Monitorowanie optyczne znakowania żywych zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych skóry ucha myszy ex vivo

Ogólnym celem tego nowego protokołu eksperymentalnego jest wykazanie dostępności mieszków włosowych w uchu myszy w celu zbadania funkcji w pełni zróżnicowanych mechanosensorycznych zakończeń nerwowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii mechanosensorycznej, takie jak rola pęcherzyków synaptycznych w odczuciach mechanicznych. Dwie główne zalety tej techniki to to, że jest szybka i zapewnia łatwy dostęp optyczny do niezliczonych, żywych, w pełni zróżnicowanych mechanosensorycznych zakończeń nerwowych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mogą mieć trudności z oddzieleniem skóry i odpowiednim oczyszczeniem chrząstki bez uszkadzania mieszków włosowych. Oprócz pokazania podstawowej techniki, pokażemy tutaj również przykład eksperymentu, w którym przyjrzymy się zależności od wapnia istotnej części funkcji zakończenia nerwowego. Napełnij 50-milimetrowe naczynie wyłożone silikonem roztworem Lileya lub inną fizjologiczną solą fizjologiczną.

Odświeżaj roztwór co 15 minut lub stosuj stałą perfuzję. Po odcięciu głowy młodej dorosłej myszy, za pomocą nożyczek, usuń zewnętrzne uszy w pobliżu podstawy, tuż nad gęstą linią włosów, i przenieś małżowiny uszne w naczyniu. Teraz przypnij ucho wklęsłą stroną do dołu, wzdłuż brzegów, używając cienkich szpilek do owadów.

Następnie ostrożnie złuszcz odsłoniętą tylną część skóry za pomocą rozwarstwienia. Za pomocą kleszczy numer 3 chwyć środkową tylną część skóry, a drugą parą kleszczy przebij szczelinę między skórą a chrząstką u podstawy ucha. Delikatnie przesuwaj kleszcze z boku na bok w szczelinie, stopniowo oddzielając przednią i tylną warstwę skóry.

Systematycznie przesuwaj się przez chrząstkę środkową do cienkich brzegów wolnych od chrząstki. To będzie wymagało praktyki. Po usunięciu tylnej części skóry przypnij ją skórą do góry, obok przedniej części skóry.

Po usunięciu chrząstki z obu preparatów skórnych należy usunąć warstwę spienionej chrząstki włóknisto-elastycznej, która pokrywa podstawę mieszków włosowych. Delikatnie obierz, zerwij i zetrzyj tę chusteczkę. To również będzie wymagało praktyki, aby to opanować.

Usunięcie zbyt małej ilości przeszkadza barwnikowi i jego wizualizacji, natomiast usunięcie zbyt dużej ilości uszkadza zakończenia nerwowe. Użycie młodej myszy minimalizuje zrost między przednią i tylną warstwą skóry oraz trudność w usunięciu leżącej pod spodem chrząstki. Oba te czynniki zwiększą prawdopodobieństwo udanego barwienia.

Każdy preparat skórny może być przecięty na pół od wierzchołka do podstawy, aby zmaksymalizować liczbę replikantów i zminimalizować wykorzystanie zwierząt. W tej sekcji opisano, jak barwieć tkanki FM1-43, ale powinien on działać z większością innych barwników styrylowo-pirydyniowych tej klasy z odpowiednim dostosowaniem do stężeń. Wykonaj tę procedurę przy minimalnym poziomie oświetlenia otoczenia.

Przed rozpoczęciem przygotuj wystarczającą ilość świeżej 10 mikromolowej FM1-43 w odpowiednio gazowanej soli fizjologicznej na 3 mililitry na preparat. Umieść każdy preparat w osobnym 35-milimetrowym naczyniu wyłożonym silikonem, z 2 mililitrami odpowiedniej soli fizjologicznej. Aby porównać zdolność wapnia i baru do podtrzymywania wchłaniania barwnika, od tego momentu inkubuj w oddzielnych naczyniach.

Umieść niektóre w normalnym 2-milimolowym wapniu Lileya, a inne w Liley's, gdzie bar zastępuje wapń. Następnie umieść otwarte naczynia na lekko zanurzonej platformie w łaźni wodnej o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Głębokość wody powinna być wystarczająca, aby ogrzać chusteczki bez rozlewania się do naczynia.

Do każdego naczynia przypnij cienką rurkę gazową do silikonowej podstawy, aby naparować preparaty z prędkością około 10 pęcherzyków na sekundę. Podgrzej również roztwory FM1-43 i 100 mililitrów bezbarwnikowej soli fizjologicznej w szczelnie zakorkowanych butelkach. Pozwól, aby wszystko wyrównało się do 30 stopni Celsjusza, a po 30 minutach zastąp bezbarwną sól fizjologiczną na tkance odpowiednim podgrzanym roztworem.

Inkubować przez kolejne 30 minut. Po inkubacji należy wylać bezbarwną sól fizjologiczną i szybko i ostrożnie zeskrobać płyn pozostały wokół preparatu. Uważaj, aby nie dotykać odsłoniętych powierzchni skóry.

Z powrotem preparaty należy umieścić w łaźni wodnej, utrzymując przewody gazowania na miejscu przez cały czas. Teraz dodaj 2 do 3 mililitrów ciepłego roztworu barwnika zawierającego wapń lub bar. Po 40 minutach przywróć tkanki do temperatury pokojowej na pozostałą część zabiegu, aby zahamować ponowne uwalnianie zinternalizowanego barwnika.

Teraz usuń niezinternalizowany barwnik w trzech etapach: Najpierw odlej roztwór do etykietowania i szybko spłucz tkanki trzykrotnie solą fizjologiczną w temperaturze pokojowej w krótkich odstępach czasu, a następnie pozwól im inkubować przez 30 minut, aby oddzielić większość pozostałego barwnika od błon powierzchniowych. Na koniec usunąć uporczywy barwnik przyklejony do zewnętrznej ulotki odsłoniętych błon poprzez chelatowanie preparatu sulfonowaną pochodną b-cyklodekstryny, uzupełnioną odpowiednio w roztworze soli fizjologicznej wapnia lub baru. W ten sposób cały pozostały barwnik znajdzie się w tkankach.

Po chelatowaniu należy wrzucić preparaty z powrotem do odpowiedniej, świeżej, bezbarwnej soli fizjologicznej i dokładnie osuszyć naczynia z zewnątrz bibułą. Następnie wyobraź je sobie tak szybko, jak to możliwe. Kontynuuj pracę przy minimalnym oświetleniu otoczenia.

Przed obrazowaniem, za pomocą mikroskopu stereoskopowego, usuń zanieczyszczenia powierzchniowe, które uległyby autofluorescencji i zanieczyszczeniu obrazów. Następnie umieść naczynie pod pionowym mikroskopem epifluorescencyjnym ze standardowym zestawem filtrów fluoresceinowych. Następnie należy osłabić natężenie światła wzbudzającego za pomocą filtrów o neutralnej gęstości, aż preparat zostanie oświetlony na tyle, aby wygodnie zlokalizować zakończenia nerwowe.

Pełne oświetlenie dość szybko zabije zakończenia nerwowe. Po zlokalizowaniu zrób zdjęcia oznaczonych końcówek lancetowatych za pomocą 10-krotnego suchego obiektywu lub 20-krotnego zanurzenia w wodzie. Zminimalizuj natężenie światła i czas ekspozycji, korzystając z czasu integracji z kamerą od 1/2 do 1 sekundy.

Dla każdego preparatu należy naobrazić około 20 lancetowatych zakończeń, zaczynając od brzegu najbardziej oddalonego od krawędzi cięcia podstawy skóry małżowiny usznej i pracując wzdłuż tego brzegu, obrazując kolejno każdy pęcherzyk. Pracuj w lekko zachodzących na siebie polach równoległych do krawędzi cięcia bez dwukrotnego obrazowania tego samego mieszków włosowych lub obrazowania ewidentnie uszkodzonych mieszków włosowych. Po wykonaniu paska brzeżnego przesuń jedną szerokość pola w kierunku podstawy małżowiny usznej i powtórz proces w odwrotnym kierunku.

Analiza jest opisana w protokole tekstowym. Po zobrazowaniu pierwszego naczynia, pokazującego mieszki włosowe znakowane solą fizjologiczną zawierającą wapń, zobrazuj mieszki włosowe w soli fizjologicznej zawierającej bar. Kontynuuj w ten sposób.

Upewnij się, że obrazowanie pozostałych tkanek kontrolnych i eksperymentalnych jest dopasowane w czasie, ponieważ po znakowaniu barwnik zostanie następnie ponownie uwolniony przez ramię egzocytozy konstytutywnego recyklingu SLV. W typowym preparacie małżowiny usznej mieszki włosowe są łatwo widoczne pod wpływem transoświetlenia bez fluorescencji, co ilustruje cienką naturę preparatu i względną łatwość dostępu, jaką zapewnia tym mechanosensorycznym zakończeniom. W przypadku epifluorescencji znakowane lancetowate zakończenia otaczające każdy mieszek włosowy są wyraźnie widoczne i wykazują typowy silny spontaniczny wychwyt FM1-43.

Wzór punktowy odzwierciedla zakończenia obserwowane w płaszczyźnie optycznej prostopadłej do skóry, wzdłuż długości zakończenia. Jednym z wielu zastosowań tej metody jest badanie kinetyki egzocytozy. Zgodnie z oczekiwaniami, jeśli wchłanianie barwnika jest spowodowane recyklingiem pęcherzyków, w górnych panelach widoczny jest oznakowany terminal, który spontanicznie odbarwia się.

Po zastosowaniu silnego stymulanta egzocytozy, alfa-latrotoksyny, naturalny proces odbarwiania ulega przyspieszeniu, co widać w dwóch dolnych panelach. Innym zastosowaniem, jak zaobserwowano na filmie, jest zbadanie zależności endocytozy od wapnia. Wyraźny wychwyt barwnika zaobserwowano w przypadku końcówek lancetowatych zarówno w soli fizjologicznej zawierającej wapń, jak i bar.

Po ilościowym określeniu intensywności fluorescencji końcówki widocznej na etykietowaniu podczas filmu, nie stwierdzono znaczącej różnicy w wychwytywaniu barwnika. Oznacza to, że endocytoza jest równie dobrze wspierana przez bar i wapń. Dalsze powtórzenia procedury na innych preparatach do uszu przetestują ten wniosek.

Po opanowaniu cały protokół i obrazowanie można ukończyć w ciągu dwóch i pół godziny. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby używać małych myszy, szybko przeprowadzić sekcję i być maksymalnie przystosowanym do ciemności, aby zminimalizować wymagane natężenie światła. Pomysł na tę metodę zaczerpnęliśmy z metody pierwotnie opracowanej przez bliskiego współpracownika i obecnie emerytowanego profesora, Clarke'a Slatera, i jego magistranta Michaela Caine'a.

Kiedy powiedzieliśmy im o możliwej roli pęcherzyków synaptycznych w mechanosensacji wrzeciona mięśniowego, ale o potrzebie lepszego sposobu wizualizacji niż w przypadku FM1-43. Procedura ta może być również stosowana w połączeniu z innymi metodami, takimi jak farmakologia i elektrofizjologia. Następnie możemy zbadać, w jaki sposób regulowany jest recykling pęcherzyków synaptycznych i jak odnosi się to do reakcji zakończeń mechanosensorycznych.