Ocena pierwotnej neurogenezy w zarodkach Xenopus za pomocą barwienia immunologicznego

Ogólnym celem tego eksperymentu jest umożliwienie szybkiej i wygodnej wizualizacji różnych populacji komórek nerwowych w rozwijającym się mózgu embrionalnym xenopus. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie pierwotnej neurogenezy, takie jak obserwacja procesu regulacji różnicowania neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym ksenopus. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia jednoczesną obserwację puli progenitorów nerwowych komórek macierzystych, a także zróżnicowanej pierwotnej puli neuronalnej w ramach jednego eksperymentu.

Aby rozpocząć tę procedurę, ostrożnie odessać od pięciu do dziesięciu zarodków ze szklanej fiolki za pomocą plastikowej lub szklanej pipety bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Przenieś zarodki do komory montażowej i obserwuj pod stereoskopem. Napełnij komorę montażową roztworem żelatyny, aby zapewnić sztywność bloku sekcji.

Następnie ułóż zarodki obok siebie za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Zaznacz orientację głowy, rysując strzałkę na krawędzi komory za pomocą markera kompatybilnego z kriogeniką. W przypadku wielu grup zarodków należy zapisać opis każdej grupy na brzegu odpowiedniej komory.

Następnie ostrożnie umieść komorę poziomo w piankowym pudełku wypełnionym do połowy suchym lodem. Zamknij pokrywę i pozwól komorze montażowej zamarznąć pojedynczo przez pięć do dziesięciu minut. Następnie przystąp do kriosekcji lub przechowuj zamrożone próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej jeden do dwóch tygodni bez utraty immunogenności.

W tej procedurze należy wyjąć zamrożony blok próbki z komory, naciskając dno komory patyczkiem lub palcem. Następnie dodaj kilka kropli pożywki do zamrażania tkanek na dysk do przechowywania próbki. Zamontuj blok próbki przednim końcem zarodków skierowanym do góry i pozwól zamontowanemu blokowi stać w komorze kriostatu przez około jedną minutę lub do momentu, gdy podłoże do zamrażania tkanek stanie się nieprzezroczyste.

Natychmiast zainstalować dysk do przytrzymania próbki na mikrotomie dolną stroną bloku próbki skierowaną do góry. Odetnij część bloku próbki za pomocą ostrza, gdy blok próbki jest jeszcze stosunkowo miękki. Następnie pozostawić krążek z próbką na mikrotomie na co najmniej pięć minut, aby jego temperatura osiągnęła równowagę.

Następnie stopniowo przycinaj blok próbki w dół, aż główki kijanek będą widoczne przez półprzezroczystą żelatynę. Aby zwiększyć prędkość przycinania, zwiększ grubość sekcji. Monitoruj wydajność kriostatu, taką jak ostrość i kąt ostrza, aby upewnić się, że kolejne sekcje są generowane w długim pasku.

Gdy główki kijanek staną się widoczne, dostosuj ustawienia kriostatu z powrotem do normalnych, aby upewnić się, że gotowe plastry mogą tworzyć paski i nie zachodzą na siebie ani nie przyklejają się do ostrza. Następnie kontynuuj przycinanie, aż główki kijanek będą prawie odsłonięte. Zetrzyj wszelkie resztki sekcji na stole przed rozpoczęciem zbierania skrawków próbki.

Zrób około 10 do 15 sekcji i pozwól im uformować długi pasek. Odwróć grubą szklaną płytkę pokrywową na bok i delikatnie zdejmij pasek z ostrza za pomocą pędzla z cienką końcówką. Następnie ułóż go na scenie tak, aby długa oś była równoległa do ostrza.

Zrób od 10 do 15 sekcji i pozwól im uformować długi pasek bez łamania. Może to nie być łatwe i wymaga praktyki. Jedną ze sztuczek jest staranie się nie stosować zbyt dużej prędkości na kole ręcznym.

Zamiast tego obracaj pokrętłem ostrożnie i powoli. Następnie wybierz jeden dodatnio naładowany szkiełko w temperaturze pokojowej i oznacz go ołówkiem. Następnie szybko i mocno dociśnij go do paska opisaną stroną skierowaną w dół.

Następnie wyjmij szkiełko z komory kriostatu. Powtórz ten krok, aby ułożyć od 20 do 30 plasterków równolegle na każdym slajdzie. Wysuszyć boki na powietrzu przez 10 minut, a następnie natychmiast przejść do procedury barwienia immunologicznego lub przechowywać szkiełka w pudełku na szkiełka w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez okres do trzech do sześciu miesięcy przed zabiegiem barwienia immunologicznego.

Tutaj możemy zobaczyć odpowiednie płaszczyzny przekroju przodomózgowia, śródmózgowia, tyłomózgowia i rdzenia kręgowego kijanki xenopus, które zostaną wykorzystane do zapewnienia odniesień pozycyjnych dla poniższych obrazów. Odpowiednie przekroje, które zostały wybarwione Anti-Sox 3, Anti-Acetylated Tubulin i DAPI, pokazują względne lokalizacje pul nerwowych komórek macierzystych, a także neurofilamentów w cewie nerwowej. A oto odpowiednie przekroje wybarwione anty-MyT1 i DAPI, które pokazują względne lokalizacje zróżnicowanych neuronów pierwotnych w cewie nerwowej.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zapewnieniu wystarczającego czasu chłodzenia bloku próbki w suchym lodzie. W przeciwnym razie blok próbki może nie być wystarczająco twardy, a tym samym trudny do cięcia.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neuronauką rozwojową do zbadania różnicowania neuronalnego w ośrodkowym układzie nerwowym ksenopus. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć sekcje i obserwować określone pule komórek nerwowych w ośrodkowym układzie nerwowym ksenopusa.