Ocena pierwotnej neurogenezy w zarodkach Xenopus za pomocą barwienia immunologicznego
12 kwietnia 2016
Ten artykuł przedstawia wygodną i szybką metodę wizualizacji różnych populacji komórek nerwowych w ośrodkowym układzie nerwowym zarodków Xenopus za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na skrawkach.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest umożliwienie szybkiej i wygodnej wizualizacji różnych populacji komórek nerwowych w rozwijającym się mózgu embrionalnym xenopus. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie pierwotnej neurogenezy, takie jak obserwacja procesu regulacji różnicowania neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym ksenopus. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia jednoczesną obserwację puli progenitorów nerwowych komórek macierzystych, a także zróżnicowanej pierwotnej puli neuronalnej w ramach jednego eksperymentu.
Aby rozpocząć tę procedurę, ostrożnie odessać od pięciu do dziesięciu zarodków ze szklanej fiolki za pomocą plastikowej lub szklanej pipety bez wprowadzania pęcherzyków powietrza. Przenieś zarodki do komory montażowej i obserwuj pod stereoskopem. Napełnij komorę montażową roztworem żelatyny, aby zapewnić sztywność bloku sekcji.
Następnie ułóż zarodki obok siebie za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Zaznacz orientację głowy, rysując strzałkę na krawędzi komory za pomocą markera kompatybilnego z kriogeniką. W przypadku wielu grup zarodków należy zapisać opis każdej grupy na brzegu odpowiedniej komory.
Następnie ostrożnie umieść komorę poziomo w piankowym pudełku wypełnionym do połowy suchym lodem. Zamknij pokrywę i pozwól komorze montażowej zamarznąć pojedynczo przez pięć do dziesięciu minut. Następnie przystąp do kriosekcji lub przechowuj zamrożone próbki w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez co najmniej jeden do dwóch tygodni bez utraty immunogenności.
W tej procedurze należy wyjąć zamrożony blok próbki z komory, naciskając dno komory patyczkiem lub palcem. Następnie dodaj kilka kropli pożywki do zamrażania tkanek na dysk do przechowywania próbki. Zamontuj blok próbki przednim końcem zarodków skierowanym do góry i pozwól zamontowanemu blokowi stać w komorze kriostatu przez około jedną minutę lub do momentu, gdy podłoże do zamrażania tkanek stanie się nieprzezroczyste.
Natychmiast zainstalować dysk do przytrzymania próbki na mikrotomie dolną stroną bloku próbki skierowaną do góry. Odetnij część bloku próbki za pomocą ostrza, gdy blok próbki jest jeszcze stosunkowo miękki. Następnie pozostawić krążek z próbką na mikrotomie na co najmniej pięć minut, aby jego temperatura osiągnęła równowagę.
Następnie stopniowo przycinaj blok próbki w dół, aż główki kijanek będą widoczne przez półprzezroczystą żelatynę. Aby zwiększyć prędkość przycinania, zwiększ grubość sekcji. Monitoruj wydajność kriostatu, taką jak ostrość i kąt ostrza, aby upewnić się, że kolejne sekcje są generowane w długim pasku.
Gdy główki kijanek staną się widoczne, dostosuj ustawienia kriostatu z powrotem do normalnych, aby upewnić się, że gotowe plastry mogą tworzyć paski i nie zachodzą na siebie ani nie przyklejają się do ostrza. Następnie kontynuuj przycinanie, aż główki kijanek będą prawie odsłonięte. Zetrzyj wszelkie resztki sekcji na stole przed rozpoczęciem zbierania skrawków próbki.
Zrób około 10 do 15 sekcji i pozwól im uformować długi pasek. Odwróć grubą szklaną płytkę pokrywową na bok i delikatnie zdejmij pasek z ostrza za pomocą pędzla z cienką końcówką. Następnie ułóż go na scenie tak, aby długa oś była równoległa do ostrza.
Zrób od 10 do 15 sekcji i pozwól im uformować długi pasek bez łamania. Może to nie być łatwe i wymaga praktyki. Jedną ze sztuczek jest staranie się nie stosować zbyt dużej prędkości na kole ręcznym.
Zamiast tego obracaj pokrętłem ostrożnie i powoli. Następnie wybierz jeden dodatnio naładowany szkiełko w temperaturze pokojowej i oznacz go ołówkiem. Następnie szybko i mocno dociśnij go do paska opisaną stroną skierowaną w dół.
Następnie wyjmij szkiełko z komory kriostatu. Powtórz ten krok, aby ułożyć od 20 do 30 plasterków równolegle na każdym slajdzie. Wysuszyć boki na powietrzu przez 10 minut, a następnie natychmiast przejść do procedury barwienia immunologicznego lub przechowywać szkiełka w pudełku na szkiełka w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez okres do trzech do sześciu miesięcy przed zabiegiem barwienia immunologicznego.
Tutaj możemy zobaczyć odpowiednie płaszczyzny przekroju przodomózgowia, śródmózgowia, tyłomózgowia i rdzenia kręgowego kijanki xenopus, które zostaną wykorzystane do zapewnienia odniesień pozycyjnych dla poniższych obrazów. Odpowiednie przekroje, które zostały wybarwione Anti-Sox 3, Anti-Acetylated Tubulin i DAPI, pokazują względne lokalizacje pul nerwowych komórek macierzystych, a także neurofilamentów w cewie nerwowej. A oto odpowiednie przekroje wybarwione anty-MyT1 i DAPI, które pokazują względne lokalizacje zróżnicowanych neuronów pierwotnych w cewie nerwowej.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zapewnieniu wystarczającego czasu chłodzenia bloku próbki w suchym lodzie. W przeciwnym razie blok próbki może nie być wystarczająco twardy, a tym samym trudny do cięcia.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neuronauką rozwojową do zbadania różnicowania neuronalnego w ośrodkowym układzie nerwowym ksenopus. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć sekcje i obserwować określone pule komórek nerwowych w ośrodkowym układzie nerwowym ksenopusa.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szybką metodę wizualizacji różnych populacji komórek neuronalnych w ośrodkowym układzie nerwowym embrionów Xenopus z wykorzystaniem barwienia immunofluorescencyjnego. Technika ta ułatwia obserwację procesów różnicowania neuronalnego w ramach jednego eksperymentu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Techniki immunofluorescencji
Wstęp
- Zrozumienie różnicowania neuronalnego jest kluczowe w neuronauce rozwojowej.
- Zarodki Xenopus służą jako model do badania neurogenezy.
- Barwienie immunofluorescencyjne umożliwia wizualizację specyficznych populacji neuronów.
- Metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji neuralnych komórek macierzystych.
Cel badania
- Opracowanie techniki jednoczesnej obserwacji progenitorów neuronalnych komórek macierzystych oraz zróżnicowanych neuronów.
- Ułatwienie badania pierwotnej neurogenezy w embrionach Xenopus.
- Zapewnienie wiarygodnej metody wizualizacji populacji neuronalnych w ośrodkowym układzie nerwowym.
Zastosowane metody
- Aspiracja embrionów i przygotowanie ich do kriotomii.
- Wykorzystanie kriotomu do uzyskania cienkich przekrojów embrionów.
- Barwienie przekrojów swoistymi przeciwciałami w celu wizualizacji populacji neuronów.
- Obserwacja zabarwionych przekrojów pod mikroskopem w celu analizy wyników.
Główne wyniki
- Pomyślna wizualizacja pul neuronalnych komórek macierzystych oraz zróżnicowanych neuronów.
- Identyfikacja specyficznych populacji neuronalnych w przedmózgowiu, śródmózgowiu, rombencefalu i rdzeniu kręgowym.
- Wykazanie efektywności techniki, pozwalającej na jej ukończenie w około dwóch godzinach.
- Walidacja metody na potrzeby przyszłych badań w dziedzinie neuronauki rozwojowej.
Wnioski
- Technika ta zwiększa możliwości badania różnicowania neuronalnego u Xenopus.
- Stanowi ona cenne narzędzie dla badaczy z zakresu neuronauki rozwojowej.
- Przyszłe zastosowania mogą przynieść głębszy wgląd w neurogenezę i procesy z nią związane.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia jednoczesną wizualizację progenitorów neuralnych komórek macierzystych oraz zróżnicowanych neuronów pierwotnych w embrionach Xenopus, co wspomaga ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej walidacji punktów uchwytu. Dzięki dostarczeniu ilościowych odczytów przestrzennych różnicowania neuronalnego, zwiększa ona pewność prognostyczną w badaniu szlaków sygnalizacyjnych i funkcjonalnej ocenie punktów uchwytu. Podejście to oferuje system relewantny dla procesów chorobowych, pozwalający na ocenę mechanizmów neurogennych z zachowaniem ciągłości translacyjnej w modelach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez wizualizację pul komórek macierzystych neuronów oraz zróżnicowanych neuronów w ramach jednego eksperymentu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki bezpośredniej obserwacji dynamiki różnicowania neuronalnego.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wyboru celu terapeutycznego poprzez powiązanie zaburzeń molekularnych z obserwowalnymi zmianami w populacjach neurogennych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na otrzymanie standaryzowanych, powtarzalnych przekrojów odpowiednich do obrazowania wysokotreściowego (high-content imaging) i analizy ilościowej.
- Skalowalność: Umożliwia przygotowanie 20-30 równoległych przekrojów na jednym szkiełku do multipleksowego przesiewania przeciwciał.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Umożliwia długoterminowe przechowywanie szkiełek w temperaturze -80°C do sześciu miesięcy, co wspiera przetwarzanie wsadowe i porównania międzyeksperymentalne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Zapewnia kręgowy system modelowy do badania konserwowanych mechanizmów pierwotnej neurogenezy, które mają zastosowanie w ludzkich zaburzeniach neurorozwojowych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy obserwacje z etapu odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając spójny odczyt fenotypowy w różnych stadiach rozwojowych.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Ułatwia oceny typu go/no-go poprzez kwantyfikację zmian w populacjach progenitorów w porównaniu do zróżnicowanych komponentów neuronalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając przestrzennie rozdzielczych, ilościowych danych na temat różnicowania neuronalnego, co wspomaga etapy walidacji celu i identyfikacji związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych, umożliwiając bezpośrednią wizualizację nisz neurogennych i wyników różnicowania.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy skrawki o ustandaryzowanej grubości i orientacji, co zapewnia niezawodne barwienie immunocytochemiczne i obrazowanie.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty poprzez pomiar intensywności fluorescencji i wskaźniki ko-lokalizacji (np. populacje Sox3+/AcTub+ w porównaniu do MyT1+), aby porównać warunki eksperymentalne.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez konserwowane mechanizmy neurogenne w modelach kręgowców, wspierając dopasowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę histologiczną do iteracyjnego badania celów w wielu projektach i punktach czasowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez bezpośrednie powiązanie zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych ze zmianami w populacjach komórek macierzystych i zróżnicowanych neuronów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację dzięki protokołom kriosekcjonowania i warunkom przechowywania preparatów, które zachowują antygenowość przez wiele miesięcy.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając multipleksową ocenę celów w ramach jednego procesu histologicznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczenie obiektywnych kryteriów wizualnych dla aktywności neurogennej w procesie przejścia od hitu do lidera (hit-to-lead).
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z zarodkami, kriosekcjonowaniu oraz w technikach immunofluorescencji.
- Zależne od infrastruktury obejmującej kriostat, mikrotom i mikroskopię fluorescencyjną.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji orientacji cięcia i protokołów barwienia w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji parametrów zatapiania i sekcjonowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują kruchość tkanek podczas sekcjonowania oraz konieczność precyzyjnej kontroli temperatury w celu zachowania integralności próbek.
