26 października 2016
Przygotowano rusztowanie do wstrzykiwań inżynierii tkankowej składające się z mikrocząsteczek poli(N-izopropylacrylamidu)-siarczanu chondroityny (PNIPAAm-g-CS)-zawierającego poli(N-izopropylacrylamid). W tym badaniu analizowana jest siła adhezji, właściwości pęcznienia i biokompatybilność in vitro. Opracowane tutaj techniki charakterystyki mogą mieć zastosowanie do innych systemów termożelowania.
Ogólnym celem tej metodologii jest ocena zarówno właściwości adhezyjnych, jak i biokompatybilności komórkowej proponowanego kompozytu hydrożelowego do inżynierii tkankowej krążka międzykręgowego jądra miażdżystego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, takie jak sposób projektowania i przygotowywania termicznie odwracalnych hydrożeli o właściwościach bioadhezyjnych do enkapsulacji komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że jesteśmy w stanie zademonstrować badania in vitro z wstrzykiwanym, wrażliwym termicznie kompozytem, aby ocenić jego zastosowanie jako potencjalnego zamiennika jądra miażdżystego.
W obecnym badaniu oceniamy nowatorskie rusztowanie hydrożelowe, wykonując zarówno testy mechaniczne rozciągania, jak i testy żywotności komórek. Testy biokompatybilności zademonstrują Emily Schmidt, Mark Dittmer, Edward Goldschmidt i Frantzeska Giginis, studenci z wydziałów Nauk Biologicznych i Biochemii. Przed syntezą hydrożelu bioadhezyjnego należy oczyścić monomer NIPAAm i mCS, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Następnie rozpuść 10 gramów oczyszczonego NIPAAm i 2,209 grama mCS w 232 mililitrach wody dejonizowanej. Oczyść roztwór z tlenu za pomocą obojętnego azotu gazowego. Utrzymuj energiczne, ale niskie natężenie przepływu gazu, aby zapobiec bulgotaniu roztworu przez 15 minut.
Kontynuuj przedmuchiwanie roztworu azotem gazowym i dodaj 0,976 mililitra TEMED. Następnie rozpocznij reakcję polimeryzacji, mieszając 97,6 miligramów nadsiarczanu amonu. Mieszaj roztwór przez około 20 sekund i szybko zamknij roztwór, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do naczynia.
Pozostawić roztwór do polimeryzacji w świetle fluorescencyjnym przez 24 godziny przed przetworzeniem próbki na drobny proszek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Stwórz mieszaninę oleju i wody, łącząc 100 mililitrów oleju rzepakowego, jeden mililitr TWEEN 20 i 20 mililitrów 2% alginianu. Emulgować mieszaninę przez 10 minut za pomocą homogenizatora przy 15 000 obr./min.
Dodatkowo wymieszaj z mieszadłem magnetycznym przy 200 obr./min, aby utworzyć duże mikrocząstki lub 2 000 obr./min, aby utworzyć małe mikrocząstki. Odessać 2% roztwór chlorku wapnia za pomocą strzykawki z końcówką igły o rozmiarze 18. Powoli dodawać kroplami chlorek wapnia do emulsji.
Po usieciowaniu mikrocząstek przez 10 minut, równomiernie rozprowadź partię mikrocząstek w zakręconych 50-mililitrowych stożkowych probówkach. Wirować w temperaturze 1 400 razy G przez dwie minuty, aby usunąć początkową warstwę oleju rzepakowego przed myciem i liofilizacją mikrocząstek, jak opisano w protokole tekstowym. Użyj powstałego liofilizowanego proszku polimerowego, aby stworzyć roztwór CS do szczepienia PNIPPAm o objętości 5%, najpierw rozpuszczając 50 miligramów proszku hydrożelowego w jednym mililitrze soli fizjologicznej buforowanej 1X fosforanem lub PBS.
Wymieszaj roztwór za pomocą wirownika, a następnie schładzaj w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny. Gdy utworzy się lepki roztwór, utwórz jednorodny kompozyt, dodając 25 lub 50 miligramów liofilizowanych mikrocząstek alginianu do roztworu hydrożelu i wirując. Przechowuj kompozyt w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania.
Przed wykonaniem prób rozciągania należy pobrać podłoże chrząstki z ucha świni, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przymocuj siłomierz do ramienia stanowiska testowego. Umieść płytę grzejną na górze stojaka siłowego i ustaw temperaturę na 50 stopni Celsjusza.
Następnie przymocuj kawałek chrząstki o wymiarach jeden centymetr na jeden centymetr do bloku ze stali nierdzewnej za pomocą kleju cyjanoakrylowego i pęsety. Przyklej dodatkowy kawałek chrząstki do cylindra Delrin i przymocuj cylinder do manometru. Bardzo ważne jest, aby obie powierzchnie chrząstki były zwrócone do siebie i stykały się z hydrożelem.
Umieść kąpiel wodną z pleksiglasu na płycie grzejnej i włóż blok ze stali nierdzewnej wraz z podłożem chrząstki do wanny. Opuść ramię stanowiska testowego i wyrównaj ze sobą oba podłoża chrząstek. Następnie podnieś ramię, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca na nałożenie hydrożelu.
Za pomocą pipety wyporowej dozować 200 mikrolitrów hydrożelu bioadhezyjnego na dolny kawałek chrząstki. Opuść ramię siły stój z prędkością jednego mililitra na minutę, aż hydrożel zetknie się z górnym kawałkiem chrząstki i wywrze siłę napięcia wstępnego 0,001 niutonów. Wlej roztwór soli fizjologicznej o temperaturze 37 stopni Celsjusza do kąpieli, aż objętość osiągnie wyznaczony poziom wody.
Sprawdź temperaturę roztworu za pomocą termopary. Po pozostawieniu hydrożelu na zastygnięcie przez łącznie pięć minut, podnieś ramię z prędkością dwóch milimetrów na minutę. Test jest zakończony, gdy bioadhezyjny oderwie się od podłoża chrząstki lub gdy nastąpi znaczny spadek siły, sygnalizujący awarię.
Zbierz zarejestrowane dane i podnieś ramię stanowiska testowego. Wyjmij butlę Delrin z manometru. Wlej roztwór soli fizjologicznej do poprzedniego pojemnika i podgrzej do 37 stopni Celsjusza.
Oblicz naprężenia, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przed wykonaniem testu na obecność żywych / martwych komórek z PNIPAAm przeszczep CS należy przygotować ludzką nerkę embrionalną lub komórki HEK 293, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Tworzenie monowarstw kontroli pozytywnej poprzez pipetowanie wielu objętości mieszaniny komórek o pojemności 300 mikrolitrów na 24-dołkową płytkę w celu wygenerowania od czterech do sześciu powtórzonych próbek.
Utrzymać to samo stężenie komórek, ponownie zawieszając komórki w około dwóch mililitrach przeszczepu PNIPAAm CS dla każdej próbki kontrpróby. Odpipetować mieszaninę komórek polimerowych w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej do uzyskania jednorodności. W przypadku wysiewu mikrocząstkami alginianu przenieść dwa mililitry zawiesiny komórek CS szczepionego PNIPAAm do 35-milimetrowej szalki hodowlanej i wprowadzić do mieszaniny 200 miligramów cząstek.
Pipetować mieszaninę komórek w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej, aż do uzyskania jednorodności. Następnie, za pomocą pipety serologicznej, dozuj wiele objętości mieszaniny komórek polimerowych o pojemności 300 mikrolitrów do każdej z studzienek w celu zabicia kontroli, PNIPAAm przeszczep CS i PNIPAAm przeszczep CS z mikrocząstkami alginianu, aby wygenerować od czterech do sześciu powtórzonych próbek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 do 15 minut i pozwolić, aby przeszczep PNIPAAm CS przeszedł z płynu do żelu.
Polimer tworzy nieprzezroczysty biały dysk. Umieść podgrzewacz do slajdów w masce i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza. Użyj podgrzewacza do szkiełka, aby utrzymać temperaturę płytki studzienki i odpipetuj 600 mikrolitrów wstępnie podgrzanego podłoża do każdej studzienki.
Aby dodatkowo zapobiec przejściu polimeru w stan ciekły, umieść lampę ze świetlówką nad naczyniem, aby ogrzać powietrze nad nim. Inkubuj komórki przez pięć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po upływie pięciu dni usunąć pożywkę z dołków monowarstwy, PNIPAAm szczepić CS i PNIPAAm szczepić CS mikrocząstkami alginianu.
Umyj wszystkie studzienki dokładnie, ale delikatnie, PBS, a następnie usuń PBS. Pozostawić krążki hydrożelu zawierające mikrocząstki alginianu do upłynnienia się w temperaturze pokojowej i dodać dwa mililitry 50-milimolowego cytrynianu sodu do każdej z studzienek. Usuń pożywkę z dołków zabitych komórek.
Pozwól krążkom hydrożelu upłynnić się w temperaturze pokojowej i dodaj 300 mikrolitrów 70% metanolu do każdego dołka przed inkubacją płytki przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usunąć roztwory cytrynianu sodu i metanolu ze studzienek i odpipetować każdą z zawiesin hydrożelu do oddzielnych probówek do mikrowirówek. Odwirować probówki o sile 2 000 razy G przez 10 minut, aby oddzielić komórki od zawiesiny hydrożelowej.
Ostrożnie usunąć zawiesinę, pipetując roztwór z rurki stożkowej i pozostawiając osad komórkowy. Ponownie zawiesić osad w 300 mikrolitrach PBS i przenieść na oryginalną płytkę studzienki. Następnie dodaj 300 mikrolitrów mieszanki barwników żywych / martwych do każdej z studzienek.
Owinąć płytkę studzienkową folią aluminiową i inkubować przez 45 minut na kołysku w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem wszystkich próbek pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym z obiektywem 10X. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki wytrzymałości na rozciąganie zarówno dla PNIPAAm szczepion CS, jak i PNIPAAm szczepion CS z różnymi preparatami mikrocząstek alginianu. Wytrzymałość na rozciąganie PNIPAAm szczepionego CS wzrosła czterokrotnie po dodaniu 50 lub 75 miligramów na mililitr mikrocząstek alginianu.
Zgodnie z oczekiwaniami, PNIPAAm przeszczep CS kurczy się i kurczy powyżej dolnej temperatury krytycznej roztworu. Wprowadzenie mikrocząsteczek do hydrożelu powoduje efekt pęcznienia w ciągu siedmiu dni w PBS. Komórki HEK 293 zamknięte zarówno w przeszczepie PNIPAAm CS, jak i przeszczepie PNIPAAm CS z mikrocząstkami alginianu wykazały aktywną fluorescencję komórkową przy użyciu barwnika Live/Dead po okresie pięciu dni.
Wyniki te można porównać z dołkami kontroli pozytywnej i ujemnej. Równolegle zastosowano test ilościowy w celu potwierdzenia obrazowania żywego/martwego, który nie wykazał istotnych różnic w żywotności komórek między przeszczepem PNIPAAm CS, przeszczepem PNIPAAm CS z mikrocząstkami alginianu a monowarstwą kontrolną. Stworzono kompozyt hydrożelowy składający się z wrażliwego termicznie poli(N-izopropylacrylamidu) szczepionego mikrocząstkami siarczanu chondroityny i alginianu do wymiany jądra miażdżystego.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że kompozyt jest wrażliwy na temperaturę i upłynnia się poniżej dolnej temperatury krytycznej roztworu. Po opanowaniu, testy mechaniczne rozciągania można wykonywać z łatwością, o ile ćwiczy się staranną precyzję. Badania pęcznienia ujawniają zdolność hydrożelu do zatrzymywania wody.
Testy te muszą jednak naśladować natywne środowisko in vivo. Żywotność komórkową wrażliwych termicznie żeli można potwierdzić i ocenić za pomocą kombinacji znakowania fluorescencyjnego i odczynników metabolicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób wrażliwe termicznie zastrzyki są stosowane w krążkach międzykręgowych, inżynierii tkankowej i jak kompozyty mogą poprawić niektóre właściwości materiału.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
To badanie przedstawia wstrzykiwalny szkielet inżynierii tkankowej wykonany z kompozytu mikrocząstek alginianu zawierającego poli(N-izopropyloakryloamidu)-przeszczepiony siarczan chondroityny (PNIPAAm-g-CS). Badania koncentrują się na ocenie siły adhezji, właściwości pęcznienia i biokompatybilności in vitro tego nowego żelu.
This work addresses a key challenge in tissue engineering: creating injectable scaffolds with sufficient adhesive strength to maintain position in load-bearing environments like the intervertebral disc. By combining thermogelling polymers with bioactive microparticles, the approach enhances mechanical integration and space-filling capacity, supporting minimally invasive delivery and long-term defect filling. The strategy improves predictive confidence in scaffold performance by enabling tunable adhesion and biocompatibility in a temperature-responsive system.
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling early-stage evaluation of injectable hydrogels for structural and biological performance in tissue engineering applications.