocza osób zakażonych wirusem HIV-1

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Podczas infekcji HIV przez zakażone wirusem komórki produkowane są zarówno wirusy, jak i mikropęcherzyki zwane egzosomami. Ogólnym celem tej procedury jest oddzielenie egzosomów od cząsteczek wirusa w próbkach osocza pobranych od pacjentów zakażonych HIV. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad egzosomami, takie jak to, jakie białka lub inne cząsteczki występują w egzosomach produkowanych podczas infekcji HIV.Procedurę zaprezentuje dr Ming Bo Huang, instruktor w katedrze mikrobiologii, biochemii i immunologii oraz członek grupy HIV/AIDS w Moorehouse School of Medicine. Po pobraniu ludzkiej krwi i wyizolowaniu osocza zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać 10 milliliters 1X PBS do 10 milliliters osocza w probówce o pojemności 15 milliliters. Próbkę należy wirować przy 10 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 30 minut w celu usunięcia resztek komórkowych.Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przenieś oczyszczony naddatek osocza do czystej probówki do ultrawirówki o pojemności 25 mililitrów. Następnie wiruj oczyszczone osocze z prędkością 200,000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsius za dwie godziny, aby oddzielić duże pęcherzyki

isolation-of-exosomes-from-the-plasma-of-hiv-1-positive-individuals

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejsza praca przedstawia metody izolacji, oczyszczania i detekcji egzosomów, a także techniki analizy ich zawartości molekularnej. Metody te można dostosować do izolacji egzosomów zarówno z pożywek hodowli komórkowych, jak i z płynów biologicznych; poza analizą zawartości molekularnej mogą one być również przydatne w badaniach funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka egzosomów zawierających RNA

Egzosomy izolowane z plazmy mogą być używane jako nieinwazyjny i powtarzalny sposób wykrywania i śledzenia biomarkerów do wczesnego wykrywania i postępu choroby. Ten film opisuje protokół oddzielania egzosomów od próbek osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc, które można wykorzystać do ekstrakcji DNA i białek.

Izolacja egzosomów: technika oddzielania egzosomów od osocza pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc

Płyn żółciowy jest cennym źródłem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów, które zawierają potencjalnie ważne biomarkery. Protokół ten stanowi solidną metodę izolowania egzosomów z ludzkiej żółci w celu dalszych analiz, w tym profilowania miRNA.

Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci

MikroRNA odgrywają ważną rolę regulacyjną i stają się nowymi celami terapeutycznymi dla różnych chorób ludzkich. Wykazano, że miRNA są przenoszone w lipoproteinach o dużej gęstości. Opracowaliśmy uproszczoną metodę szybkiego izolowania oczyszczonego HDL nadającego się do analizy miRNA z ludzkiego osocza.

Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Ten protokół opisuje izolację i kwantyfikację małych RNA lipoprotein o dużej gęstości.

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

Tutaj opisujemy ilościową metodę proteomiki wykorzystującą technikę znakowania stabilnych izotopów przez aminokwasy w hodowli komórkowej (SILAC) do analizy wpływu zakażenia HIV-1 na egzosomalne proteomy gospodarza. Protokół ten można łatwo dostosować do komórek w różnych warunkach stresu lub infekcji.

Charakterystyka proteomiczna egzosomów z komórek zakażonych HIV-1 na podstawie SILAC

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania egzosomów zarówno z osocza, jak i surowicy z redukcją kooczyszczania nieegzosomalnych białek krwi. Zoptymalizowany protokół obejmuje ultrafiltrację, leczenie proteazą i chromatografię wykluczania wielkości. Ulepszone oczyszczanie egzosomów przynosi korzyści w dalszych analizach, w tym dokładniejszej kwantyfikacji pęcherzyków i charakterystyce proteomicznej.

Trawienie białek, ultrafiltracja i chromatografia wykluczania wielkości w celu optymalizacji izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy

Ten protokół izoluje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) od wirionów z wysoką wydajnością i wydajnością, włączając wytrącanie EV, ultrawirowanie w gradiencie gęstości i wychwytywanie cząstek, aby umożliwić usprawnienie przepływu pracy i zmniejszenie wymagań dotyczących objętości początkowej, co skutkuje powtarzalnymi przygotowaniami do użycia we wszystkich badaniach nad EV.

Oczyszczanie wysokowydajnych preparatów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wirusa

Ten artykuł opisuje metodologię izolacji, charakterystyki i kwantyfikacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkiego osocza (EV) i przedstawia przebieg pracy do bezznacznikowej analizy proteomu EV przy użyciu chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Izolacja, charakterystyka i analiza proteomiczna pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z osocza w celu odkrycia biomarkerów sercowo-naczyniowych

Opracowaliśmy wektor lentiwirusem, który oprócz LTR reagującego na Tat posiada element odpowiedzi Rev (RRE), umożliwiający regulację ekspresji genu reporterowego w sposób zależny od Tat i Rev HIV-1. Wektor ten pozwala na specyficzne wykrywanie replikującego się HIV w żywych komórkach poprzez ekspresję GFP.

Specyficzne znakowanie komórek zakażonych HIV-1 przy użyciu zależnego od Rev wektora lentiwirusego wykazującego ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego

Poznaj metodę izolacji egzosomów z osocza pacjentów zakażonych HIV-1 przy użyciu gradientu iodaksanolu. Technika ta umożliwia analizę cytokin i chemokin w egzosomach, dostarczając cennych informacji o patogenezie zakażenia.

Izolacja egzosomów z osocza osób zakażonych wirusem HIV-1

Przeglądaj więcej filmów